Name: characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

We willen dr. Dmitry Suslov (Sint-Petersburg Staatsuniversiteit, Sint-Petersburg, Rusland) en prof. Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Rusland) bedanken voor het leveren van respectievelijk maïs- en roggezaden. De gepresenteerde methode is ontwikkeld in het kader van het Russian Science Foundation Project No. 18-14-00168 toegekend aan LK. Het deel van het werk (het verkrijgen van de gepresenteerde resultaten) werd uitgevoerd door AP met de financiële steun van de overheidsopdracht voor het FRC Kazan Scientific Center van RAS.

1. Monstervoorbereiding voor AFM-metingen
<ol><li>Plantmateriaal: Steriliseer de zaden van maïs (Zea mays L.) en rogge (Secale cereale L.) met een 0,35% NaOCl-oplossing gedurende 10 minuten, was 3x met gedestilleerd water en groei vervolgens hydroponisch in het donker bij respectievelijk 4 dagen en 2 dagen hydroponisch. Primaire wortels werden gebruikt voor het experiment.</li>
	<li>Bereiding van oplossingen en monster voor vibratome sectie<ol><li>Bereid agarose-oplossing voor wortel...

<ol>
	<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties.">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).</li><li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> Plos One. 8 (3), 57813 (2013).</li><li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy.">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).</li><li>Daher, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+growth+is+achieved+through+the+additive+mechanical+effect+of+material+anisotropy+and+elastic+asymmetry.">Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry.</a> Elife. 7, 38161 (2018).</li><li>Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+growth+symmetry+breaking+in+the+Arabidopsis+hypocotyl.">The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl.</a> Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).</li><li>Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+of+cell+wall+nano-mechanical+properties+along+and+across+elongating+primary+roots+of+maize.">Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).</li><li>Chiniquy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+novel+rice+genes+closely+related+to+the+Arabidopsis+IRX9,+IRX9L,+and+IRX14+genes+and+their+roles+in+xylan+biosynthesis.">Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Bidhendi, A. J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+quantify+primary+plant+cell+wall+mechanics.">Methods to quantify primary plant cell wall mechanics.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).</li><li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+Mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls:+at+tissue,+cellular,+and+subcellular+resolutions.">AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+by+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li><li>Yakubov, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nano-scale+mechanical+heterogeneity+of+primary+plant+cell+walls.">Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).</li><li>Zdunek, A., Kurenda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+elastic+properties+of+tomato+fruit+cells+with+an+atomic+force+microscope.">Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope.</a> Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).</li><li>Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+water+content+has+a+direct+effect+on+extensibility+in+growing+hypocotyls+of+sunflower+(Helianthus+annuus+L).">Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L).</a> Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).</li><li>Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+mapping+of+soft+materials+with+the+atomic+force+microscope:+methods,+theory+and+applications.">Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications.</a> Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).</li><li>Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+primary+cell+wall+nanomechanical+properties+in+internal+cells+of+non-fixed+maize+roots.">Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots.</a> Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).</li><li>Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+atomic+force+microscopy+to+measure+mechanical+properties+and+turgor+pressure+of+plant+cells+and+plant+tissues.">Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology.">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).</li><li>Braunsmann, C., Schaffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Note:+Artificial+neural+networks+for+the+automated+analysis+of+force+map+data+in+atomic+force+microscopy.">Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).</li></ol>

De mechanische eigenschappen van de primaire celwanden bepalen de richting en snelheid van de groei van plantencellen, en dus de toekomstige grootte en vorm van de plant. De hier gepresenteerde AFM-gebaseerde methode is een aanvulling op bestaande technieken die worden gebruikt om de eigenschappen van plantencelwanden te bestuderen. Hiermee kan de elasticiteit van celwanden, die behoren tot de binnenste weefsels van de plant, worden onderzocht. Met behulp van de gepresenteerde methode werden de mechanische eigenschappen ...

