Name: characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
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Wir danken Dr. Dmitry Suslov (Staatliche Universität Sankt Petersburg, Sankt Petersburg, Russland) und Prof. Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Russland) für die Bereitstellung von Maissaatgut bzw. Roggensaatgut. Die vorgestellte Methode wurde im Rahmen des an LK vergebenen Projekts der Russian Science Foundation Nr. 18-14-00168 entwickelt. Der Teil der Arbeit (Einholung der vorgestellten Ergebnisse) wurde von AP mit finanzieller Unterstützung des Regierungsauftrags für das FRC Kazan Scientific Center der RAS durchgeführt.

1. Probenvorbereitung für AFM-Messungen
<ol><li>Pflanzenmaterial: Die Samen von Mais (Zea mays L.) und Roggen (Secale cereale L.) mit einer 0,35%igen NaOCl-Lösung für 10 min sterilisieren, 3x mit destilliertem Wasser waschen und dann hydroponisch im Dunkeln bei 27 °C für 4 bzw. 2 Tage anbauen. Für das Experiment wurden Primärwurzeln verwendet.</li>
	<li>Vorbereitung von Lösungen und Proben für die Vibratomsektion<ol><li>Agaroselösung für die Wurzeleinbettung vorbereiten, in...

<ol>
	<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties.">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).</li><li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> Plos One. 8 (3), 57813 (2013).</li><li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy.">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).</li><li>Daher, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+growth+is+achieved+through+the+additive+mechanical+effect+of+material+anisotropy+and+elastic+asymmetry.">Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry.</a> Elife. 7, 38161 (2018).</li><li>Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+growth+symmetry+breaking+in+the+Arabidopsis+hypocotyl.">The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl.</a> Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).</li><li>Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+of+cell+wall+nano-mechanical+properties+along+and+across+elongating+primary+roots+of+maize.">Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).</li><li>Chiniquy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+novel+rice+genes+closely+related+to+the+Arabidopsis+IRX9,+IRX9L,+and+IRX14+genes+and+their+roles+in+xylan+biosynthesis.">Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Bidhendi, A. J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+quantify+primary+plant+cell+wall+mechanics.">Methods to quantify primary plant cell wall mechanics.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).</li><li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+Mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls:+at+tissue,+cellular,+and+subcellular+resolutions.">AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+by+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li><li>Yakubov, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nano-scale+mechanical+heterogeneity+of+primary+plant+cell+walls.">Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).</li><li>Zdunek, A., Kurenda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+elastic+properties+of+tomato+fruit+cells+with+an+atomic+force+microscope.">Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope.</a> Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).</li><li>Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+water+content+has+a+direct+effect+on+extensibility+in+growing+hypocotyls+of+sunflower+(Helianthus+annuus+L).">Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L).</a> Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).</li><li>Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+mapping+of+soft+materials+with+the+atomic+force+microscope:+methods,+theory+and+applications.">Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications.</a> Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).</li><li>Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+primary+cell+wall+nanomechanical+properties+in+internal+cells+of+non-fixed+maize+roots.">Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots.</a> Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).</li><li>Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+atomic+force+microscopy+to+measure+mechanical+properties+and+turgor+pressure+of+plant+cells+and+plant+tissues.">Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology.">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).</li><li>Braunsmann, C., Schaffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Note:+Artificial+neural+networks+for+the+automated+analysis+of+force+map+data+in+atomic+force+microscopy.">Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).</li></ol>

Die mechanischen Eigenschaften der primären Zellwände bestimmen die Richtung und Geschwindigkeit des Pflanzenzellwachstums und damit die zukünftige Größe und Form der Pflanze. Die hier vorgestellte AFM-basierte Methode ergänzt bestehende Techniken, mit denen die Eigenschaften pflanzlicher Zellwände untersucht werden. Es ermöglicht es, die Elastizität von Zellwänden zu untersuchen, die zu den inneren Geweben der Pflanze gehören. Mit der vorgestellten Methode wurden die mechanischen Eigenschaften von Zellwänden...

