Name: induction of ocular surface inflammation and collection of involved tissues
Uploaded: 2022-08-04T13:10:00
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이 연구는 독일 연구 재단 (DFG) 2886 PANDORA 프로젝트 No.B3의 일부 지원을 받았습니다. 샤 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181 (C03); TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 프로젝트 861878 및 폭스바겐-재단(보조금 97744)에서 MH로.

동물과 관련된 모든 절차는 동물 복지에 관한 제도적 지침에 따라 수행되었으며 프리드리히-알렉산더-대학교 에를랑겐-뉘른베르크(FAU)의 동물 복지 위원회의 승인을 받았습니다(허가 번호: 55.2.2-2532-2-1217). 암컷 C57Bl/6 마우스, 7-9주령을 본 연구에 사용하였다. 마우스는 상업적 출처 ( 재료 표 참조)에서 얻었으며 12 시간 주야간 주기로 특정 병원체가없는 상태로 유지되었습니다.
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<ol>
	<li>Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tear+film+and+ocular+surface+changes+after+closure+of+the+meibomian+gland+orifices+in+the+rabbit.">Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit.</a> Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).</li><li>Mishima, S., Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oily+layer+of+the+tear+film+and+evaporation+from+the+corneal+surface.">The oily layer of the tear film and evaporation from the corneal surface.</a> Experimental Eye Research. 1, 39-45 (1961).</li><li>Gipson, I. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+induced+age+dependent+meibomian+gland+dysfunction+in+Cu,+Zn-superoxide+dismutase-1+(Sod1)+knockout+mice.">Oxidative stress induced age dependent meibomian gland dysfunction in Cu, Zn-superoxide dismutase-1 (Sod1) knockout mice.</a> PloS One. 9 (7), 99328 (2014).</li><li>McMahon, A., Lu, H., Butovich, I. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-23+drives+a+pathogenic+T+cell+population+that+induces+autoimmune+inflammation.">IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (2), 233-240 (2005).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-IL-23+therapy+inhibits+multiple+inflammatory+pathways+and+ameliorates+autoimmune+encephalomyelitis.">Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1317-1326 (2006).</li></ol>

Meibomian 땀샘의 기름진 분비는 건강한 눈22에 매우 중요합니다. 그러나, 양쪽 눈꺼풀의 족근판에 위치한 평행 가닥으로서 정렬된 응집된 호중구 세포외 트랩(aggNET)에 의한 이들 피지선의 막힘은 눈물막(23)을 파괴할 수 있다. 이러한 파괴는 마이보미안 샘 기능 장애(MGD)1 를 초래하고 눈물 증발을 가속화하고 안구 표면의 손상을...

