Name: induction of ocular surface inflammation and collection of involved tissues
Uploaded: 2022-08-04T13:10:00
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Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), Projeto H2020-FETOPEN-2018-2020 861878, e pela Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) à MH.

Todos os procedimentos envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais sobre bem-estar animal e aprovados pela comissão de bem-estar animal da Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nuremberg (FAU) (número de permissão: 55.2.2-2532-2-1217). Camundongos fêmeas C57Bl/6, com idades entre 7-9 semanas, foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) e mantidos em condições específicas livres de patógen...

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	<li>Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tear+film+and+ocular+surface+changes+after+closure+of+the+meibomian+gland+orifices+in+the+rabbit.">Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit.</a> Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).</li><li>Mishima, S., Maurice, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oily+layer+of+the+tear+film+and+evaporation+from+the+corneal+surface.">The oily layer of the tear film and evaporation from the corneal surface.</a> Experimental Eye Research. 1, 39-45 (1961).</li><li>Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ocular+surface:+The+challenge+to+enable+and+protect+vision:+The+Friedenwald+lecture.">The ocular surface: The challenge to enable and protect vision: The Friedenwald lecture.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).</li><li>Hahn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+neutrophil+extracellular+traps+resolve+inflammation+by+proteolysis+of+cytokines+and+chemokines+and+protection+from+antiproteases.">Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases.</a> The FASEB Journal. 33 (1), 1401-1414 (2019).</li><li>Leppkes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+occlusion+by+neutrophil+extracellular+traps+in+COVID-19.">Vascular occlusion by neutrophil extracellular traps in COVID-19.</a> EBioMedicine. 58, 102925 (2020).</li><li>Munoz, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+initiate+gallstone+formation.">Neutrophil extracellular traps initiate gallstone formation.</a> Immunity. 51 (3), 443-450 (2019).</li><li>Schapher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+promote+the+development+and+growth+of+human+salivary+stones.">Neutrophil extracellular traps promote the development and growth of human salivary stones.</a> Cells. 9 (9), 2139 (2020).</li><li>Mahajan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontline+science:+Aggregated+neutrophil+extracellular+traps+prevent+inflammation+on+the+neutrophil-rich+ocular+surface.">Frontline science: Aggregated neutrophil extracellular traps prevent inflammation on the neutrophil-rich ocular surface.</a> Journal of Leukocyte Biology. 105 (6), 1087-1098 (2019).</li><li>DEWS Definition and Classification Subcommittee. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+definition+and+classification+of+dry+eye+disease:+Report+of+the+Definition+and+Classification+Subcommittee+of+the+International+Dry+Eye+Workshop.">The definition and classification of dry eye disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop.</a> The Ocular Surface. 5 (2), 75-92 (2007).</li><li>Nichols, K. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+reconstruction+of+the+mouse+meibomian+gland+using+high-resolution+nonlinear+optical+imaging.">Volumetric reconstruction of the mouse meibomian gland using high-resolution nonlinear optical imaging.</a> The Anatomical Record. 294 (2), 185-192 (2011).</li><li>Nien, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+changes+in+the+meibomian+gland.">Age-related changes in the meibomian gland.</a> Experimental Eye Research. 89 (6), 1021-1027 (2009).</li><li>Parfitt, G. J., Xie, Y., Geyfman, M., Brown, D. J., Jester, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+ductal+hyper-keratinization+in+mouse+age-related+meibomian+gland+dysfunction+(ARMGD).">Absence of ductal hyper-keratinization in mouse age-related meibomian gland dysfunction (ARMGD).</a> Aging. 5 (11), 825-834 (2013).</li><li>Lambert, R. W., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+blepharoconjunctivitis+complicating+13-cis-retinoic+acid+(isotretinoin)+therapy+in+a+laboratory+model.">Pathogenesis of blepharoconjunctivitis complicating 13-cis-retinoic acid (isotretinoin) therapy in a laboratory model.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (10), 1559-1564 (1988).