Name: characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende Dr. Dmitry Suslov (Sankt Petersborg State University, Sankt Petersborg, Rusland) og Prof. Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Rusland) for at levere henholdsvis majs og rugfrø. Den præsenterede metode blev udviklet inden for rammerne af det russiske videnskabsfondsprojekt nr. 18-14-00168 tildelt LK. Den del af arbejdet (opnåelse af de præsenterede resultater) blev udført af AP med økonomisk støtte fra regeringsopgaven til FRC Kazan Scientific Center of RAS.

1. Prøveforberedelse til AFM-målinger
<ol><li>Plantemateriale: Steriliser frøene af majs (Zea mays L.) og rug (Secale cereale L.) med en 0,35% NaOCl-opløsning i 10 min., vask 3x med destilleret vand, og dyrk derefter hydroponisk i mørke ved 27 °C i henholdsvis 4 dage og 2 dage. Primære rødder blev brugt til eksperimentet.</li>
	<li>Fremstilling af opløsninger og prøve til vibratom sektionering<ol><li>Forbered agaroseopløsning til rodindlejring ved at opløse 3% (w / w) lavs...

<ol>
	<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties.">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).</li><li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> Plos One. 8 (3), 57813 (2013).</li><li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy.">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).</li><li>Daher, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+growth+is+achieved+through+the+additive+mechanical+effect+of+material+anisotropy+and+elastic+asymmetry.">Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry.</a> Elife. 7, 38161 (2018).</li><li>Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+growth+symmetry+breaking+in+the+Arabidopsis+hypocotyl.">The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl.</a> Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).</li><li>Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+of+cell+wall+nano-mechanical+properties+along+and+across+elongating+primary+roots+of+maize.">Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).</li><li>Chiniquy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+novel+rice+genes+closely+related+to+the+Arabidopsis+IRX9,+IRX9L,+and+IRX14+genes+and+their+roles+in+xylan+biosynthesis.">Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Bidhendi, A. J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+quantify+primary+plant+cell+wall+mechanics.">Methods to quantify primary plant cell wall mechanics.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).</li><li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+Mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls:+at+tissue,+cellular,+and+subcellular+resolutions.">AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+by+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li><li>Yakubov, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nano-scale+mechanical+heterogeneity+of+primary+plant+cell+walls.">Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).</li><li>Zdunek, A., Kurenda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+elastic+properties+of+tomato+fruit+cells+with+an+atomic+force+microscope.">Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope.</a> Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).</li><li>Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+water+content+has+a+direct+effect+on+extensibility+in+growing+hypocotyls+of+sunflower+(Helianthus+annuus+L).">Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L).</a> Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).</li><li>Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+mapping+of+soft+materials+with+the+atomic+force+microscope:+methods,+theory+and+applications.">Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications.</a> Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).</li><li>Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+primary+cell+wall+nanomechanical+properties+in+internal+cells+of+non-fixed+maize+roots.">Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots.</a> Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).</li><li>Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+atomic+force+microscopy+to+measure+mechanical+properties+and+turgor+pressure+of+plant+cells+and+plant+tissues.">Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology.">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).</li><li>Braunsmann, C., Schaffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Note:+Artificial+neural+networks+for+the+automated+analysis+of+force+map+data+in+atomic+force+microscopy.">Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).</li></ol>

De mekaniske egenskaber ved de primære cellevægge bestemmer retningen og hastigheden af plantecellevækst og dermed plantens fremtidige størrelse og form. Den AFM-baserede metode, der præsenteres her, supplerer eksisterende teknikker, der bruges til at studere egenskaberne af plantecellevægge. Det gør det muligt at undersøge elasticiteten af cellevægge, der tilhører plantens indre væv. Ved hjælp af den præsenterede metode blev de mekaniske egenskaber af cellevægge i forskellige væv af den voksende majsrod k...