눈 깜짝 할 사이에 각막 위에 흩어져있는 부드러운 눈물 막이 보충됩니다. 안구 표면 상피는 안구 표면에서 눈물 막의 분포와 올바른 방향을 촉진합니다. 뮤신은 각막과 결막 상피 세포에 의해 제공되어 눈물샘에서 나오는 눈물막의 수성 부분을 눈 표면에 위치시키는 데 도움이 됩니다. 마지막으로, MG는 눈물막 1,2,3의 수성 부분의 증발을 방지하는 피복층을 생성하는 지질을 분비합니다. 이러한 방식으로 모든 안구 기관의 조정 된 기능은 침입 병원균이나 부상으로부터 안구 표면을 보호하고 통증이나 불편 함없이 맑은 시력을 지원합니다.
건강한 안구 표면에서 안구 흐르는 분비물 또는 눈 류움은 먼지, 죽은 상피 세포, 박테리아, 점액 및 면역 세포를 쓸어냅니다. 응집된 호중구 세포외 트랩(aggNET)은 세포외 염색질로 구성된 메쉬 모양의 매트릭스를 공식화하고 이러한 구성 요소를 눈 류움에 통합합니다. AggNET은 전염증성 사이토카인 및 케모카인의 단백질 분해 분해에 의해 염증을 해결합니다4. 그러나 기능 장애가 발생하면 이러한 비정상적인 aggNET은 COVID-195, 담석6 및 규석결석 7의 혈관 폐색과 같은 질병의 발병 기전을 유발합니다. 유사하게, 안구 표면의 aggNET은 보호 역할을하며 고도로 노출 된 표면의 염증을 해결하는 데 기여합니다8. 안구 표면에 과장된 형성 또는 aggNET이 부족하면 눈물막 안정성이 손상되거나 각막 상처, 결막염 및 안구 건조증을 유발할 수 있습니다. 예를 들어, MG의 폐색은 안구 건조증의 주요 원인입니다9. AggNET은 또한 MG의 덕트에서 지질 분비의 흐름을 막고 마이봄샘 기능 장애(MGD)를 유발하는 것으로 알려져 있습니다. aggNET에 의한 MG 오리피스의 혼잡은 안구 표면을 감싸는 지방액의 부족과 역행 병액 체액을 유발하여 샘 기능의 기능 장애 및 acinar 손상을 초래합니다. 이 기능 장애는 눈물막 증발, 눈꺼풀 가장자리의 섬유증, 눈 염증 및 MG10,11에 대한 해로운 손상을 초래할 수 있습니다.
인간에서 MGD의 병리학 적 과정을 모방하기 위해 수년에 걸쳐 여러 동물 모델이 개발되었습니다. 예를 들어, 1 세의 C57BL / 6 마우스는 50 세 이상 환자의 안구 질환 병리를 반영하여 안구 건조증 (DED) 및 MGD에 대한 연령 관련 효과를 연구하는 데 도움이되었습니다12,13,14. 또한, 토끼는 약리학 적 개입의 효과를 조사하기위한 적절한 모델이다. 따라서 토끼에서 MGD를 유도하는 것은 에피네프린의 국소 투여 또는 13-시스-레티노산(isotretinoin)15,16,17,18,19의 전신 도입에 의해 보고되었습니다.
이러한 동물 모델은 MGD의 병태생리학에 기여하는 다양한 요인을 결정하는 데 적합했지만 활용이 제한적이었습니다. 예를 들어, 연령 관련 MGD의 쥐 모델은 노인의 요소를 해독하는 데 이상적이었고, 따라서 토끼는 여러 병리 생리 학적 메커니즘을 조사 할 수 있기 때문에 안구 표면 질환을 연구하는 데 가장 적합한 동물 모델 인 것으로 나타났습니다. 그러나 안구 표면에서 단백질을 검출하기위한 포괄적 인 분석 도구가 부족하고 토끼 게놈의 많은 부분에 주석이 없기 때문에 조사20,21로 제한됩니다.
또한, 안구건조증의 발병기전을 조사하기 위해 사용된 이들 동물 모델은 안구 표면의 염증을 유발하는 장애의 면역학적 팔을 분석하기 위한 적절한 세부사항을 제공하지 않았다. 따라서, Reyes 등에 의해 개발된 MGD의 뮤린 모델은 마우스의 알레르기성 안구 질환과 인간의 MGD 사이의 연관성을 보여주었고, 폐쇄성 MGD21의 원인이 되는 면역 병인을 강조하였다. 이 모델은 알레르기 성 안 질환을 결막과 눈꺼풀에 호중구를 모집하여 MGD 및 만성 안구 염증21을 유발하는 TH17 반응과 연관시킵니다. 이 뮤린 모델에서 MGD 및 안구 염증의 유도는 진행중인 면역 반응21에 의해 구동되는 국소 염증의 발달 동안 상류 사건을 조사하는 데 유용한 도구입니다. 현재 프로토콜은 폐쇄성 MGD를 동반하는 안구 표면 염증을 설명합니다. 이 방법에서, 마우스는 면역화되고, 2 주 후, 7 일 동안 면역원으로 안구 표면에 도전된다. 또한 급성 염증 및 각막, 결막 및 눈꺼풀 박리 동안 안구 삼출물 및 관련 안구 기관을 분리하는 단계가 설명됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium Hydroxide</td>
			<td>Imject alum Adjuvant</td>
			<td>77161</td>
			<td>40 mg/ mL 
			Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6 mice, aged 7&#8211;9 weeks</td>
			<td>Charles River Laboratories&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium</td>
			<td>Carl roth</td>
			<td>CN93.1</td>
			<td>1 M 
			Final Concentration: 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>FST by Dumont SWITZERLAND</td>
			<td>5/45 11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sharp scissor</td>
			<td>FST Stainless steel, Germany</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar safety cabinet</td>
			<td>Herasafe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophotography Camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EOS6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophotography Camera (without IR filter)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mnase</td>
			<td>New England biolabs</td>
			<td>M0247S</td>
			<td>2 x 106 gel U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>CLPX-200421AM-UERLAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9% (Saline)</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (OVA)</td>
			<td>Endofit, Invivogen</td>
			<td>9006-59-1</td>
			<td>10 mg/200 &#181;L in saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>PHZ1174</td>
			<td>50 &#181;g/ 500 &#181;L in saline 
			Final Concentration: in vivo: 100 &#181;g/ 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather disposable scalpel</td>
			<td>No. 21&#160;</td>
			<td>Final Concentration: in vivo:&#160; 300 ng/ 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zaiss</td>
			<td>Stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (corneal/iris washing)</td>
			<td>BD Microlane</td>
			<td>27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (i.p immunization)</td>
			<td>BD Microlane</td>
			<td>24 G1&#34;-Nr 17, 055* 25 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of ocular surface inflammation and collection of involved tissues