</li><li>Jester, J. V., Nicolaides, N., Kiss-Palvolgyi, I., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meibomian+gland+dysfunction.+II.+The+role+of+keratinization+in+a+rabbit+model+of+MGD.">Meibomian gland dysfunction. II. The role of keratinization in a rabbit model of MGD.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 30 (5), 936-945 (1989).</li><li>Jester, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+biomicroscopy+and+photography+of+meibomian+glands+in+a+rabbit+model+of+meibomian+gland+dysfunction.">In vivo biomicroscopy and photography of meibomian glands in a rabbit model of meibomian gland dysfunction.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 22 (5), 660-667 (1982).</li><li>Lambert, R., Smith, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperkeratinization+in+a+rabbit+model+of+meibomian+gland+dysfunction.">Hyperkeratinization in a rabbit model of meibomian gland dysfunction.</a> American Journal of Ophthalmology. 105 (6), 703-705 (1988).</li><li>Knop, E., Knop, N., Millar, T., Obata, H., Sullivan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+international+workshop+on+meibomian+gland+dysfunction:+Report+of+the+subcommittee+on+anatomy,+physiology,+and+pathophysiology+of+the+meibomian+gland.">The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on anatomy, physiology, and pathophysiology of the meibomian gland.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1938-1978 (2011).</li><li>Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermogels+containing+sulfated+hyaluronan+as+novel+topical+therapeutics+for+treatment+of+ocular+surface+inflammation.">Thermogels containing sulfated hyaluronan as novel topical therapeutics for treatment of ocular surface inflammation.</a> Materials Today Bio. 13, 100183 (2022).</li><li>Lin, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alleviation+of+dry+eye+syndrome+with+one+dose+of+antioxidant,+anti-inflammatory,+and+mucoadhesive+lysine-carbonized+nanogels.">Alleviation of dry eye syndrome with one dose of antioxidant, anti-inflammatory, and mucoadhesive lysine-carbonized nanogels.</a> Acta Biomaterialia. 141, 140-150 (2022).</li><li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+beta+epithelial+sodium+channel+function+in+meibomian+glands+produces+pseudohypoaldosteronism+1-like+ocular+disease+in+mice.">Loss of beta epithelial sodium channel function in meibomian glands produces pseudohypoaldosteronism 1-like ocular disease in mice.</a> American Journal of Pathology. 188 (1), 95-110 (2018).</li><li>Mauris, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+CD147+results+in+impaired+epithelial+cell+differentiation+and+malformation+of+the+meibomian+gland.">Loss of CD147 results in impaired epithelial cell differentiation and malformation of the meibomian gland.</a> Cell Death &amp; Disease. 6 (4), 1726 (2015).</li><li>Ibrahim, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+induced+age+dependent+meibomian+gland+dysfunction+in+Cu,+Zn-superoxide+dismutase-1+(Sod1)+knockout+mice.">Oxidative stress induced age dependent meibomian gland dysfunction in Cu, Zn-superoxide dismutase-1 (Sod1) knockout mice.</a> PloS One. 9 (7), 99328 (2014).</li><li>McMahon, A., Lu, H., Butovich, I. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+tear+cytokines+and+clinical+correlations+in+Sjogren+syndrome+dry+eye+patients+and+non-Sjogren+syndrome+dry+eye+patients.">Analysis of tear cytokines and clinical correlations in Sjogren syndrome dry eye patients and non-Sjogren syndrome dry eye patients.</a> American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 247-253 (2013).</li><li>Nakae, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-specific+T+cell+sensitization+is+impaired+in+IL-17-deficient+mice,+causing+suppression+of+allergic+cellular+and+humoral+responses.">Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses.</a> Immunity. 17 (3), 375-387 (2002).</li><li>von Vietinghoff, S., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-17A+controls+IL-17F+production+and+maintains+blood+neutrophil+counts+in+mice.">IL-17A controls IL-17F production and maintains blood neutrophil counts in mice.</a> Journal of Immunology. 183 (2), 865-873 (2009).</li><li>Langrish, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-23+drives+a+pathogenic+T+cell+population+that+induces+autoimmune+inflammation.">IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (2), 233-240 (2005).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-IL-23+therapy+inhibits+multiple+inflammatory+pathways+and+ameliorates+autoimmune+encephalomyelitis.">Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1317-1326 (2006).</li></ol>