De mekaniske egenskaber ved plantecellevæggen bestemmer cellens form og dens evne til at vokse. For eksempel er pollenrørets voksende spids blødere end de ikke-voksende dele af det samme rør1. Primordiadannelsen på Arabidopsis meristem indledes med et lokalt fald i cellevægsstivhed på stedet for det fremtidige primordium 2,3. Cellevæggene i Arabidopsis hypocotyl, som er parallelle med hovedvækstaksen og vokser hurtigere, er blødere end dem, der er vinkelret på denne akse og vokser langsommere 4,5. I majsroten blev overgangen af celler fra division til forlængelse ledsaget af et fald i elastiske moduler i alle væv i roden. Moduli forblev lav i forlængelseszonen og steg i den sene forlængelseszone6.
På trods af tilgængeligheden af forskellige metoder sammenlignes de store arrays af biokemiske og genetiske oplysninger om cellevægsbiologi, der opnås årligt, sjældent med cellevæggenes mekaniske egenskaber. For eksempel har mutanter på cellevægsrelaterede gener ofte ændret vækst og udvikling 4,7,8, men beskrives sjældent med hensyn til biomekanik. En af grundene til dette er vanskeligheden ved at foretage målinger på cellulære og subcellulære niveauer. Atomkraftmikroskopi (AFM) er i øjeblikket den primære tilgang til sådanne analyser9.
I de senere år er der udført adskillige AFM-baserede undersøgelser af plantecellevægsbiomekanik. De mekaniske egenskaber af cellevægge i det ydre væv af Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 og løg 12 samt af dyrkede celler 13,14,15 er blevet undersøgt. Imidlertid kan de overfladiske celler i en plante have cellevægge, hvis mekaniske egenskaber adskiller sig fra de indre væv6. Derudover er planteceller under tryk af turgor, hvilket gør dem stivere. For at slippe af med indflydelsen fra turgortryk skal forskere bruge plasmolyserende opløsninger 2,3,4,5,10,11 eller nedbryde de opnåede værdier i turgor- og cellevægsbidrag 12. Den første tilgang fører til prøvedehydrering og ændrer tykkelsen og egenskaberne af cellevæggen16, mens den anden tilgang kræver yderligere målinger og kompliceret matematik og kun gælder for celler med relativt enkel form12. Cellevægsegenskaberne af indre væv kan evalueres på kryosektioner17 eller sektioner af plantemateriale imprægneret med harpiks8. Begge metoder involverer imidlertid dehydrering og / eller imprægnering af prøver, hvilket uundgåeligt fører til ændringer i egenskaber. Egenskaberne af isolerede eller dyrkede celler er vanskelige at forholde sig til hele plantens fysiologi. Både dyrkning og isolering af planteceller kan påvirke de mekaniske egenskaber af deres cellevægge.
Den metode, der præsenteres her, supplerer de ovennævnte tilgange. Ved hjælp af det kan de primære cellevægge i ethvert væv og på ethvert stadium af planteudvikling undersøges. Sektionering og AFM-observationer blev udført i væske, som undgår prøvedehydrering. Problemet med turgor blev løst, da cellerne skæres. Protokollen beskriver arbejdet med majs- og rugrødder, men enhver anden prøve kan undersøges, om den er egnet til vibratomsektionering.
De her beskrevne AFM-undersøgelser blev udført ved hjælp af kraftvolumenteknikken. Forskellige instrumenter bruger forskellige navne til denne metode. Det grundlæggende princip er imidlertid det samme; Et kraftvolumenkort over prøven opnås ved en sinusformet eller trekantet bevægelse af udkragningen (eller prøven) for at opnå en bestemt belastningskraft ved hvert analyseret punkt, mens cantileverafbøjningen registreres18. Resultatet kombinerer et topografisk billede af overfladen og rækken af kraftafstandskurver. Hver kurve bruges til at beregne deformation, stivhed, Youngs modul, vedhæftning og energiafledning på et bestemt punkt. Lignende data kan opnås ved punkt-for-punkt kraftspektroskopi efter scanning i kontakttilstand19, selvom det er mere tidskrævende.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose, low melting point</td>
			<td>Helicon</td>
			<td>B-5000-0.1</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for section moving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NanoTools, Germany</td>
			<td>NT_B150_v0020-5</td>
			<td>Model: Biosphere B150-FM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>FMG01/50</td>
			<td>Model: FMG01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for vibratomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Heinz Herenz</td>
			<td>1042000</td>
			<td>for vibratomy and AFM calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageAnalysis P9 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM1000 epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>11591301</td>
			<td>for section check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova PX 3.4.1 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for experiments conducting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTEGRA Prima microscope with HD controller</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for AFM and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642062</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Leica VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>1404723512</td>
			<td>for sample sectioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy

De mekaniske egenskaber ved de primære cellevægge bestemmer retningen og hastigheden af plantecellevækst og derfor plantens fremtidige størrelse og form. Mange sofistikerede teknikker er blevet udviklet til at måle disse egenskaber; atomkraftmikroskopi (AFM) er dog fortsat den mest bekvemme til at studere cellevægselasticitet på celleniveau. En af de vigtigste begrænsninger ved denne teknik har været, at kun overfladiske eller isolerede levende celler kan studeres. Her præsenteres brugen af atomkraftmikroskopi til at undersøge de mekaniske egenskaber af primære cellevægge, der tilhører de indre væv i en plantekrop. Denne protokol beskriver målinger af det tilsyneladende Youngs modul af cellevægge i rødder, men metoden kan også anvendes på andre planteorganer. Målingerne udføres på vibratomafledte sektioner af plantemateriale i en flydende celle, hvilket gør det muligt (i) at undgå brug af plasmolyserende opløsninger eller prøveimprægnering med voks eller harpiks, (ii) gøre eksperimenterne hurtige og (iii) forhindre dehydrering af prøven. Både antiklinale og periklinale cellevægge kan studeres, afhængigt af hvordan prøven blev sektioneret. Forskelle i de mekaniske egenskaber af forskellige væv kan undersøges i et enkelt afsnit. Protokollen beskriver principperne for studieplanlægning, problemer med prøveforberedelse og målinger samt metoden til valg af kraftdeformationskurve for at undgå topografiens indflydelse på de opnåede værdier af elastisk modul. Metoden er ikke begrænset af prøvestørrelse, men er følsom over for cellestørrelse (dvs. celler med et stort lumen er vanskelige at undersøge).