안구 표면 질환에는 각막, 결막 및 관련 안구 표면 샘 네트워크의 기능과 구조를 방해하는 다양한 장애가 포함됩니다. Meibomian 땀샘 (MG)은 눈물 막의 수성 부분의 증발을 방지하는 덮개 층을 만드는 지질을 분비합니다. 호중구와 세포외 DNA 트랩은 알레르기성 안구 질환의 마우스 모델에서 MG와 안구 표면을 채웁니다. 응집된 호중구 세포외 트랩(aggNET)은 MG 출구를 차단하고 MG 기능 장애를 조절하는 세포외 염색질로 구성된 메쉬 모양의 매트릭스를 공식화합니다. 여기서, 안구 표면 염증 및 MG 기능 장애를 유도하는 방법이 제시된다. 각막, 결막 및 눈꺼풀과 같은 안구 표면과 관련된 장기를 수집하는 절차가 자세히 설명되어 있습니다. 각 장기를 처리하기 위해 확립 된 기술을 사용하여 MG 기능 장애의 주요 형태 학적 및 조직 병리학 적 특징도 보여줍니다. 안구 삼출물은 안구 표면의 염증 상태를 평가할 수있는 기회를 제공합니다. 이러한 절차를 통해 전임상 수준에서 국소 및 전신 항염증 중재를 조사할 수 있습니다.

본 프로토콜은 안구 표면 염증의 뮤린 모델을 확립하기 위한 순차적 단계를 기술한다. 이 프로토콜은 치료제를 국부적으로 적용하고, 안구 삼출물을 얻고, 건강하고 염증이 있는 눈꺼풀(그림 2), 각막 및 결막과 같은 관련 부속 기관을 절제하는 방법을 보여주는 것을 목표로 합니다. 결막의 분리를 위해 위 눈꺼풀을 해부 할 때주의를 기울여야하며 각막 해부 중에 1x PBS에 보?...

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Induction of Ocular Surface Inflammation and Collection of Involved Tissues

안구 표면 염증은 안구 표면 조직에 해를 끼치고 눈의 중요한 기능을 손상시킵니다. 본 프로토콜은 마이보미안 샘 기능장애(MGD)의 마우스 모델에서 안구 염증을 유도하고 손상된 조직을 수집하는 방법을 기술한다.

안구 표면 염증의 유도 및 관련 조직의 수집

Ocular surface diseases include a range of disorders that disturb the functions and structures of the cornea, conjunctiva, and the associated ocular ...