A secreção oleosa das glândulas meibomianas é de grande importância para um olho saudável22. No entanto, a obstrução dessas glândulas sebáceas por armadilhas extracelulares de neutrófilos agregados (aggNETs) que se alinham como filamentos paralelos localizados nas placas tarsais de ambas as pálpebras pode interromper o filme lacrimal23. Essa ruptura resulta em disfunção da glândula de Meibomian (MGD)1 e evaporação acelerada da lágri...

Cada piscar de olhos reabastece o filme lacrimal liso disperso sobre a córnea. Os epitélios da superfície ocular facilitam a distribuição e a orientação correta do filme lacrimal na superfície ocular. As mucinas são fornecidas pelas células epiteliais da córnea e da conjuntiva para ajudar a posicionar a parte aquosa do filme lacrimal proveniente das glândulas lacrimais na superfície dos olhos. Finalmente, a MG secreta lipídios que criam uma camada de cobertura que impede a evaporação da parte aquosa do filme lacrimal 1,2,3. Desta forma, as funções coordenadas de todos os órgãos oculares protegem a superfície ocular de patógenos invasores ou lesões e suportam a visão cristalina sem qualquer dor ou desconforto.
Em uma superfície ocular saudável, a descarga ocular que flui ou o reum ocular varre a poeira, as células epiteliais mortas, as bactérias, o muco e as células imunes. Armadilhas extracelulares de neutrófilos agregados (aggNETs) formulam uma matriz em forma de malha composta de cromatina extracelular e incorporam esses componentes no reum ocular. Os AggNETs resolvem a inflamação pela degradação proteolítica de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas4. No entanto, quando se tornam disfuncionais, esses aggNETs aberrantes impulsionam a patogênese de doenças como oclusões vasculares na COVID-195, cálculos biliares6 e sialolitíase7. Da mesma forma, os aggNETs na superfície ocular desempenham um papel protetor e contribuem para a resolução da inflamação da superfície altamente exposta8. Uma formação exagerada ou a falta de aggNETs na superfície ocular pode prejudicar a estabilidade do filme lacrimal e/ou causar feridas na córnea, conjuntivite cicatrizante e doença do olho seco. Por exemplo, a obstrução da MG é uma das principais causas de doença do olho seco9. AggNETs também são conhecidos por obstruir o fluxo de secreção lipídica dos ductos de MG e causar disfunção da glândula meibomiana (MGD). A congestão dos orifícios de MG por aggNETs causa falta de fluido gorduroso envolvendo a superfície ocular e fluido engarrafado retrógrado, resultando em disfunção da função da glândula e danos acinares. Essa disfunção pode resultar em evaporação do filme lacrimal, fibrose das margens das pálpebras, inflamação ocular e dano prejudicial à MG10,11.
Vários modelos animais foram desenvolvidos ao longo dos anos para imitar o processo patológico da MGD em humanos. Por exemplo, camundongos C57BL/6 com 1 ano de idade ajudaram a estudar os efeitos relacionados à idade na doença do olho seco (DED) e MGD, refletindo a patologia da doença ocular em pacientes com 50 anos ou mais12,13,14. Além disso, os coelhos são modelos apropriados para investigar os efeitos das intervenções farmacológicas. Portanto, a indução de MGD em coelhos tem sido relatada pela administração tópica de epinefrina ou pela introdução sistêmica de ácido 13-cis-retinóico (isotretinoína)15,16,17,18,19.
Embora esses modelos animais fossem adequados para determinar os diferentes fatores que contribuem para a fisiopatologia da MGD, eles foram restritos em sua utilização. Por exemplo, o modelo murino de MGD relacionada à idade foi ideal para decifrar elementos apenas em adultos mais velhos e, portanto, os coelhos pareceram ser o modelo animal mais adequado para estudar doenças da superfície ocular, pois permitem a investigação de múltiplos mecanismos fisiopatológicos. No entanto, devido à falta de ferramentas analíticas abrangentes para detectar proteínas na superfície ocular e porque muitas partes do genoma do coelho não são anotadas, elas são limitadas para investigações20,21.
