Name: characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

نود أن نعرب عن تقديرنا للدكتور ديمتري سوسلوف (جامعة سانت بطرسبرغ الحكومية ، سانت بطرسبرغ ، روسيا) والبروفيسور ميرا بونوماريفا (معهد التتار للبحوث العلمية للزراعة ، FRC KazSC RAS ، قازان ، روسيا) لتوفير بذور الذرة والجاودار ، على التوالي. تم تطوير الطريقة المقدمة في إطار مشروع مؤسسة العلوم الروسية رقم 18-14-00168 الممنوح لشركة LK. تم تنفيذ جزء العمل (الحصول على النتائج المقدمة) من قبل AP بدعم مالي من التكليف الحكومي لمركز FRC Kazan العلمي التابع ل RAS.

1. إعداد عينة لقياسات AFM
<ol><li>المواد النباتية: تعقيم بذور الذرة (Zea mays L.) والجاودار (Secale cereale L.) بمحلول NaOCl بنسبة 0.35٪ لمدة 10 دقائق ، وغسل 3x بالماء المقطر ، ثم تنمو في الماء في الظلام عند 27 درجة مئوية لمدة 4 أيام و 2 أيام على التوالي. تم استخدام الجذور الأولية للتجربة.</li>
	<li>تحضير ...

<ol>
	<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties.">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).</li><li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> Plos One. 8 (3), 57813 (2013).</li><li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy.">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).</li><li>Daher, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+growth+is+achieved+through+the+additive+mechanical+effect+of+material+anisotropy+and+elastic+asymmetry.">Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry.</a> Elife. 7, 38161 (2018).</li><li>Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+growth+symmetry+breaking+in+the+Arabidopsis+hypocotyl.">The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl.</a> Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).</li><li>Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+of+cell+wall+nano-mechanical+properties+along+and+across+elongating+primary+roots+of+maize.">Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).</li><li>Chiniquy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+novel+rice+genes+closely+related+to+the+Arabidopsis+IRX9,+IRX9L,+and+IRX14+genes+and+their+roles+in+xylan+biosynthesis.">Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Bidhendi, A. J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+quantify+primary+plant+cell+wall+mechanics.">Methods to quantify primary plant cell wall mechanics.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).</li><li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+Mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls:+at+tissue,+cellular,+and+subcellular+resolutions.">AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+by+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li><li>Yakubov, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nano-scale+mechanical+heterogeneity+of+primary+plant+cell+walls.">Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).</li><li>Zdunek, A., Kurenda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+elastic+properties+of+tomato+fruit+cells+with+an+atomic+force+microscope.">Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope.</a> Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).</li><li>Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+water+content+has+a+direct+effect+on+extensibility+in+growing+hypocotyls+of+sunflower+(Helianthus+annuus+L).">Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L).</a> Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).</li><li>Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+mapping+of+soft+materials+with+the+atomic+force+microscope:+methods,+theory+and+applications.">Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications.</a> Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).</li><li>Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+primary+cell+wall+nanomechanical+properties+in+internal+cells+of+non-fixed+maize+roots.">Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots.</a> Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).</li><li>Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+atomic+force+microscopy+to+measure+mechanical+properties+and+turgor+pressure+of+plant+cells+and+plant+tissues.">Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology.">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).</li><li>Braunsmann, C., Schaffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Note:+Artificial+neural+networks+for+the+automated+analysis+of+force+map+data+in+atomic+force+microscopy.">Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).</li></ol>

تحدد الخواص الميكانيكية للجدران الخلوية الأولية اتجاه نمو الخلايا النباتية ومعدله، ومن ثم حجم النبات وشكله في المستقبل. الطريقة القائمة على AFM المقدمة هنا تكمل التقنيات الحالية التي تستخدم لدراسة خصائص جدران الخلايا النباتية. يسمح بفحص مرونة جدران الخلايا ، التي تنتمي إلى الأنسجة الداخ?...