De mechanische eigenschappen van de celwand van de plant bepalen de vorm van de cel en het vermogen om te groeien. Zo is de groeipunt van de stuifmeelbuis zachter dan de niet-groeiende delen van dezelfde buis1. De primordiavorming op Arabidopsis meristeem wordt voorafgegaan door een lokale afname van de celwandstijfheid op de plaats van het toekomstige primordium 2,3. De celwanden van Arabidopsis hypocotyl, die parallel lopen aan de hoofdgroeias en sneller groeien, zijn zachter dan die loodrecht op deze as en groeien langzamer 4,5. In de maïswortel ging de overgang van cellen van deling naar rek gepaard met een afname van elastische moduli in alle weefsels van de wortel. De moduli bleef laag in de rekzone en nam toe in de late rekzone6.
Ondanks de beschikbaarheid van verschillende methoden, worden de grote reeksen biochemische en genetische informatie over celwandbiologie die jaarlijks wordt verkregen, zelden vergeleken met de mechanische eigenschappen van celwanden. Mutanten op celwandgerelateerde genen hebben bijvoorbeeld vaak een veranderde groei en ontwikkeling 4,7,8, maar worden zelden beschreven in termen van biomechanica. Een van de redenen hiervoor is de moeilijkheid om metingen uit te voeren op cellulair en subcellulair niveau. Atoomkrachtmicroscopie (AFM) is momenteel de primaire benadering voor dergelijke analyses9.
In de afgelopen jaren zijn tal van AFM-gebaseerde studies naar biomechanica van plantencellen uitgevoerd. De mechanische eigenschappen van celwanden van de buitenste weefsels van Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 en ui12, evenals van gekweekte cellen 13,14,15, zijn onderzocht. De oppervlakkige cellen van een plant kunnen echter celwanden hebben waarvan de mechanische eigenschappen verschillen van die van de binnenste weefsels6. Bovendien worden plantencellen onder druk gezet door turgor waardoor ze stijver worden. Om zich te ontdoen van de invloed van turgordruk, moeten onderzoekers plasmolyserende oplossingen 2,3,4,5,10,11 gebruiken of de verkregen waarden ontleden in turgor- en celwandbijdragen12. De eerste benadering leidt tot uitdroging van monsters en verandert de dikte en eigenschappen van de celwand16, terwijl de tweede benadering aanvullende metingen en gecompliceerde wiskunde vereist en alleen van toepassing is op cellen van relatief eenvoudige vorm12. De celwandeigenschappen van inwendige weefsels kunnen worden geëvalueerd op cryosecties17 of delen van plantaardig materiaal geïmpregneerd met hars8. Beide methoden omvatten echter uitdroging en /of impregnatie van monsters, wat onvermijdelijk leidt tot veranderingen in eigenschappen. De eigenschappen van geïsoleerde of gekweekte cellen zijn moeilijk te relateren aan de fysiologie van de hele plant. Zowel de teelt als de isolatie van plantencellen kunnen de mechanische eigenschappen van hun celwanden beïnvloeden.
De hier gepresenteerde methode vormt een aanvulling op de bovengenoemde benaderingen. Hiermee kunnen de primaire celwanden van elk weefsel en in elk stadium van de ontwikkeling van de plant worden onderzocht. Sectie- en AFM-observaties werden uitgevoerd in vloeistof die uitdroging van monsters voorkomt. Het probleem van turgor werd opgelost toen de cellen worden gesneden. Het protocol beschrijft het werk met maïs- en roggewortels, maar elk ander monster kan worden onderzocht of het geschikt is voor vibratomsectie.
De hier beschreven AFM-onderzoeken zijn uitgevoerd met behulp van de kracht-volumetechniek. Verschillende instrumenten gebruiken verschillende namen voor deze methode. Het basisprincipe is echter hetzelfde; een kracht-volumekaart van het monster wordt verkregen door een sinusvormige of driehoekige beweging van de cantilever (of het monster) om een bepaalde belastingskracht op elk geanalyseerd punt te bereiken, terwijl de cantileverafbuigingwordt geregistreerd 18. Het resultaat combineert een topografisch beeld van het oppervlak en de reeks kracht-afstandscurven. Elke curve wordt gebruikt om de vervorming, stijfheid, Young's modulus, adhesie en energiedissipatie op een specifiek punt te berekenen. Vergelijkbare gegevens kunnen worden verkregen door punt-voor-punt krachtspectroscopie na het scannen in contactmodus19, hoewel het tijdrovender is.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose, low melting point</td>
			<td>Helicon</td>
			<td>B-5000-0.1</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for section moving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NanoTools, Germany</td>
			<td>NT_B150_v0020-5</td>
			<td>Model: Biosphere B150-FM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>FMG01/50</td>
			<td>Model: FMG01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for vibratomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Heinz Herenz</td>
			<td>1042000</td>
			<td>for vibratomy and AFM calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageAnalysis P9 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM1000 epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>11591301</td>
			<td>for section check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova PX 3.4.1 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for experiments conducting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTEGRA Prima microscope with HD controller</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for AFM and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642062</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Leica VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>1404723512</td>
			<td>for sample sectioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy

De mechanische eigenschappen van de primaire celwanden bepalen de richting en snelheid van de groei van plantencellen en dus de toekomstige grootte en vorm van de plant. Er zijn veel geavanceerde technieken ontwikkeld om deze eigenschappen te meten; atoomkrachtmicroscopie (AFM) blijft echter het handigst voor het bestuderen van celwandelasticiteit op cellulair niveau. Een van de belangrijkste beperkingen van deze techniek is dat alleen oppervlakkige of geïsoleerde levende cellen kunnen worden bestudeerd. Hier wordt het gebruik van atoomkrachtmicroscopie gepresenteerd om de mechanische eigenschappen van primaire celwanden te onderzoeken die behoren tot de interne weefsels van een plantenlichaam. Dit protocol beschrijft metingen van de schijnbare Young's modulus van celwanden in wortels, maar de methode kan ook worden toegepast op andere plantenorganen. De metingen worden uitgevoerd op van vibratomen afgeleide delen van plantaardig materiaal in een vloeibare cel, waardoor (i) het gebruik van plasmolyserende oplossingen of monsterimpregnatie met was of hars kan worden vermeden, (ii) de experimenten snel kunnen worden gemaakt en (iii) uitdroging van het monster kan worden voorkomen. Zowel anticlinale als periclinale celwanden kunnen worden bestudeerd, afhankelijk van hoe het monster werd gesneden. Verschillen in de mechanische eigenschappen van verschillende weefsels kunnen in één sectie worden onderzocht. Het protocol beschrijft de principes van studieplanning, problemen met specimenvoorbereiding en metingen, evenals de methode voor het selecteren van kracht-vervormingscurven om de invloed van topografie op de verkregen waarden van elastische modulus te voorkomen. De methode is niet beperkt door de steekproefgrootte, maar is gevoelig voor de celgrootte (d.w.z. cellen met een groot lumen zijn moeilijk te onderzoeken).

Typische elastische modulus- en DFL-kaarten, evenals krachtcurven verkregen op rogge- en maïswortels volgens de beschreven methode, zijn weergegeven in figuur 2. Figuur 2A toont elastische modulus- en DFL-kaarten verkregen op het dwarsdoorsnede van de primaire wortel van rogge. De witte gebieden in de moduluskaart (figuur 2A, links) komen overeen met een onjuiste overschatting van Young's modulus omdat de scanner zijn limiet in de ...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

Studies van celwandbiomechanica zijn essentieel voor het begrijpen van plantengroei en morfogenese. Het volgende protocol wordt voorgesteld om dunne primaire celwanden in de interne weefsels van jonge plantenorganen te onderzoeken met behulp van atoomkrachtmicroscopie.

Karakteriseren van mechanische eigenschappen van primaire celwand in levende plantenorganen met behulp van atoomkrachtmicroscopie