Além disso, esses modelos animais utilizados para investigar a patogênese da doença do olho seco não forneceram detalhes adequados para analisar o braço imunológico do distúrbio que instiga a inflamação da superfície ocular. Nesse sentido, o modelo murino de MGD desenvolvido por Reyes et al. mostrou associação entre doença ocular alérgica em camundongos e MGD em humanos e destacou a etiologia imunológica responsável pela MGD obstrutiva21. Esse modelo associa a doença alérgica ocular a uma resposta TH17 que recruta neutrófilos para a conjuntiva e pálpebra, causando MGD e inflamação ocular crônica21. A indução de MGD e inflamação ocular neste modelo murino é uma ferramenta valiosa para investigar eventos a montante durante o desenvolvimento de inflamação local impulsionada por uma resposta imune contínua21. O protocolo atual descreve a inflamação da superfície ocular acompanhada de MGD obstrutiva. Neste método, os ratos são imunizados e, após 2 semanas, desafiados na superfície ocular com o imunógeno por 7 dias. Além disso, os passos para isolar o exsudato ocular e os órgãos oculares associados durante a inflamação aguda e a dissecção da córnea, conjuntiva e pálpebras são descritos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium Hydroxide</td>
			<td>Imject alum Adjuvant</td>
			<td>77161</td>
			<td>40 mg/ mL 
			Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6 mice, aged 7&#8211;9 weeks</td>
			<td>Charles River Laboratories&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium</td>
			<td>Carl roth</td>
			<td>CN93.1</td>
			<td>1 M 
			Final Concentration: 5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>FST by Dumont SWITZERLAND</td>
			<td>5/45 11251-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine sharp scissor</td>
			<td>FST Stainless steel, Germany</td>
			<td>15001-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar safety cabinet</td>
			<td>Herasafe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophotography Camera</td>
			<td>Canon</td>
			<td>EOS6D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrophotography Camera (without IR filter)</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D5300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mnase</td>
			<td>New England biolabs</td>
			<td>M0247S</td>
			<td>2 x 106 gel U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>CLPX-200421AM-UERLAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,9% (Saline)</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovalbumin (OVA)</td>
			<td>Endofit, Invivogen</td>
			<td>9006-59-1</td>
			<td>10 mg/200 &#181;L in saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific&#160;</td>
			<td>PHZ1174</td>
			<td>50 &#181;g/ 500 &#181;L in saline 
			Final Concentration: in vivo: 100 &#181;g/ 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>628160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Feather disposable scalpel</td>
			<td>No. 21&#160;</td>
			<td>Final Concentration: in vivo:&#160; 300 ng/ 100 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zaiss</td>
			<td>Stemi508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (corneal/iris washing)</td>
			<td>BD Microlane</td>
			<td>27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (i.p immunization)</td>
			<td>BD Microlane</td>
			<td>24 G1&#34;-Nr 17, 055* 25 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of ocular surface inflammation and collection of involved tissues