Die mechanischen Eigenschaften der pflanzlichen Zellwand bestimmen die Form der Zelle und ihre Wachstumsfähigkeit. Zum Beispiel ist die wachsende Spitze des Pollenschlauches weicher als die nicht wachsenden Teile derselben Röhre1. Der Primordia-Bildung auf Arabidopsis meristem geht eine lokale Abnahme der Zellwandsteifigkeit an der Stelle des zukünftigen Primordiums 2,3 voraus. Die Zellwände von Arabidopsis hypocotyl, die parallel zur Hauptwachstumsachse verlaufen und schneller wachsen, sind weicher als diejenigen, die senkrecht zu dieser Achse stehen und langsamer wachsen 4,5. In der Maiswurzel ging der Übergang der Zellen von der Teilung zur Dehnung mit einer Abnahme der Elastizitätsmodule in allen Geweben der Wurzel einher. Die Module blieben in der Dehnungszone niedrig und nahmen in der späten Dehnungszone6 zu.
Trotz der Verfügbarkeit verschiedener Methoden werden die großen biochemischen und genetischen Informationen zur Zellwandbiologie, die jährlich gewonnen werden, selten mit den mechanischen Eigenschaften der Zellwände verglichen. Zum Beispiel haben Mutanten auf Zellwand-verwandten Genen oft verändertes Wachstum und Entwicklung 4,7,8, werden aber selten biomechanisch beschrieben. Einer der Gründe dafür ist die Schwierigkeit, Messungen auf zellulärer und subzellulärer Ebene durchzuführen. Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist derzeit der primäre Ansatz für solche Analysen9.
In den letzten Jahren wurden zahlreiche AFM-basierte Studien zur Biomechanik pflanzlicher Zellwände durchgeführt. Die mechanischen Eigenschaften der Zellwände der äußeren Gewebe von Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 und Zwiebel 12 sowie von kultivierten Zellen 13,14,15 wurden untersucht. Die oberflächlichen Zellen einer Pflanze können jedoch Zellwände aufweisen, deren mechanische Eigenschaften sich von denen der inneren Gewebe unterscheiden6. Darüber hinaus werden Pflanzenzellen durch Turgor unter Druck gesetzt, was sie steifer macht. Um den Einfluss des Turgordrucks loszuwerden, müssen die Forscher Plasmolyselösungen 2,3,4,5,10,11 verwenden oder die erhaltenen Werte in Turgor- und Zellwandbeiträgezerlegen 12. Der erste Ansatz führt zur Dehydratisierung der Probe und verändert die Dicke und Eigenschaften der Zellwand16, während der zweite Ansatz zusätzliche Messungen und komplizierte Mathematik erfordert und nur für Zellen der relativ einfachen Form12 gilt. Die Zellwandeigenschaften von inneren Geweben können an Kryosektionen17 oder mitHarz 8 imprägnierten Pflanzenmaterialabschnitten bewertet werden. Beide Methoden beinhalten jedoch eine Dehydratisierung und/oder Imprägnierung von Proben, was unweigerlich zu Veränderungen der Eigenschaften führt. Die Eigenschaften isolierter oder kultivierter Zellen lassen sich schwer mit der Physiologie der gesamten Pflanze in Verbindung bringen. Sowohl die Kultivierung als auch die Isolierung von Pflanzenzellen können die mechanischen Eigenschaften ihrer Zellwände beeinflussen.
Die hier vorgestellte Methode ergänzt die oben genannten Ansätze. Damit können die primären Zellwände jedes Gewebes und in jedem Stadium der Pflanzenentwicklung untersucht werden. Schnitt- und AFM-Beobachtungen wurden in Flüssigkeit durchgeführt, wodurch eine Austrocknung der Probe vermieden wird. Das Problem des Turgors wurde gelöst, wenn die Zellen geschnitten werden. Das Protokoll beschreibt die Arbeit mit Mais- und Roggenwurzeln, aber jede andere Probe kann untersucht werden, ob sie für das Schneiden von Vibratomen geeignet ist.
Die hier beschriebenen AFM-Studien wurden mit der Kraft-Volumen-Technik durchgeführt. Verschiedene Instrumente verwenden unterschiedliche Namen für diese Methode. Das Grundprinzip ist jedoch dasselbe; Eine Kraft-Volumen-Karte der Probe wird durch eine sinusförmige oder dreieckige Bewegung des Cantilevers (oder der Probe) erhalten, um an jedem analysierten Punkt eine bestimmte Belastungskraft zu erreichen, während die Cantilever-Auslenkung18 aufgezeichnet wird. Das Ergebnis kombiniert ein topographisches Bild der Oberfläche und die Anordnung von Kraft-Weg-Kurven. Jede Kurve wird verwendet, um die Verformung, Steifigkeit, Elastizitätsmodul, Adhäsion und Energiedissipation an einem bestimmten Punkt zu berechnen. Ähnliche Daten können durch Punkt-für-Punkt-Kraftspektroskopie nach dem Scannen im Kontaktmodus19 gewonnen werden, obwohl dies zeitaufwendiger ist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose, low melting point</td>
			<td>Helicon</td>
			<td>B-5000-0.1</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for section moving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NanoTools, Germany</td>
			<td>NT_B150_v0020-5</td>
			<td>Model: Biosphere B150-FM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>FMG01/50</td>
			<td>Model: FMG01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for vibratomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Heinz Herenz</td>
			<td>1042000</td>
			<td>for vibratomy and AFM calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageAnalysis P9 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM1000 epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>11591301</td>
			<td>for section check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova PX 3.4.1 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for experiments conducting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTEGRA Prima microscope with HD controller</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for AFM and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642062</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Leica VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>1404723512</td>
			<td>for sample sectioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy

Die mechanischen Eigenschaften der primären Zellwände bestimmen die Richtung und Geschwindigkeit des Pflanzenzellwachstums und damit die zukünftige Größe und Form der Pflanze. Viele ausgeklügelte Techniken wurden entwickelt, um diese Eigenschaften zu messen; Die Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist jedoch nach wie vor am besten geeignet, um die Elastizität der Zellwand auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Eine der wichtigsten Einschränkungen dieser Technik war, dass nur oberflächliche oder isolierte lebende Zellen untersucht werden können. Hier wird die Verwendung der Rasterkraftmikroskopie zur Untersuchung der mechanischen Eigenschaften von primären Zellwänden vorgestellt, die zu den inneren Geweben eines Pflanzenkörpers gehören. Dieses Protokoll beschreibt Messungen des scheinbaren Elastizitätsmoduls von Zellwänden in Wurzeln, aber die Methode kann auch auf andere Pflanzenorgane angewendet werden. Die Messungen werden an vibratom-abgeleiteten Abschnitten von Pflanzenmaterial in einer flüssigen Zelle durchgeführt, was (i) die Verwendung von Plasmolyselösungen oder Probenimprägnierung mit Wachs oder Harz vermeidet, (ii) die Experimente schnell macht und (iii) eine Austrocknung der Probe verhindert. Je nachdem, wie die Probe geschnitten wurde, können sowohl antiklinale als auch periklinale Zellwände untersucht werden. Unterschiede in den mechanischen Eigenschaften verschiedener Gewebe können in einem einzigen Abschnitt untersucht werden. Das Protokoll beschreibt die Prinzipien der Studienplanung, Probleme bei der Probenvorbereitung und den Messungen sowie die Methode zur Auswahl von Kraft-Verformungskurven, um den Einfluss der Topographie auf die erhaltenen Werte des Elastizitätsmoduls zu vermeiden. Die Methode ist nicht durch die Stichprobengröße begrenzt, sondern empfindlich gegenüber der Zellgröße (dh Zellen mit einem großen Lumen sind schwer zu untersuchen).

