Name: characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
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Vorremmo ringraziare il Dr. Dmitry Suslov (Università statale di San Pietroburgo, San Pietroburgo, Russia) e la Prof.ssa Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Russia) per aver fornito semi di mais e segale, rispettivamente. Il metodo presentato è stato sviluppato nell'ambito del progetto della Fondazione scientifica russa n. 18-14-00168 assegnato a LK. La parte del lavoro (ottenimento dei risultati presentati) è stata eseguita da AP con il sostegno finanziario dell'incarico governativo per il FRC Kazan Scientific Center di RAS.

1. Preparazione del campione per le misurazioni AFM
<ol><li>Materiale vegetale: Sterilizzare i semi di mais (Zea mays L.) e segale (Secale cereale L.) con una soluzione di NaOCl allo 0,35% per 10 minuti, lavare 3 volte con acqua distillata e quindi crescere idroponicamente al buio a 27 °C per 4 giorni e 2 giorni, rispettivamente. Per l'esperimento sono state utilizzate radici primarie.</li>
	<li>Preparazione di soluzioni e campioni per il sezionamento di vibratome<ol><li>Preparare la...

<ol>
	<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties.">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).</li><li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> Plos One. 8 (3), 57813 (2013).</li><li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy.">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).</li><li>Daher, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+growth+is+achieved+through+the+additive+mechanical+effect+of+material+anisotropy+and+elastic+asymmetry.">Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry.</a> Elife. 7, 38161 (2018).</li><li>Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+growth+symmetry+breaking+in+the+Arabidopsis+hypocotyl.">The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl.</a> Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).</li><li>Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+of+cell+wall+nano-mechanical+properties+along+and+across+elongating+primary+roots+of+maize.">Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).</li><li>Chiniquy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+novel+rice+genes+closely+related+to+the+Arabidopsis+IRX9,+IRX9L,+and+IRX14+genes+and+their+roles+in+xylan+biosynthesis.">Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Bidhendi, A. J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+quantify+primary+plant+cell+wall+mechanics.">Methods to quantify primary plant cell wall mechanics.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).</li><li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+Mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls:+at+tissue,+cellular,+and+subcellular+resolutions.">AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+by+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li><li>Yakubov, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nano-scale+mechanical+heterogeneity+of+primary+plant+cell+walls.">Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).</li><li>Zdunek, A., Kurenda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+elastic+properties+of+tomato+fruit+cells+with+an+atomic+force+microscope.">Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope.</a> Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).</li><li>Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+water+content+has+a+direct+effect+on+extensibility+in+growing+hypocotyls+of+sunflower+(Helianthus+annuus+L).">Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L).</a> Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).</li><li>Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+mapping+of+soft+materials+with+the+atomic+force+microscope:+methods,+theory+and+applications.">Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications.</a> Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).</li><li>Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+primary+cell+wall+nanomechanical+properties+in+internal+cells+of+non-fixed+maize+roots.">Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots.</a> Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).</li><li>Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+atomic+force+microscopy+to+measure+mechanical+properties+and+turgor+pressure+of+plant+cells+and+plant+tissues.">Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology.">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).</li><li>Braunsmann, C., Schaffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Note:+Artificial+neural+networks+for+the+automated+analysis+of+force+map+data+in+atomic+force+microscopy.">Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).</li></ol>

Le proprietà meccaniche delle pareti cellulari primarie determinano la direzione e il tasso di crescita delle cellule vegetali e quindi le dimensioni e la forma future della pianta. Il metodo basato sull'AFM qui presentato integra le tecniche esistenti utilizzate per studiare le proprietà delle pareti cellulari delle piante. Permette di studiare l'elasticità delle pareti cellulari, che appartengono ai tessuti interni della pianta. Utilizzando il metodo presentato, sono state mappate le proprietà meccaniche delle pare...