As doenças da superfície ocular incluem uma série de distúrbios que perturbam as funções e estruturas da córnea, da conjuntiva e da rede de glândulas da superfície ocular associada. As glândulas meibomianas (MG) secretam lipídios que criam uma camada de cobertura que impede a evaporação da parte aquosa do filme lacrimal. Neutrófilos e armadilhas de DNA extracelular povoam MG e a superfície ocular em um modelo de rato de doença ocular alérgica. As armadilhas extracelulares de neutrófilos agregados (aggNETs) formulam uma matriz em forma de malha composta de cromatina extracelular que oclui as saídas de MG e condiciona a disfunção de MG. Aqui, um método para induzir inflamação da superfície ocular e disfunção da MG é apresentado. Os procedimentos para a coleta de órgãos relacionados à superfície ocular, como córnea, conjuntiva e pálpebras, são descritos em detalhes. Usando técnicas estabelecidas para o processamento de cada órgão, as principais características morfológicas e histopatológicas da disfunção da MG também são mostradas. Os exsudatos oculares oferecem a oportunidade de avaliar o estado inflamatório da superfície ocular. Esses procedimentos possibilitam a investigação de intervenções anti-inflamatórias tópicas e sistêmicas em nível pré-clínico.

O presente protocolo descreve as etapas sequenciais para o estabelecimento de um modelo murino de inflamação da superfície ocular. Os protocolos visam mostrar como aplicar terapêutica localmente, obter exsudatos oculares e órgãos acessórios associados ao consumo como pálpebras saudáveis e inflamadas (Figura 2), córnea e conjuntiva. Deve-se ter atenção quando as pálpebras superiores são dissecadas para o isolamento da conjuntiva, e deve ser armazenada em 1x PBS durante a dissec?...

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Induction of Ocular Surface Inflammation and Collection of Involved Tissues

A inflamação da superfície ocular prejudica os tecidos da superfície ocular e compromete as funções vitais do olho. O presente protocolo descreve um método para induzir inflamação ocular e coletar tecidos comprometidos em um modelo de camundongo de disfunção da glândula de Meibomian (MGD).

Indução da inflamação da superfície ocular e coleta de tecidos envolvidos

Ocular surface diseases include a range of disorders that disturb the functions and structures of the cornea, conjunctiva, and the associated ocular ...