تحدد الخواص الميكانيكية لجدار الخلية النباتية شكل الخلية وقدرتها على النمو. على سبيل المثال ، يكون الطرف المتنامي لأنبوب حبوب اللقاح أكثر ليونة من الأجزاء غير النامية من نفس الأنبوب1. يسبق تكوين البدائية على مرستيم أرابيدوبسيس انخفاض موضعي في صلابة جدار الخلية في موقع البدائيةالمستقبلية 2,3. جدران الخلايا في Arabidopsis hypocotyl ، الموازية لمحور النمو الرئيسي وتنمو بشكل أسرع ، أكثر ليونة من تلك المتعامدة مع هذا المحور وتنمو بشكل أبطأ 4,5. في جذر الذرة ، كان انتقال الخلايا من الانقسام إلى الاستطالة مصحوبا بانخفاض في الوحدات المرنة في جميع أنسجة الجذر. ظلت الوحدات منخفضة في منطقة الاستطالة وزادت في منطقة الاستطالةالمتأخرة 6.
على الرغم من توفر طرق مختلفة ، نادرا ما تتم مقارنة المصفوفات الكبيرة من المعلومات الكيميائية الحيوية والوراثية حول بيولوجيا جدار الخلية التي يتم الحصول عليها سنويا مع الخواص الميكانيكية لجدران الخلايا. على سبيل المثال ، غالبا ما تكون الطفرات الموجودة على الجينات المرتبطة بجدار الخلية قد غيرت النمو والتطور4،7،8 ، ولكن نادرا ما يتم وصفها من حيث الميكانيكا الحيوية. أحد أسباب ذلك هو صعوبة إجراء القياسات على المستويين الخلوي ودون الخلوي. يعد مجهر القوة الذرية (AFM) حاليا النهج الأساسي لمثل هذه التحليلات9.
في السنوات الأخيرة ، تم إجراء العديد من الدراسات القائمة على AFM حول الميكانيكا الحيوية لجدار الخلية النباتية. تم فحص الخواص الميكانيكية لجدران الخلايا للأنسجة الخارجية ل Arabidopsis2،3،4،5،10،11 والبصل 12 ، وكذلك الخلايا المستزرعة13،14،15. ومع ذلك ، قد تحتوي الخلايا السطحية للنبات على جدران خلوية تختلف خواصها الميكانيكية عن تلك الموجودة في الأنسجة الداخلية6. بالإضافة إلى ذلك ، يتم ضغط الخلايا النباتية بواسطة التورم مما يجعلها أكثر صلابة. للتخلص من تأثير ضغط التورم ، يتعين على الباحثين استخدام محاليل البلازما2،3،4،5،10،11 أو تحلل القيم التي تم الحصول عليها في مساهمات التورم وجدار الخلية 12. يؤدي النهج الأول إلى تجفيف العينة ويغير سمك وخصائص جدار الخلية16 ، بينما يتطلب النهج الثاني قياسات إضافية ورياضيات معقدة ، وينطبق فقط على الخلايا ذات الشكل البسيط نسبيا12. يمكن تقييم خصائص جدار الخلية للأنسجة الداخلية على عمليات التجميد17 أو أقسام من المواد النباتية المشربة بالراتنج8. ومع ذلك ، فإن كلتا الطريقتين تنطوي على الجفاف و / أو التشريب للعينات ، مما يؤدي حتما إلى تغييرات في الخصائص. من الصعب ربط خصائص الخلايا المعزولة أو المستزرعة بفسيولوجيا النبات بأكمله. يمكن أن تؤثر كل من زراعة الخلايا النباتية وعزلها على الخواص الميكانيكية لجدرانها الخلوية.
الطريقة المعروضة هنا تكمل النهج المذكورة أعلاه. باستخدامه ، يمكن فحص جدران الخلايا الأولية لأي نسيج وفي أي مرحلة من مراحل تطور النبات. تم إجراء ملاحظات التقسيم و AFM في السائل الذي يتجنب جفاف العينة. تم حل مشكلة التورم حيث يتم قطع الخلايا. يصف البروتوكول العمل مع جذور الذرة والجاودار ، ولكن يمكن فحص أي عينة أخرى إذا كانت مناسبة لتقسيم الاهتزاز.
تم إجراء دراسات AFM الموصوفة هنا باستخدام تقنية حجم القوة. تستخدم الأدوات المختلفة أسماء مختلفة لهذه الطريقة. ومع ذلك ، فإن المبدأ الأساسي هو نفسه. يتم الحصول على خريطة حجم القوة للعينة عن طريق حركة جيبية أو مثلثة للناتئ (أو العينة) لتحقيق قوة تحميل معينة في كل نقطة تم تحليلها ، أثناء تسجيل انحراف الكابولي18. تجمع النتيجة بين صورة طبوغرافية للسطح ومجموعة منحنيات مسافة القوة. يستخدم كل منحنى لحساب التشوه والصلابة ومعامل يونغ والالتصاق وتبديد الطاقة عند نقطة محددة. يمكن الحصول على بيانات مماثلة عن طريق التحليل الطيفي للقوة نقطة بنقطة بعد المسح في وضع الاتصال19 ، على الرغم من أنه يستغرق وقتا أطول.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose, low melting point</td>
			<td>Helicon</td>
			<td>B-5000-0.1</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for section moving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NanoTools, Germany</td>
			<td>NT_B150_v0020-5</td>
			<td>Model: Biosphere B150-FM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>FMG01/50</td>
			<td>Model: FMG01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for vibratomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Heinz Herenz</td>
			<td>1042000</td>
			<td>for vibratomy and AFM calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageAnalysis P9 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM1000 epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>11591301</td>
			<td>for section check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova PX 3.4.1 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for experiments conducting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTEGRA Prima microscope with HD controller</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for AFM and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642062</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Leica VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>1404723512</td>
			<td>for sample sectioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy

تحدد الخواص الميكانيكية للجدران الخلوية الأولية اتجاه نمو الخلايا النباتية ومعدله، ومن ثم تحديد حجم النبات وشكله في المستقبل. تم تطوير العديد من التقنيات المتطورة لقياس هذه الخصائص. ومع ذلك ، يظل الفحص المجهري للقوة الذرية (AFM) هو الأكثر ملاءمة لدراسة مرونة جدار الخلية على المستوى الخلوي. كان أحد أهم قيود هذه التقنية هو أنه يمكن دراسة الخلايا الحية السطحية أو المعزولة فقط. هنا ، يتم تقديم استخدام مجهر القوة الذرية للتحقيق في الخواص الميكانيكية لجدران الخلايا الأولية التي تنتمي إلى الأنسجة الداخلية لجسم النبات. يصف هذا البروتوكول قياسات معامل يونغ الظاهر لجدران الخلايا في الجذور ، ولكن يمكن أيضا تطبيق الطريقة على أعضاء النبات الأخرى. يتم إجراء القياسات على أقسام مشتقة من الاهتزاز من المواد النباتية في خلية سائلة ، مما يسمح (i) بتجنب استخدام محاليل البلازما أو تشريب العينة بالشمع أو الراتنج ، (ii) جعل التجارب سريعة ، و (iii) منع جفاف العينة. يمكن دراسة كل من جدران الخلايا المضادة للانحناء و periclinal ، اعتمادا على كيفية تقسيم العينة. يمكن التحقيق في الاختلافات في الخواص الميكانيكية للأنسجة المختلفة في قسم واحد. يصف البروتوكول مبادئ تخطيط الدراسة ، والقضايا المتعلقة بإعداد العينات والقياسات ، وكذلك طريقة اختيار منحنيات تشوه القوة لتجنب تأثير التضاريس على القيم التي تم الحصول عليها من معامل المرونة. لا تقتصر الطريقة على حجم العينة ولكنها حساسة لحجم الخلية (أي يصعب فحص الخلايا ذات التجويف الكبير).