Le proprietà meccaniche della parete cellulare della pianta determinano la forma della cellula e la sua capacità di crescere. Ad esempio, la punta crescente del tubo pollinico è più morbida delle parti non in crescita dello stesso tubo1. La formazione dei primordi sul meristema di Arabidopsis è preceduta da una diminuzione locale della rigidità della parete cellulare nel sito del futuro primordio 2,3. Le pareti cellulari di Arabidopsis hypocotyl, che sono parallele all'asse di crescita principale e crescono più velocemente, sono più morbide di quelle che sono perpendicolari a questo asse e crescono più lentamente 4,5. Nella radice di mais, la transizione delle cellule dalla divisione all'allungamento è stata accompagnata da una diminuzione dei moduli elastici in tutti i tessuti della radice. I moduli sono rimasti bassi nella zona di allungamento e sono aumentati nella zona di allungamento tardivo6.
Nonostante la disponibilità di vari metodi, le grandi matrici di informazioni biochimiche e genetiche sulla biologia della parete cellulare ottenute annualmente sono raramente confrontate con le proprietà meccaniche delle pareti cellulari. Ad esempio, i mutanti sui geni correlati alla parete cellulare hanno spesso una crescita e uno sviluppo alterati 4,7,8, ma sono raramente descritti in termini di biomeccanica. Una delle ragioni di ciò è la difficoltà di condurre misurazioni a livello cellulare e subcellulare. La microscopia a forza atomica (AFM) è attualmente l'approccio principale per tali analisi9.
Negli ultimi anni sono stati condotti numerosi studi basati sull'AFM sulla biomeccanica della parete cellulare vegetale. Sono state studiate le proprietà meccaniche delle pareti cellulari dei tessuti esterni di Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 e cipolla 12, nonché delle cellule in coltura 13,14,15. Tuttavia, le cellule superficiali di una pianta possono avere pareti cellulari le cui proprietà meccaniche differiscono da quelle dei tessuti interni6. Inoltre, le cellule vegetali sono pressurizzate dal turgore che le rende più rigide. Per eliminare l'influenza della pressione del turgore, i ricercatori devono utilizzare soluzioni plasmolizzanti 2,3,4,5,10,11 o decomporre i valori ottenuti in turgore e contributi della parete cellulare 12. Il primo approccio porta alla disidratazione del campione e modifica lo spessore e le proprietà della parete cellulare16, mentre il secondo approccio richiede ulteriori misurazioni e matematica complicata e si applica solo a cellule di forma relativamente semplice12. Le proprietà della parete cellulare dei tessuti interni possono essere valutate su criosezioni17 o sezioni di materiale vegetale impregnato di resina8. Tuttavia, entrambi i metodi comportano la disidratazione e / o l'impregnazione dei campioni, che porta inevitabilmente a cambiamenti nelle proprietà. Le proprietà delle cellule isolate o in coltura sono difficili da mettere in relazione con la fisiologia dell'intera pianta. Sia la coltivazione che l'isolamento delle cellule vegetali possono influenzare le proprietà meccaniche delle loro pareti cellulari.
Il metodo qui presentato integra gli approcci sopra menzionati. Usandolo, è possibile esaminare le pareti cellulari primarie di qualsiasi tessuto e in qualsiasi fase dello sviluppo delle piante. Le osservazioni di sezionamento e AFM sono state eseguite in liquido che evita la disidratazione del campione. Il problema del turgore è stato risolto quando le cellule vengono tagliate. Il protocollo descrive il lavoro con le radici di mais e segale, ma qualsiasi altro campione può essere esaminato se è adatto per il sezionamento del vibratomo.
Gli studi AFM qui descritti sono stati eseguiti utilizzando la tecnica forza-volume. Strumenti diversi usano nomi diversi per questo metodo. Tuttavia, il principio di base è lo stesso; Una mappa forza-volume del campione è ottenuta da un movimento sinusoidale o triangolare del cantilever (o campione) per ottenere una certa forza di carico in ogni punto analizzato, registrando la deflessione a sbalzo18. Il risultato combina un'immagine topografica della superficie e la serie di curve forza-distanza. Ogni curva viene utilizzata per calcolare la deformazione, la rigidità, il modulo di Young, l'adesione e la dissipazione di energia in un punto specifico. Dati simili possono essere ottenuti mediante spettroscopia di forza punto per punto dopo la scansione in modalità di contatto19, sebbene richieda più tempo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose, low melting point</td>
			<td>Helicon</td>
			<td>B-5000-0.1</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for section moving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NanoTools, Germany</td>
			<td>NT_B150_v0020-5</td>
			<td>Model: Biosphere B150-FM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>FMG01/50</td>
			<td>Model: FMG01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for vibratomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Heinz Herenz</td>
			<td>1042000</td>
			<td>for vibratomy and AFM calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageAnalysis P9 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM1000 epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>11591301</td>
			<td>for section check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova PX 3.4.1 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for experiments conducting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTEGRA Prima microscope with HD controller</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for AFM and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642062</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Leica VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>1404723512</td>
			<td>for sample sectioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy

Le proprietà meccaniche delle pareti cellulari primarie determinano la direzione e il tasso di crescita delle cellule vegetali e, quindi, le dimensioni e la forma future della pianta. Molte tecniche sofisticate sono state sviluppate per misurare queste proprietà; tuttavia, la microscopia a forza atomica (AFM) rimane la più conveniente per studiare l'elasticità della parete cellulare a livello cellulare. Uno dei limiti più importanti di questa tecnica è stato che solo le cellule viventi superficiali o isolate possono essere studiate. Qui viene presentato l'uso della microscopia a forza atomica per studiare le proprietà meccaniche delle pareti cellulari primarie appartenenti ai tessuti interni di un corpo vegetale. Questo protocollo descrive le misurazioni dell'apparente modulo di Young delle pareti cellulari nelle radici, ma il metodo può essere applicato anche ad altri organi vegetali. Le misure vengono eseguite su sezioni derivate dal vibratomo di materiale vegetale in una cella liquida, il che consente (i) di evitare l'uso di soluzioni plasmolizzanti o l'impregnazione del campione con cera o resina, (ii) di rendere gli esperimenti veloci e (iii) di prevenire la disidratazione del campione. Sia le pareti cellulari anticlinale che periclinale possono essere studiate, a seconda di come il campione è stato sezionato. Le differenze nelle proprietà meccaniche dei diversi tessuti possono essere studiate in una singola sezione. Il protocollo descrive i principi della pianificazione dello studio, i problemi con la preparazione e le misurazioni dei campioni, nonché il metodo di selezione delle curve di forza-deformazione per evitare l'influenza della topografia sui valori ottenuti del modulo elastico. Il metodo non è limitato dalla dimensione del campione, ma è sensibile alle dimensioni delle celle (cioè, le cellule con un grande lume sono difficili da esaminare).

I tipici moduli elastici e le mappe DFL, nonché le curve di forza ottenute sulle radici di segale e mais con il metodo descritto, sono presentati nella figura 2. La figura 2A mostra il modulo elastico e le mappe DFL ottenute sulla sezione trasversale della radice primaria di segale. Le aree bianche nella mappa del modulo (Figura 2A, a sinistra) corrispondono a una sovrastima errata del modulo di Young dovuta al raggiungimento del l...

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Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

Gli studi sulla biomeccanica della parete cellulare sono essenziali per comprendere la crescita e la morfogenesi delle piante. Il seguente protocollo è proposto per studiare le pareti cellulari primarie sottili nei tessuti interni di giovani organi vegetali utilizzando la microscopia a forza atomica.