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

De groei van plantencellen wordt gecontroleerd door de mechanische eigenschappen van hun celwanden. Daarom is het belangrijk om deze eigenschappen in verschillende organen en weefsels van de planten te kennen. De hier gepresenteerde methode maakt de biomechanische karakterisering van niet-vaste en niet-gedehydrateerde celwanden in de interne weefsels van jonge planten mogelijk.Begin met het voorbereiden van de oplossingen en het monster voor vibratomsectie. Giet een vier millimeter laag gesmolten 3% agarose op de bodem van de petrischaal en laat deze iets afkoelen om thermische schade aan het monster te voorkomen. Plaats ongeveer vijf millimeter lange drie of vier stukken van het plantenorgel horizontaal op de agarose.Ongeveer 30 tot 60 seconden later verschijnt er een dunne halfvaste film bovenop de eerste agaroselaag. Giet er vervolgens voorzichtig een tweede laag op. Nadat de agarose volledig is gestold, knipt u het blok met het monster uit.Vorm het blok in een zeshoekige afgeknotte piramide om de stabiliteit ervan tijdens verdere secties te garanderen. Voordat u begint met de monstersectie met het vibratoom, lijmt u het blok op het vibratoomstadium met cyanoacrylaatlijm. Plaats het podium in het vibratoom, zodat een van de piramidehoeken naar het blad van het vibratoom is gericht en giet water in het vibratomebad.Stel de sectieparameters in, zoals sectiedikte, bladsnelheid en trillingsfrequentie en snijd het monster. Verplaats met een fijne borstel het gedeelte van het waterbad naar een glazen glijbaan en plaats een druppel water op het gedeelte om te voorkomen dat het uitdroogt. Nadat u de kwaliteit van de sectie onder een lichtmicroscoop hebt gecontroleerd, selecteert u de juiste sectie met celwand loodrecht op het sectievlak.Immobiliseer vervolgens de sectie voor atoomkrachtmicroscopiemetingen door een laag van één milliliter van 1% gesmolten agarose op de bodem van de petrischaaldop te gieten met behulp van een pipet. Nadat de agarose is gestold, verwijdert u overtollig water uit de sectie door filterpapier naar de rand te brengen. Breng het gedeelte voorzichtig over van de dia naar het midden van de petrischaaldop met een borstel.Voeg vervolgens voorzichtig 1% agarose toe rond de sectie met behulp van een pipet van 20 microliter en giet het water of een andere oplossing voor de atoomkrachtmicroscopie in de petrischaaldop met het geïmmobiliseerde gedeelte. Leid het monster onder de atoomkrachtmicroscopie cantilever met behulp van de optische microscoop. Klik op de knop Naderen en vervolgens op de landingsknop om het monster in de contactmodus te benaderen met een instelpunt van één nanoampère.Klik op de knop Scannen en vervolgens op de knop Gebied. Selecteer de oppervlaktegrootte van 50 micrometer bij 50 micrometer om te scannen. Klik op de knop Probe verplaatsen en controleer het hele scangebied door de scanner eroverheen te bewegen en het hoogste punt te vinden op basis van de mate van uitsteeksel van de scanner.Open het tabblad Nadering. Klik vervolgens op de knop Verwijderen om het voorbeeld in te trekken. Als u het hoogste punt als doel gebruikt, klikt u op de knop Landing om het voorbeeld opnieuw te benaderen.Controleer vervolgens het oppervlak opnieuw door op de knop Sonde verplaatsen te klikken en de scanner eroverheen te bewegen. Stel de scansnelheid in op 0,5 hertz en stel de scangrootte in op 50 micrometer bij 50 micrometer en het scanpunt op 64 bij 64. Klik op de knop Uitvoeren en scan om het oppervlak van het monster te controleren en het is mogelijk besmetting met agarose.Nadat u op de knop Aan hebt geklikt, kiest u de HDPlus-modus in het vervolgkeuzemenu in het hoofdvenster van het programma en stelt u het instelpunt in op 0,1 nanoampères in het hoofdvenster van het programma. Stel op het hoofdtabblad van het HD-venster de scanparameters in die geschikt zijn voor het bestudeerde monster. Open vervolgens het tabblad Geluiden in het HD-venster en voer de resonantiefrequentie van de cantilever in.Open het tabblad Quant van het HD-venster en voer de IOS, vrijdragende stijfheid, tipradius en hoek in. Selecteer het contactmodel, dat wordt gebruikt voor berekeningen afhankelijk van de tipgeometrie. Open hierna het tabblad Scannen van het HD-venster en selecteer de signalen, evenals de richting waarin het signaal wordt opgenomen.Vink het vakje Force Volume aan om een record van alle krachtcurven te krijgen en klik op de uit-knop bovenaan het hoofdprogrammavenster om de feedbacklus in te schakelen Klik op de Phase Core-knop in het hoofdvenster van HD om de gevoeligheid van het optische systeem te corrigeren. Het tabblad Versus Time van het hoofdvenster van HD presenteert de functie van het