이 프로토콜은 안구 표면 염증의 유도와 관련된 단계와 Meibomian 샘 기능 장애와 관련된 관련 영향을받는 기관의 수집을 순차적으로 설명합니다. 이 새로운 MGD 모델은 질병의 선천성 면역 측면, 특히 마이보미아선을 막는 호중구 세포외 트랩의 형성을 조사할 수 있습니다. 프로토콜에 전시된 기술은 전임상 단계에서 국소 치료적 개입을 도입하도록 확장될 수 있다.또한, 안구 삼출물과 장기의 수집은 치료의 효능을 반영합니다. 면역원 용액의 복강내 주사를 수행하기 위해, 7 내지 9주령의 C57 검정 6마리 마취되지 않은 암컷 마우스를 케이지 격자를 잡으면서 꼬리로 부드럽게 잡는다. 그런 다음 엄지와 검지 사이의 등 및 목 부위의 피부를 단단히 잡고 약지와 새끼 손가락 사이의 꼬리와하지를 손바닥에 고정하십시오.마우스를 머리가 아래로 향하도록 고정시킨 상태에서 준비된 면역 원 용액 100 마이크로 리터를 하복부의 오른쪽 또는 왼쪽 사분면에 주입하십시오. 예방 접종 후 안구 표면 챌린지를 수행하려면 마취 된 마우스의 눈 당 5 마이크로 리터의 오발 알부민 또는 난자 또는 식염수를 적용하고 방울이 눈에 흡수 될 때까지 5 분 동안 기다리십시오. 다음으로, 챌린지 직후 50 마이크로 리터의 멸균 식염수를 눈에 적용하여 안구 삼출물을 수집하십시오.안구 표면 조직을 절제하려면 마우스를 평평한 표면에 놓고 70 % 에탄올 면봉으로 눈 주위의 안와 부위를 소독하십시오. 눈 주위에 절개를 형성하려면 귀와 후 안와 동 사이와 편평 뼈 위의 표면을 따라 수직으로 절개하여 상악골을 따라 아래 눈꺼풀 아래로, 정면 뼈를 따라 위 눈꺼풀 위로 절개를 확장합니다. 구부러진 집게를 사용하여 눈 주위의 해부 된 조직을 조심스럽게 잡고 조직과 안구를 빼냅니다.절제된 장기를 멸균 PBS에 넣습니다. 그런 다음 실체 현미경으로 메스를 사용하여 절제된 위 눈꺼풀 주변의 과도한 안면 근육 조직을 다듬습니다. 결막을 수집하려면 위 눈꺼풀을 마른 페트리 접시에 놓습니다.그런 다음 미세한 핀셋과 메스를 사용하여 눈꺼풀 안쪽 표면에서 희끄무레 한 점액층을 부드럽게 벗겨냅니다. 각막을 해부하려면 드라이 아이스 위에 새로운 마른 페트리 접시에 아이 글로브를 놓습니다. 3 분 후 접시를 벤치 표면에 안정된 위치에 놓습니다.가늘고 날카로운 가위를 사용하여 윤부 옆의 각막 경계에 작은 절개를하십시오. 눈 지구 주위에 메스로 절개를 계속하여 각막에서 공막을 분리하십시오. 그런 다음 식염수로 넉넉하게 씻어내어 각막 뒷면에서 홍채와 렌즈 잔여물을 제거합니다.마이보미아샘과 그 구멍을 평가하려면 절제된 눈꺼풀을 실체 현미경 아래 똑바로 세웁니다. 그런 다음 카메라 노출 시간 및 ISO 설정에 따라 백색광 에피 조명 아래에서 이미지를 캡처합니다. Meibomian 샘 영역을 평가하려면 절제 된 눈꺼풀을 수평 위치에 놓고 적외선 카메라가 장착 된 실체 현미경의 백라이트를 켭니다.카메라 ISO에 따라 노출 시간을 조정하여 이미지를 캡처합니다. 식염수를 투여한 마우스는 눈을 크게 뜨고 건강한 안구 표면을 보였다. 이에 비해 난자 적용은 심한 안구 표면 염증, 눈의 좁은 열림 및 화학 요법의 징후를 유발합니다.절제된 눈꺼풀은 눈꺼풀을 감싸는 샘의 작은 플러그를 보여주는 건강한 눈꺼풀과 대조적으로 마이보미안 샘의 구멍과 부종을 막는 큰 폐색을 보여주었습니다. 샘의 적외선 투과 조명에 대한 추가 검사는 Meibomian 샘의 acini의 라세미 모양을 보여줍니다. 식염수에 도전한 마우스의 눈꺼풀은 둥근 아시니를 보여주었다.이에 비해 난자 적용은 알레르기성 안 질환 또는 AED가 있는 일부 땀샘의 파괴 및 손실을 유도했습니다. 눈꺼풀의 조직학적 분석은 식염수만 투여한 마우스에 비해 확장된 마이보미안 땀샘을 나타냈습니다. 드라이 아이스에서 안구를 배양하면 윤부 옆의 각막을 절개하고 각막에서 각막을 분리 할 수있었습니다.이 연구는 각막 수집을 촉진했습니다. 또한, 난자 투여는 결막에 심한 염증을 일으켜 충혈 증상을 보였다. 케모카인 CXCL-1의 상승된 수준은 호중구 혈관외 유출, 식균작용 및 탈과립을 촉진하고, 급성기 반응 및 호중구 침윤을 매개하는 인터루킨-6이 AED 마우스의 상청액에서 관찰되었다.반면에, 인터루킨-10의 농도는 나이브 마우스와 AED 마우스 모두에서 유의한 변화를 나타내지 않았다. 이 새로운 모델은 선천성 면역 경로를 표적으로 하는 약물의 효능을 개발하고 평가할 수 있게 하며, 항염증제 투여 방식의 데이터 마이닝에 큰 도움이 됩니다. 적절한 장기 수집 후 단일 세포 시퀀싱 및 이미징 질량 세포 분석과 같은 고도의 다중 방법이 이 프로토콜과 호환됩니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Murine Aortas 이내에 면역 세포의 흐름 Cytometry 분석

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

연구

면역학 및 감염병학

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

유전자의 식별을위한 VIGS - 중재 앞으로 유전학 검사는 Nonhost 저항에 참여


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

인플루엔자 A 바이러스의 핵 단백질과 마우스 MX1 단백질의 공동 면역 침전

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

마우스 비장에서 불변 자연 살해 T 세포를 분리하고 확장을위한 최적화 방법

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

절연, 특성화 및 잇몸 면역 세포 네트워크의 기능 시험

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험<em&gt; 브루셀라</em&gt; HeLa 세포의 감염

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

마우스의 실험 세균성 폐렴의 유도 및 표현형에 대한 비 침습적 및 기술적 비 집약적 인 방법

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...