يتم عرض معامل المرونة النموذجي وخرائط DFL ، بالإضافة إلى منحنيات القوة التي تم الحصول عليها على جذور الجاودار والذرة بالطريقة الموصوفة ، في الشكل 2. يوضح الشكل 2A معامل المرونة وخرائط DFL التي تم الحصول عليها في القسم العرضي من الجذر الأساسي للجاودار. تتوافق ال...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

تعد دراسات الميكانيكا الحيوية لجدار الخلية ضرورية لفهم نمو النبات والتشكل. يقترح البروتوكول التالي لدراسة جدران الخلايا الأولية الرقيقة في الأنسجة الداخلية لأعضاء النبات الفتية باستخدام مجهر القوة الذرية.

توصيف الخواص الميكانيكية للجدار الخلوي الأولي في أعضاء النبات الحي باستخدام مجهر القوة الذرية

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

يتم التحكم في نمو الخلايا النباتية من خلال الخواص الميكانيكية لجدرانها الخلوية. لذلك ، من المهم معرفة هذه الخصائص في الأعضاء والأنسجة المختلفة للنباتات. تسمح الطريقة المقدمة هنا بالتوصيف الميكانيكي الحيوي لجدران الخلايا غير الثابتة وغير المجففة في الأنسجة الداخلية للنباتات الصغيرة.ابدأ بإعداد المحاليل والعينة لتقسيم الاهتزاز. صب طبقة أربعة ملليمترات من الأغاروز المذاب بنسبة 3٪ في قاع طبق بتري واتركه يبرد قليلا لمنع التلف الحراري للعينة. ضع حوالي خمسة ملليمترات بطول ثلاث أو أربع قطع من عضو النبات أفقيا على الأغاروز.بعد حوالي 30 إلى 60 ثانية ، سيظهر فيلم رقيق شبه صلب أعلى طبقة الأغاروز الأولى. ثم ، صب بعناية طبقة ثانية في الأعلى. بعد أن يتم ترسيخ الأغاروز تماما ، اقطع الكتلة التي تحتوي على العينة.شكل الكتلة في هرم مبتور سداسي لضمان ثباتها أثناء التقسيم الإضافي. قبل البدء في تقسيم العينة باستخدام الاهتزاز ، قم بلصق الكتلة على مرحلة الاهتزاز باستخدام مادة لاصقة cyanoacrylate. ضع المسرح في الاهتزاز ، بحيث تواجه إحدى زوايا الهرم شفرة الاهتزاز وتصب الماء في حمام الاهتزاز.اضبط معلمات التقسيم مثل سمك القسم وسرعة الشفرة وتردد الاهتزاز وقم بقص العينة. باستخدام فرشاة دقيقة ، انقل القسم من الحمام المائي إلى شريحة زجاجية وضع قطرة ماء على القسم لمنعه من الجفاف. بعد التحقق من جودة القسم تحت المجهر الضوئي ، حدد القسم المناسب الذي يحتوي على جدار خلوي عمودي على مستوى المقطع.ثم شل حركة قسم قياسات مجهر القوة الذرية عن طريق صب طبقة من ملليلتر واحد من 1٪ أغاروز منصهر في الجزء السفلي من غطاء طبق بتري باستخدام ماصة. بعد أن تصلب الأغاروز ، قم بإزالة الماء الزائد من القسم عن طريق إحضار ورق الترشيح إلى حافته. انقل القسم بعناية من الشريحة إلى وسط غطاء طبق بتري باستخدام فرشاة.ثم أضف بعناية 1٪ أغاردوز حول القسم باستخدام ماصة 20 ميكرولتر وصب الماء أو أي محلول آخر لمجهر القوة الذرية في غطاء طبق بتري مع القسم الثابت. توجيه العينة تحت مجهر القوة الذرية ناتئ باستخدام المجهر الضوئي. انقر فوق الزر "اقتراب" ثم الزر "الهبوط" للاقتراب من العينة في وضع الاتصال بنقطة محددة تبلغ نانوأمبير واحد.