DFL-signaal versus tijd in realtime. Selecteer de delen van deze functie die worden gebruikt voor de bepaling van het basislijnniveau en voor het contactmodel voor verdere berekeningen.Stel nu de scanpuntwaarde in op 256 bij 256 in het hoofdvenster van het programma. Stel vervolgens de scansnelheid in op 0,2 hertz en klik op de knop Uitvoeren om het monster te scannen. Nadat het scannen is gestopt, klikt u op de knop Aan boven aan het hoofdvenster om de feedbacklus uit te schakelen.Kies Contactmodus in het vervolgkeuzemenu, open het tabblad Nadering en klik op de knop Verwijderen om het voorbeeld in te trekken. Klik op de knop Gegevens om de analysesoftware te openen en de uitvoer op te slaan. Open het opgeslagen bestand in de analysesoftware.Selecteer het hd-force volumeframe. Houd de Control-toets ingedrukt en selecteer één visueel frame dat in dezelfde scanrichting is verkregen. Klik op de knop Externe kaart laden om te zien waar de celwanden zich bevinden.Controleer de waarden voor InvOptSens en de uitkragende stijfheid op het hoofdtabblad. Open het tabblad Extra en controleer de tipparameters en het contactmodel. Klik op verschillende punten op de celwanden in het visuele kader en selecteer alleen die curven die goed worden beschreven door het model.De witte gebieden in de moduluskaart komen overeen met een onjuiste overschatting van Young's modulus omdat de scanner zijn limiet in de Z-richting bereikt. Deze afbeelding is niet handig om te worden gebruikt als een externe kaart voor een verdere selectie van bevredigende krachtcurven. De DFL-signaalkaart aan de rechterkant is hier echter beter geschikt.Verschillende instrumenten kunnen verwijzen naar DFL-signalen als afbuigings- of foutsignalen. De scanner die volledig is uitgeschoven terwijl hij de bodem van het monster probeert te bereiken, kan resulteren in foutieve metingen en zelfs onderbroken scans. De aanwezigheid van agarose kan worden gecontroleerd tijdens het verkrijgen van de eerste scan in de contactmodus, omdat de celwanden en sommige celbodems zichtbaar zijn op dergelijke scans.In geval van onnauwkeurige immobilisatie kan het oppervlak echter worden bedekt met agarose, wat de monstertopografie maskeert. Van de vier verschillende krachtcurven die op verschillende punten van dezelfde celwand zijn geregistreerd, toont de curve die is geregistreerd op 0,1 geen basislijn, wat betekent dat de uitkragingpunt niet van de celwand wordt gescheiden. De curve geregistreerd op 0,3 toont een schouder op het naderende deel dat wijst op het buigen van de celwand.De punten twee en vier tonen bevredigende krachtcurven met vergelijkbare moduli-waarden. Monstervoorbereiding en -onderzoek vereisen oefening, maar het kan onder de knie worden. Een cruciaal onderdeel van dit protocol is het filteren van resulterende curves.Vertrouw niet op moduli, die automatisch zijn berekend. Dezelfde techniek kan worden gebruikt om de adhesiekrachten of energiedissipatie te meten. Het kan ook belangrijk zijn voor de beschrijving van viscose of visco-elastisch gedrag van sommige materialen.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Het meten van Plant Cell muur Extension (Creep) geïnduceerd door zure pH en door Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Live-cel respons op mechanische stimulatie onderzocht door Integrated Optical en Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cel Vorm wijzigen in Living Drosophila Embryo&#39;s

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Micro-mechanische karakterisatie van Lung weefsel met behulp van Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

Biofysische Testen om de mechanische eigenschappen van de interfase celkern Probe: Basismateriaal Strain Toepassing en micronaaldjes Manipulatie

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Het identificeren van doelen van Human microRNA&#39;s met de LightSwitch Luciferase Assay System met behulp van 3&#39;UTR-reporter constructen en een microRNA Mimic in hechtende cellen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Glycaan Profilering van Plant celwandpolymeren met behulp van Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Monstervoorbereiding voor single virion atomic force microscopie en superresolutie fluorescentie beeldvorming

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Gelijktijdige meting van de pH in Endocytische en Cytosolic compartimenten in levende cellen met behulp van confocale microscopie

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Hoge resolutie Kwantificering van kristallijne cellulose accumulatie in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots aan Tissue-specifieke celwand Wijzigingen Monitor

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...