Typische Elastizitätsmodul- und DFL-Kennfelder sowie Kraftkurven, die nach dem beschriebenen Verfahren an Roggen- und Maiswurzeln ermittelt wurden, sind in Abbildung 2 dargestellt. Abbildung 2A zeigt Elastizitätsmodul- und DFL-Karten, die auf dem Querschnitt der Roggenprimärwurzel erhalten wurden. Die weißen Bereiche in der Modulkarte (Abbildung 2A, links) entsprechen einer fehlerhaften Überschätzung des Elastizitätsmoduls, d...

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Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

Studien der Zellwandbiomechanik sind essentiell für das Verständnis des Pflanzenwachstums und der Morphogenese. Das folgende Protokoll wird vorgeschlagen, um dünne primäre Zellwände in den inneren Geweben junger Pflanzenorgane mittels Rasterkraftmikroskopie zu untersuchen.

Charakterisierung mechanischer Eigenschaften der primären Zellwand in lebenden Pflanzenorganen mittels Rasterkraftmikroskopie

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

Das Wachstum pflanzlicher Zellen wird durch die mechanischen Eigenschaften ihrer Zellwände gesteuert. Daher ist es wichtig, diese Eigenschaften in verschiedenen Organen und Geweben der Pflanzen zu kennen. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die biomechanische Charakterisierung von nicht fixierten und nicht dehydrierten Zellwänden im inneren Gewebe junger Pflanzen.Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Lösungen und der Probe für die Vibratomschnitte. Gießen Sie eine vier Millimeter dicke Schicht geschmolzener 3%Agarose auf den Boden der Petrischale und lassen Sie sie leicht abkühlen, um thermische Schäden an der Probe zu vermeiden. Legen Sie etwa fünf Millimeter lange drei oder vier Stücke des Pflanzenorgans horizontal auf die Agarose.Etwa 30 bis 60 Sekunden später erscheint ein dünner halbfester Film auf der ersten Agaroseschicht. Dann gießen Sie vorsichtig eine zweite Schicht darüber. Nachdem die Agarose vollständig erstarrt ist, schneiden Sie den Block mit der Probe aus.Formen Sie den Block zu einer sechseckigen Pyramidenstumpfpyramide, um seine Stabilität während des weiteren Schneidens zu gewährleisten. Bevor Sie mit dem Probenschnitt mit dem Vibratom beginnen, kleben Sie den Block mit Cyanacrylatkleber auf die Vibratomstufe. Stellen Sie die Bühne in das Vibratom, so dass eine der Pyramidenecken der Klinge des Vibratoms zugewandt ist, und gießen Sie Wasser in das Vibratombad.Stellen Sie die Schnittparameter wie Profildicke, Schaufelgeschwindigkeit und Vibrationsfrequenz ein und schneiden Sie die Probe. Bewegen Sie den Abschnitt mit einer feinen Bürste aus dem Wasserbad auf einen Glasobjektträger und legen Sie einen Tropfen Wasser auf den Abschnitt, um ein Austrocknen zu verhindern. Nachdem Sie die Qualität des Schnitts unter einem Lichtmikroskop überprüft haben, wählen Sie den richtigen Abschnitt mit einer Zellwand senkrecht zur Schnittebene.Dann immobilisieren Sie den Abschnitt für Rasterkraftmikroskopie-Messungen, indem Sie eine Schicht von einem Milliliter 1% geschmolzener Agarose mit einer Pipette auf den Boden der Petrischalenkappe gießen. Nachdem die Agarose erstarrt ist, entfernen Sie überschüssiges Wasser aus dem Abschnitt, indem Sie Filterpapier an den Rand bringen. Übertragen Sie den Abschnitt vom Objektträger vorsichtig mit einem Pinsel in die Mitte der Petrischalenkappe.Dann geben Sie vorsichtig 1% Agarose mit einer 20-Mikroliter-Pipette um den Abschnitt und gießen Sie das Wasser oder eine andere Lösung für die Rasterkraftmikroskopie in die Petrischale mit dem immobilisierten Abschnitt. Führen Sie die Probe unter dem Rasterkraftmikroskop mit dem Lichtmikroskop. Klicken Sie auf die Schaltfläche Anflug und dann auf die Schaltfläche Lande, um sich der Probe im Kontaktmodus mit einem Sollwert von einem Nanoampere zu nähern.Klicken Sie auf die Schaltfläche Scannen und dann auf die Schaltfläche Bereich. Wählen Sie die Bereichsgröße von 50 Mikrometern mal 50 Mikrometern zum Scannen aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Move Probe und überprüfen Sie den gesamten Scanbereich, indem Sie den Scanner darüber bewegen und den höchsten Punkt basierend auf dem Grad des Scannervorsprungs finden.