Caratterizzazione delle proprietà meccaniche della parete cellulare primaria in organi vegetali viventi mediante microscopia a forza atomica

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

La crescita delle cellule vegetali è controllata dalle proprietà meccaniche delle loro pareti cellulari. Pertanto, è importante conoscere queste proprietà in diversi organi e tessuti delle piante. Il metodo qui presentato consente la caratterizzazione biomeccanica delle pareti cellulari non fisse e non disidratate nei tessuti interni delle giovani piante.Iniziare con la preparazione delle soluzioni e del campione per il sezionamento della vibratomia. Versare uno strato di quattro millimetri di agarosio fuso al 3% sul fondo della piastra di Petri e lasciarlo raffreddare leggermente per evitare danni termici al campione. Posizionare orizzontalmente sull'agarosio lunghi circa cinque millimetri tre o quattro pezzi dell'organo vegetale.Circa 30-60 secondi dopo, un sottile film semi-solido apparirà sopra il primo strato di agarosio. Quindi, versare con attenzione un secondo strato sopra. Dopo che l'agarosio è completamente solidificato, ritagliare il blocco contenente il campione.Modella il blocco in una piramide tronca esagonale per garantirne la stabilità durante l'ulteriore sezionamento. Prima di iniziare il sezionamento del campione con il vibratomo, incollare il blocco allo stadio vibratomo con adesivo cianoacrilato. Posiziona il palco nel vibratomo, in modo che uno degli angoli della piramide sia rivolto verso la lama del vibratomo e versa acqua nel bagno di vibratomo.Impostate i parametri di sezionamento come spessore della sezione, velocità della lama e frequenza di vibrazione e tagliate il campione. Utilizzando un pennello sottile, spostare la sezione dal bagno d'acqua su un vetrino e posizionare una goccia d'acqua sulla sezione per evitare che si secchi. Dopo aver controllato la qualità della sezione al microscopio ottico, selezionare la sezione appropriata con la parete cellulare perpendicolare al piano della sezione.Quindi immobilizzare la sezione per le misurazioni al microscopio a forza atomica versando uno strato di un millilitro di agarosio fuso all'1% sul fondo del cappuccio della piastra di Petri usando una pipetta. Dopo che l'agarosio si è solidificato, rimuovere l'acqua in eccesso dalla sezione portando la carta da filtro sul bordo. Trasferire con attenzione la sezione dal vetrino al centro del cappuccio della piastra di Petri usando un pennello.Quindi aggiungere con cautela l'1% di agarosio intorno alla sezione usando una pipetta da 20 microlitri e versare l'acqua o altra soluzione per la microscopia a forza atomica nel tappo della piastra di Petri con la sezione immobilizzata. Guidare il campione sotto il cantilever della microscopia a forza atomica usando il microscopio ottico. Fare clic sul pulsante Approach e quindi sul pulsante Landing per avvicinarsi al campione in modalità di contatto con un set point di un nanoampere.Fare clic sul pulsante Scansione e quindi sul pulsante Area. Selezionare la dimensione dell'area di 50 micrometri per 50 micrometri da scansionare. Fare clic sul pulsante Sposta sonda e controllare l'intera area di scansione spostando lo scanner su di esso e trovando il punto più alto in base al grado di protrusione dello scanner.Aprire la scheda Approccio. Quindi fare clic sul pulsante Rimuovi per ritrarre dal campione. Utilizzando il punto più alto come destinazione, fare clic sul pulsante Landing per avvicinarsi nuovamente al campione.Quindi controllare nuovamente la superficie facendo clic sul pulsante Sposta sonda e spostando lo scanner su di essa. Impostare la velocità di scansione su 0,5 hertz, quindi impostare la dimensione della scansione su 50 micrometri per 50 micrometri e il punto di scansione su 64 per 64. Fare clic sul pulsante Esegui e scansionare per verificare la superficie del campione ed è possibile contaminazione con agarosio.Dopo aver fatto clic sul pulsante On, scegli la modalità HDPlus nel menu a discesa nella finestra principale del programma e imposta il set point su 0,1 nanoampere nella finestra principale del programma. Nella scheda principale della finestra HD, impostare i parametri di scansione appropriati per il campione studiato. Quindi apri la scheda Rumori nella finestra HD e inserisci la frequenza di risonanza del cantilever .Apri la scheda Quant della finestra HD e inserisci IOS, rigidità a sbalzo, raggio della punta e