Typiske elastiske modul- og DFL-kort samt kraftkurver opnået på rug- og majsrødder ved den beskrevne metode er vist i figur 2. Figur 2A viser elastisk modul og DFL-kort opnået på den tværgående sektion af rugens primære rod. De hvide områder på modulkortet (figur 2A til venstre) svarer til en fejlagtig overvurdering af Youngs modul på grund af, at scanneren nåede sin grænse i z-retningen. Dette billede er ikke praktisk ...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

Undersøgelser af cellevægsbiomekanik er afgørende for at forstå plantevækst og morfogenese. Følgende protokol foreslås at undersøge tynde primære cellevægge i det indre væv i unge planteorganer ved hjælp af atomkraftmikroskopi.

Karakterisering af mekaniske egenskaber ved primær cellevæg i levende planteorganer ved hjælp af atomkraftmikroskopi

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

Plantecellevækst styres af de mekaniske egenskaber af deres cellevægge. Derfor er det vigtigt at kende disse egenskaber i forskellige organer og væv af planterne. Metoden præsenteret her tillader biomekanisk karakterisering af ikke-faste og ikke-dehydrerede cellevægge i de indre væv af unge planter.Start med at forberede opløsningerne og prøve til vibratom sektionering. Hæld et fire millimeter lag smeltet 3% agarose på bunden af petriskålen og lad det køle lidt af for at forhindre termisk skade på prøven. Placer omkring fem millimeter lange tre eller fire stykker af planteorganet vandret på agarose.Omkring 30 til 60 sekunder senere vises en tynd halvfast film oven på det første agaroselag. Hæld derefter forsigtigt et andet lag ovenpå. Når agarosen er fuldstændig størknet, skal du skære blokken, der indeholder prøven, ud.Form blokken til en sekskantet afkortet pyramide for at sikre dens stabilitet under yderligere sektionering. Før prøven afsluttes med vibratomet, limes blokken på vibratomstadiet med cyanoacrylatklæbemiddel. Placer scenen i vibratomet, så et af pyramidehjørnerne vender mod vibreringsbladet, og hæld vand i vibratombadet.Indstil sektionsparametrene som sektionstykkelse, bladhastighed og vibrationsfrekvens, og skær prøven. Brug en fin børste til at flytte sektionen fra vandbadet til en glasrutsjebane og placere en dråbe vand på sektionen for at forhindre, at den tørrer ud. Når du har kontrolleret sektionens kvalitet under et lysmikroskop, skal du vælge den rigtige sektion med cellevæg vinkelret på sektionsplanet.Immobiliser derefter sektionen til atomkraftmikroskopimålinger ved at hælde et lag på en milliliter 1% smeltet agarose på bunden af petriskålhætten ved hjælp af en pipette. Når agarosen er størknet, skal du fjerne overskydende vand fra sektionen ved at bringe filterpapir til kanten. Overfør forsigtigt sektionen fra diaset til midten af petriskålhætten ved hjælp af en børste.Tilsæt derefter forsigtigt 1% agarose omkring sektionen ved hjælp af en 20 mikroliter pipette og hæld vandet eller anden opløsning til atomkraftmikroskopi i petriskålhætten med den immobiliserede sektion. Prøven styres under atomkraftmikroskopicantilever ved hjælp af det optiske mikroskop. Klik på tilgangsknappen og derefter landingsknappen for at nærme sig prøven i kontakttilstand med et sætpunkt på en nanoampere.Klik på knappen Scanning og derefter på knappen Område. Vælg arealstørrelsen på 50 mikrometer gange 50 mikrometer, der skal scannes. Klik på knappen Flyt sonde, og kontroller hele scanningsområdet ved at flytte scanneren over den og finde det højeste punkt baseret på graden af scannerfremspring.Åbn fanen Tilgang. Klik derefter på knappen Fjern for at trække prøven tilbage. Brug det højeste punkt som mål til at klikke på landingsknappen for at nærme dig prøven igen.Kontroller derefter overfladen igen ved at klikke på knappen Flyt sonde og flytte scanneren over den. Indstil scanningshastigheden til 0,5 hertz, og indstil scanningsstørrelsen til 50 mikrometer x 50 mikrometer, og scanningspunktet til 64 x 64. Klik på knappen Kør, og scan for at kontrollere overfladen af prøven, og det er muligt forurening med agarose.Når du har klikket på knappen Til, skal du vælge HDPlus-tilstand i rullemenuen i programmets hovedvindue og indstille sætpunktet til 0,1 nanoampere i hovedprogramvinduet. I hovedfanen i HD-vinduet skal du indstille scanningsparametrene, der passer til den studerede prøve. Åbn derefter fanen Lyde i HD-vinduet, og indtast udkragningens resonansfrekvens.