Öffnen Sie die Registerkarte Ansatz. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Entfernen, um das Beispiel zurückzuziehen. Wenn Sie den höchsten Punkt als Ziel verwenden, klicken Sie auf die Schaltfläche Landing, um sich der Probe erneut zu nähern.Überprüfen Sie dann die Oberfläche erneut, indem Sie auf die Schaltfläche Move Probe klicken und den Scanner darüber bewegen. Stellen Sie die Scanrate auf 0,5 Hertz, die Scangröße auf 50 Mikrometer x 50 Mikrometer und den Scanpunkt auf 64 x 64 ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen und scannen Sie, um die Oberfläche der Probe und ihre mögliche Kontamination mit Agarose zu überprüfen.Nachdem Sie auf die Schaltfläche Ein geklickt haben, wählen Sie den HDPlus-Modus im Dropdown-Menü im Hauptfenster des Programms und stellen Sie den Sollwert im Hauptprogrammfenster auf 0,1 Nanoampere ein. Stellen Sie auf der Hauptregisterkarte des HD-Fensters die Scanparameter entsprechend der untersuchten Probe ein. Öffnen Sie dann die Registerkarte Geräusche im HD-Fenster und geben Sie die Resonanzfrequenz des Auslegers ein.Öffnen Sie die Registerkarte Quant des HD-Fensters und geben Sie IOS, Cantilever-Steifigkeit, Spitzenradius und Winkel ein. Wählen Sie das Kontaktmodell aus, das für Berechnungen in Abhängigkeit von der Spitzengeometrie verwendet wird. Öffnen Sie anschließend die Registerkarte Scan des HD-Fensters und wählen Sie die Signale sowie die Richtung aus, in der das Signal aufgezeichnet wird.Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Kraftlautstärke, um eine Aufzeichnung aller Kraftkurven zu erhalten, und klicken Sie auf die Schaltfläche Aus oben im Hauptprogrammfenster, um die Rückkopplungsschleife einzuschalten. Klicken Sie auf die Schaltfläche Phase Core im HD-Hauptfenster, um die Empfindlichkeit des optischen Systems zu korrigieren. Auf der Registerkarte "Versus Time" des HD-Hauptfensters wird die Funktion des DFL-Signals "Versus Time" in Echtzeit angezeigt. Wählen Sie die Teile dieser Funktion aus, die für die Ermittlung der Basisebene verwendet werden und das Kontaktmodell für weitere Berechnungen anpassen sollen.Stellen Sie nun den Scanpunktwert im Hauptfenster des Programms auf 256 x 256 ein. Stellen Sie dann die Scanrate auf 0,2 Hertz ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen, um die Probe zu scannen. Nachdem der Scanvorgang beendet ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Ein oben im Hauptfenster, um die Rückkopplungsschleife auszuschalten.Wählen Sie im Dropdown-Menü Kontaktmodus, öffnen Sie die Registerkarte Ansatz und klicken Sie auf die Schaltfläche Entfernen, um das Beispiel zurückzuziehen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Daten, um die Analysesoftware zu öffnen und die Ausgabe zu speichern. Öffnen Sie die gespeicherte Datei in der Analysesoftware.Wählen Sie den HD-Force-Lautstärkerahmen aus. Halten Sie die Strg-Taste gedrückt und wählen Sie einen visuellen Rahmen aus, der in derselben Scanrichtung angezeigt wird. Klicken Sie auf die Schaltfläche Externe Karte laden, um zu sehen, wo sich die Zellwände befinden.