انقر فوق الزر "مسح" ثم "المنطقة" . حدد حجم المنطقة 50 ميكرومتر × 50 ميكرومتر للمسح. انقر فوق الزر "تحريك المسبار" وتحقق من منطقة المسح بالكامل عن طريق تحريك الماسح الضوئي فوقه والعثور على أعلى نقطة بناء على درجة بروز الماسح الضوئي.افتح علامة التبويب النهج. ثم انقر فوق الزر "إزالة" للتراجع عن العينة. باستخدام أعلى نقطة كهدف ، انقر فوق الزر Landing للاقتراب من العينة مرة أخرى.ثم تحقق من السطح مرة أخرى بالنقر فوق الزر "تحريك المسبار" وتحريك الماسح الضوئي فوقه. اضبط معدل المسح على 0.5 هرتز ، واضبط حجم المسح على 50 ميكرومتر × 50 ميكرومتر ونقطة المسح على 64 × 64. انقر فوق الزر "تشغيل" وقم بالمسح الضوئي للتحقق من سطح العينة واحتمال تلوثها بالأغاروز.بعد النقر فوق الزر "تشغيل" ، اختر وضع HDPlus في القائمة المنسدلة في النافذة الرئيسية للبرنامج واضبط نقطة الضبط على 0.1 نانوأمبير في نافذة البرنامج الرئيسية. في علامة التبويب الرئيسية لنافذة HD ، اضبط معلمات المسح المناسبة للعينة المدروسة. ثم افتح علامة التبويب الضوضاء في نافذة HD وأدخل تردد رنين الكابولي.افتح علامة التبويب Quant في نافذة HD وأدخل IOS وصلابة الكابولي ونصف قطر الطرف والزاوية. حدد نموذج الاتصال ، والذي سيتم استخدامه للحسابات اعتمادا على هندسة الطرف. بعد ذلك ، افتح علامة التبويب Scan في نافذة HD وحدد الإشارات ، وكذلك الاتجاه الذي يتم فيه تسجيل الإشارة.ضع علامة في مربع Force Volume للحصول على سجل لجميع منحنيات القوة وانقر فوق الزر "إيقاف التشغيل" أعلى نافذة البرنامج الرئيسية لتشغيل حلقة التغذية الراجعة انقر فوق الزر Phase Core في نافذة HD الرئيسية لتصحيح حساسية النظام البصري. تقدم علامة التبويب "مقابل الوقت" في نافذة HD الرئيسية وظيفة إشارة DFL مقابل الوقت في الوقت الفعلي. حدد أجزاء هذه الدالة التي سيتم استخدامها لتحديد مستوى خط الأساس ولتناسب نموذج الاتصال لمزيد من العمليات الحسابية.الآن ، اضبط قيمة نقطة المسح على 256 × 256 في النافذة الرئيسية للبرنامج. بعد ذلك ، اضبط معدل المسح على 0.2 هرتز وانقر فوق الزر "تشغيل" لمسح العينة. بعد توقف المسح ، انقر فوق الزر تشغيل أعلى النافذة الرئيسية لإيقاف تشغيل حلقة الملاحظات.اختر وضع الاتصال في القائمة المنسدلة ، وافتح علامة التبويب النهج ، وانقر فوق الزر "إزالة" للتراجع عن العينة. انقر فوق الزر "بيانات" لفتح برنامج التحليل وحفظ الإخراج. افتح الملف المحفوظ في برنامج التحليل.حدد إطار مستوى صوت قوة HD. اضغط مع الاستمرار على مفتاح التحكم وحدد إطارا مرئيا واحدا تم الحصول عليه في نفس اتجاه المسح. انقر فوق الزر "تحميل خريطة خارجية" لمعرفة مكان جدران الخلايا.تحقق من InvOptSens وقيم الصلابة الكابولية في علامة التبويب الرئيسية. افتح علامة التبويب إضافي وتحقق من معلمات التلميح ونموذج الاتصال. انقر فوق نقاط مختلفة على جدران الخلايا على الإطار المرئي وحدد فقط تلك المنحنيات الموصوفة جيدا بواسطة النموذج.