Este protocolo descreve sequencialmente as etapas envolvidas na indução da inflamação da superfície ocular e na coleta de órgãos afetados associados envolvidos na disfunção da glândula de Meibom. Este novo modelo de MGD permite a investigação do aspecto imune inato da doença, particularmente a formação de armadilhas extracelulares de neutrófilos ocluindo a glândula de Meibom. A técnica exposta no protocolo pode ser estendida para introduzir intervenções terapêuticas tópicas em estágio pré-clínico.Além disso, a coleta de exsudados oculares e órgãos reflete a eficácia do tratamento. Para realizar a injeção intraperitoneal da solução de imunógeno, segure o camundongo C57 preto seis não anestesiado de sete a nove semanas de idade suavemente pela cauda enquanto agarra a grade da gaiola. Em seguida, segure firmemente a pele das costas e a região do pescoço entre o polegar e o dedo indicador e fixe a cauda e os membros inferiores entre o anel e o dedo mínimo contra a palma da mão.Mantendo o rato fixo com a cabeça para baixo, injete 100 microlitros da solução de imunógeno preparada no quadrante direito ou esquerdo da cavidade abdominal inferior. Para realizar um desafio de superfície ocular após a imunização, aplique cinco microlitros de ovalbumina ou óvulos ou soro fisiológico por olho de um rato anestesiado e aguarde cinco minutos para que a gota seja absorvida pelo olho. Em seguida, colete os exsudados oculares aplicando 50 microlitros de solução salina estéril no olho imediatamente após o desafio.Para a excisão dos tecidos da superfície ocular, coloque o rato sobre uma superfície uniforme e desinfete a área orbital ao redor do olho com um cotonete de etanol a 70%. Para formar uma incisão ao redor do olho, faça uma incisão entre a orelha e o seio retroorbital e ao longo da superfície acima do osso escamoso verticalmente, estendendo a incisão horizontalmente abaixo da pálpebra inferior ao longo do osso maxilar e acima da pálpebra superior ao longo do osso frontal. Segure cuidadosamente o tecido dissecado ao redor do olho usando pinça curva e puxe o tecido e o globo ocular para fora.Coloque os órgãos excisados em PBS estéril. Em seguida, usando um bisturi sob o microscópio estéreo, corte o excesso de tecido muscular facial ao redor das pálpebras superiores excisadas. Para coletar a conjuntiva coloque a pálpebra superior em uma placa de Petri seca.Em seguida, usando pinças finas e um bisturi, descasque a camada de muco esbranquiçada suavemente para fora da superfície interna da pálpebra. Ao lado de dissecar a córnea, coloque o globo ocular em uma nova placa de Petri seca em cima do gelo seco. Após três minutos, coloque o prato na superfície do banco em uma posição estável.Use uma tesoura fina e afiada para fazer uma pequena incisão na borda da córnea ao lado do limbo. Continue a incisão com o bisturi ao redor do globo ocular, separando a esclera da córnea. Em seguida, remova os restos da íris e da lente da parte de trás da córnea, lavando generosamente com solução salina.Para avaliar a glândula meibomiana e seus orifícios, coloque as pálpebras excisadas em uma posição vertical sob o microscópio estéreo. Em seguida, de acordo com o tempo de exposição da câmera e as configurações ISO, capture imagens sob epiiluminação de luz branca. Para avaliar a área da glândula de Meibom, coloque as pálpebras excisadas em uma posição horizontal e ligue a luz de fundo do microscópio estéreo equipado com uma câmera infravermelha.Capture imagens ajustando o tempo de exposição de acordo com o ISO da câmera. Camundongos administrados salinamente mostraram superfícies oculares saudáveis com os olhos bem abertos. Em comparação, a aplicação de óvulos induz inflamação grave da superfície ocular, a abertura estreita dos olhos e sinais de quemose.As pálpebras excisadas apresentavam grandes oclusões obstruindo os orifícios da glândula meibomiana e edema, em contraste com as pálpebras saudáveis mostrando pequenos tampões da glândula que reveste a pálpebra. Um exame mais aprofundado da transiluminação infravermelha da glândula revela a aparência racêmica dos ácinos da glândula meibomiana. As pálpebras de camundongos com solução salina desafiadas mostraram os ácinos redondos.Em comparação, as aplicações de óvulos induziram a destruição e perda de algumas glândulas com a doença ocular alérgica ou DEA. A análise histológica das pálpebras mostrou glândulas meibomianas dilatadas em comparação com camundongos administrados apenas com soro fisiológico. A incubação do globo ocular em gelo seco permitiu a incisão na córnea ao lado do limbo e a separação da córnea da esclera.Este estudo facilitou a coleta da córnea. Além disso, a administração de óvulos infligiu inflamação grave à conjuntiva com aparência hiperêmica. Níveis elevados de quimiocina CXCL-1 facilitam o extravasamento de neutrófilos, fagocitose e degranulação, e interleucina-6 mediando a resposta de fase aguda e infiltração de neutrófilos foram observados nos sobrenadantes de camundongos com DEA.Por outro lado, a concentração de interleucina-10 não mostrou alterações significativas em camundongos ingênuos e com DEA. Este novo modelo permite o desenvolvimento e a avaliação da eficácia de fármacos que visam as vias imunes inatas, e é de grande ajuda na mineração de dados da forma de administração de agentes anti-inflamatórios. Após a coleta apropriada de órgãos, métodos altamente multiplex, como sequenciamento de célula única e citometria de massa por imagem, são compatíveis com esse protocolo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Análise por Citometria de fluxo das células imunológicas Dentro aortas murino

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Imunologia e Infecção

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

VIGS Mediada frente Triagem Genética para identificação de genes envolvidos na resistência não hospedeiras


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Co-imunoprecipitação da proteína do rato Mx1 com a nucleoproteína do vírus da gripe A

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

Um método otimizado para o isolamento e expansão de células invariante Natural Killer T de Rato Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network

Isolamento, caracterização e exploração funcional da célula de rede gengival Imune

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident ...

Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues

Indução de encefalomielite autoimune experimental em camundongos e avaliação da distribuição da doença dependente de células imunes em vários tecidos

Multiple sclerosis is presumed to be an inflammatory autoimmune disease, which is characterized by lesion formation in the central nervous system (CNS) ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Os ensaios baseados em microscopia para high-throughput screening de Fatores Hospedeiros Envolvidos na<em&gt; Brucella</em&gt; A infecção de células HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...