Åbn fanen Quant i HD-vinduet, og indtast IOS, cantilever stivhed, spidsradius og vinkel. Vælg kontaktmodellen, som skal bruges til beregninger afhængigt af spidsgeometri. Herefter skal du åbne fanen Scan i HD-vinduet og vælge signalerne samt den retning, hvor signalet er optaget.Marker afkrydsningsfeltet Force Volume for at få en oversigt over alle kraftkurver, og klik på knappen Fra øverst i hovedprogramvinduet for at tænde feedback-sløjfen Klik på knappen Phase Core i HD-hovedvinduet for at korrigere følsomheden af det optiske system. Fanen Versus Time i HD-hovedvinduet præsenterer funktionen af DFL-signalet versus tid i realtid. Vælg de dele af denne funktion, der skal bruges til bestemmelse af basisniveau, og som passer til kontaktmodellen til yderligere beregninger.Indstil nu scanningspunktværdien til 256 x 256 i programmets hovedvindue. Indstil derefter scanningshastigheden til 0,2 hertz, og klik på knappen Kør for at scanne prøven. Når scanningen stopper, skal du klikke på knappen Til øverst i hovedvinduet for at slukke for feedback-sløjfen.Vælg Kontakttilstand i rullemenuen, åbn fanen Tilgang, og klik på knappen Fjern for at trække eksemplet tilbage. Klik på knappen Data for at åbne analysesoftwaren og gemme output. Åbn den gemte fil i analysesoftwaren.Vælg HD-kraftvolumenrammen. Hold kontroltasten nede, og vælg en visuel ramme, der er opnået i samme scanningsretning. Klik på knappen Indlæs eksternt kort for at se, hvor cellevæggene er placeret.Kontroller InvOptSens og cantilever stivhedsværdier i hovedfanen. Åbn fanen Yderligere, og kontroller tipparametrene og kontaktmodellen. Klik på forskellige punkter på cellevæggene på den visuelle ramme, og vælg kun de kurver, der er godt beskrevet af modellen.De hvide områder på modulkortet svarer til en fejlagtig overvurdering af Youngs modul på grund af, at scanneren når sin grænse i Z-retningen. Dette billede er ikke praktisk at bruge som et eksternt kort til et yderligere udvalg af tilfredsstillende kraftkurver. DFL-signalkortet, der præsenteres til højre, er dog bedre egnet her.Forskellige instrumenter kan henvise til DFL-signaler som afbøjnings- eller fejlsignaler. Scanneren, der er blevet fuldt udvidet, mens den forsøgte at nå bunden af prøven, kan resultere i fejlagtige målinger og endda afbrudte scanninger. Agarosetilstedeværelsen kan kontrolleres, mens den første scanning opnås i kontakttilstand, da cellevæggene og nogle cellebunde er synlige på sådanne scanninger.I tilfælde af unøjagtig immobilisering kan overfladen imidlertid være dækket af agarose, som maskerer prøvetopografien. Ud af fire forskellige kraftkurver registreret på forskellige punkter i den samme cellevæg viser kurven registreret ved 0,1 ingen baseline, hvilket betyder ingen adskillelse af udkragningsspidsen fra cellevæggen. Kurven registreret ved 0,3 viser en skulder på den nærliggende del, der indikerer bøjning af cellevæggen.Punkt to og fire viser tilfredsstillende kraftkurver med lignende moduli-værdier. Prøveforberedelse og eksamen kræver øvelse, men det kan mestres. En afgørende del af denne protokol er at filtrere resulterende kurver.Stol ikke på moduli, som blev beregnet automatisk. Den samme teknik kan bruges til at måle vedhæftningskræfterne eller energiafledningen. Det kan også være vigtigt for beskrivelse af viskose eller viskoelastisk opførsel af nogle materialer.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Glycan profilering af plantecellevægge Polymerer med Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Prøve forberedelse til single virion Atomic Force mikroskopi og superopløsning fluorescens Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Samtidig pH-måling i Endocytic og Cytosoliske Rum i levende celler ved hjælp af konfokal mikroskopi

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Kvantificering af krystallinsk cellulose Ophobning i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots til Monitor Tissue-specifikke Cell Wall Ændringer

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...