تتوافق المساحات البيضاء في خريطة المعامل مع المبالغة الخاطئة في تقدير معامل يونغ بسبب وصول الماسح الضوئي إلى حده في الاتجاه Z. هذه الصورة ليست ملائمة لاستخدامها كخريطة خارجية لمزيد من الاختيار من منحنيات القوة المرضية. ومع ذلك ، فإن خريطة إشارة DFL المعروضة على اليمين مناسبة بشكل أفضل هنا.قد تشير الأدوات المختلفة إلى إشارات DFL على أنها إشارات انحراف أو خطأ. يمكن أن يؤدي الماسح الضوئي الذي تم تمديده بالكامل أثناء محاولة الوصول إلى قاع العينة إلى قياسات خاطئة وحتى عمليات مسح متقطعة. يمكن التحقق من وجود الأغاروز أثناء الحصول على الفحص الأول في وضع الاتصال حيث تظهر جدران الخلايا وبعض قيعان الخلايا في مثل هذه الفحوصات.ومع ذلك ، في حالة الشلل غير الدقيق ، قد يتم تغطية السطح بالأغاروز ، الذي يخفي تضاريس العينة. من بين أربعة منحنيات قوة مختلفة مسجلة عند نقاط مختلفة من نفس الجدار الخلوي، لا يظهر المنحنى المسجل عند 0.1 أي خط أساس، مما يعني عدم فصل طرف الكابولي عن الجدار الخلوي. يوضح المنحنى المسجل عند 0.3 كتفا على الجزء المقترب يشير إلى انحناء الجدار الخلوي.تظهر النقطتان الثانية والرابعة منحنيات قوة مرضية ذات قيم معيارية مماثلة. يتطلب إعداد العينات وفحصها ممارسة ، ولكن يمكن إتقانها. جزء مهم من هذا البروتوكول هو تصفية المنحنيات الناتجة.لا تعتمد على وحدات ، والتي تم حسابها تلقائيا. يمكن استخدام نفس التقنية لقياس قوى الالتصاق أو تبديد الطاقة. يمكن أن يكون مهما أيضا لوصف سلوك الفسكوز أو اللزج المرن لبعض المواد.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

قياس جدار الخلية النباتية ملحق (زحف) المستحثة بواسطة الرقم الهيدروجيني حمضي والفا Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

يعيش استجابة الخلية لتحفيز الميكانيكية المتكاملة التي درستها فرقة الميكروسكوب الضوئي والذرية

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

الجزئي الميكانيكية توصيف أنسجة الرئة باستخدام القوة الذرية الميكروسكوب

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

البيوفيزيائية فحوصات للتحقيق في الخواص الميكانيكية للنواة الخلية الطور البيني : الركيزة التطبيق الانفعال والتلاعب Microneedle

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

تحديد الأهداف من microRNAs الإنسان مع نظام الفحص LightSwitch Luciferase به مراسل 3&#39;UTR - a يبني وmicroRNA مقلد في خلايا منتسب

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

غليكان التنميط من البوليمرات جدار الخلية النباتية باستخدام [ميكروأرس]

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

في وقت واحد قياس درجة الحموضة في التقامي وعصاري خلوي المقصورات في الخلايا الحية باستخدام متحد البؤر المجهري

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

قرار الكمي عال من بلوري السليلوز تراكم في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; جذور لرصد الأنسجة محددة جدار الخلية تعديلات

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...