Überprüfen Sie die Werte für InvOptSens- und Cantilever-Steifigkeit in der Hauptregisterkarte. Öffnen Sie die Registerkarte Erweitert und überprüfen Sie die Tippparameter und das Kontaktmodell. Klicken Sie auf verschiedene Punkte an den Zellwänden des visuellen Rahmens und wählen Sie nur die Kurven aus, die vom Modell gut beschrieben werden.Die weißen Bereiche in der Modulkarte entsprechen einer fehlerhaften Überschätzung des Elastizitätsmoduls, da der Scanner seine Grenze in Z-Richtung erreicht. Dieses Bild eignet sich nicht als externe Karte für eine weitere Auswahl zufriedenstellender Kraftkurven. Hier ist jedoch die rechts dargestellte DFL-Signalkarte besser geeignet.Verschiedene Instrumente können DFL-Signale als Durchbiegungs- oder Fehlersignale bezeichnen. Der Scanner, der beim Versuch, den Boden der Probe zu erreichen, vollständig ausgefahren wurde, kann zu fehlerhaften Messungen und sogar zu unterbrochenen Scans führen. Das Vorhandensein von Agarose kann während des ersten Scans im Kontaktmodus überprüft werden, da die Zellwände und einige Zellböden auf solchen Scans sichtbar sind.Im Falle einer ungenauen Immobilisierung kann die Oberfläche jedoch mit Agarose bedeckt sein, die die Probentopographie maskiert. Von vier verschiedenen Kraftkurven, die an verschiedenen Punkten derselben Zellwand aufgezeichnet wurden, zeigt die bei 0,1 aufgezeichnete Kurve keine Basislinie, d.h. keine Trennung der Cantileverspitze von der Zellwand. Die bei 0,3 aufgezeichnete Kurve zeigt eine Schulter auf dem sich nähernden Teil, die eine Biegung der Zellwand anzeigt.Die Punkte zwei und vier zeigen zufriedenstellende Kraftkurven mit ähnlichen Modulwerten. Probenvorbereitung und -untersuchung erfordern Übung, können aber gemeistert werden. Ein entscheidender Teil dieses Protokolls ist das Filtern der resultierenden Kurven.Verlassen Sie sich nicht auf Moduli, die automatisch berechnet wurden. Die gleiche Technik kann verwendet werden, um die Adhäsionskräfte oder die Energiedissipation zu messen. Es kann auch wichtig für die Beschreibung des viskosen oder viskoelastischen Verhaltens einiger Materialien sein.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Messen pflanzlichen Zellwand Extension (Creep) durch saure pH-Wert und von Alpha-Expansin Induced

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

Forschung

Biologie

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Live Cell Reaktion auf mechanische Stimulation von Integrated Optical und Atomic Force Microscopy Studium

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Zellgröße Veränderung der Lebens- Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Micro-Mechanische Charakterisierung von Lungengewebe mit Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

Biophysikalische Assays auf die mechanischen Eigenschaften der Interphase Zellkern Probe: Substrat Dehnungs-Anwendung und Mikronadel Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Identifizierung von Zielen für Menschenrechte microRNAs mit dem LightSwitch Luciferase Assay System mit 3&#39;UTR-Reporter-Konstrukte und eine microRNA Mimic in adhärenter Zellen

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers mit Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Probenvorbereitung für Single Virion Atomic Force Microscopy und Super-Resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Gleichzeitige pH-Messung in endozytischen und Cytosolic Fächer in lebenden Zellen mittels konfokaler Mikroskopie

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Hohe Auflösung Quantifizierung kristalliner Cellulose Akkumulation in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots Gewebespezifische Zellwand Änderungen überwachen

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...