angolo. Selezionare il modello di contatto, che verrà utilizzato per i calcoli in base alla geometria della punta. Successivamente, apri la scheda Scansione della finestra HD e seleziona i segnali, nonché la direzione in cui viene registrato il segnale.Spuntare la casella Force Volume per ottenere una registrazione di tutte le curve di forza e fare clic sul pulsante Off nella parte superiore della finestra principale del programma per attivare il ciclo di feedback Fare clic sul pulsante Phase Core nella finestra HD principale per correggere la sensibilità del sistema ottico. La scheda Tempo Versus della finestra HD principale presenta la funzione del segnale DFL rispetto al tempo in tempo reale. Selezionare le parti di questa funzione che verranno utilizzate per la determinazione del livello di base e per adattare il modello di contatto per ulteriori calcoli.Ora, imposta il valore del punto di scansione su 256 per 256 nella finestra principale del programma. Quindi, impostare la velocità di scansione su 0,2 hertz e fare clic sul pulsante Esegui per eseguire la scansione del campione. Dopo l'interruzione della scansione, fare clic sul pulsante On nella parte superiore della finestra principale per disattivare il ciclo di feedback.Scegliere Modalità contatto nel menu a discesa, aprire la scheda Approccio e fare clic sul pulsante Rimuovi per ritrarre dall'esempio. Fare clic sul pulsante Dati per aprire il software di analisi e salvare l'output. Aprire il file salvato nel software di analisi.Selezionare il fotogramma del volume forza HD. Tenere premuto il tasto Ctrl e selezionare un fotogramma visivo ottenuto nella stessa direzione di scansione. Fare clic sul pulsante Carica mappa esterna per vedere dove si trovano le pareti cellulari.Controllare i valori di rigidità InvOptSens e cantilever nella scheda principale. Apri la scheda Aggiuntivi e controlla i parametri della punta e il modello di contatto. Fate clic su vari punti delle pareti delle celle sulla cornice visiva e selezionate solo le curve ben descritte dal modello.Le aree bianche nella mappa del modulo corrispondono a una sovrastima errata del modulo di Young dovuta al raggiungimento del limite da parte dello scanner nella direzione Z. Questa immagine non è comoda per essere utilizzata come mappa esterna per un'ulteriore selezione di curve di forza soddisfacenti. Tuttavia, la mappa del segnale DFL presentata a destra è più adatta qui.Diversi strumenti possono riferirsi ai segnali DFL come segnali di deflessione o errore. Lo scanner che è stato completamente esteso durante il tentativo di raggiungere il fondo del campione può causare misurazioni errate e persino scansioni interrotte. La presenza di agarosio può essere controllata mentre si ottiene la prima scansione in modalità di contatto poiché le pareti cellulari e alcuni fondi cellulari sono visibili su tali scansioni.Tuttavia, in caso di immobilizzazione imprecisa, la superficie può essere coperta di agarosio, che maschera la topografia del campione. Su quattro diverse curve di forza registrate in punti diversi della stessa parete cellulare, la curva registrata a 0,1 non mostra alcuna linea di base, il che significa nessuna separazione della punta a sbalzo dalla parete cellulare. La curva registrata a 0,3 mostra una spalla sulla parte in avvicinamento che indica la flessione della parete cellulare.I punti due e quattro mostrano curve di forza soddisfacenti con valori di moduli simili. La preparazione e l'esame del campione richiedono pratica, ma possono essere padroneggiati. Una parte cruciale di questo protocollo è filtrare le curve risultanti.Non fare affidamento sui moduli, che sono stati calcolati automaticamente. La stessa tecnica può essere utilizzata per misurare le forze di adesione o la dissipazione di energia. Può anche essere importante per la descrizione del comportamento viscosa o viscoelastico di alcuni materiali.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Cella di misura Estensione impianto a parete (Creep), indotta dal pH acido e da Alpha-espansina

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

Ricerca

Biologia

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Risposta cellulare allo stimolo meccanico vivere Studiato da Integrated ottica e microscopia a forza atomica

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Forma Modifica cella in Living Drosophila Embrioni

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Micro-Caratterizzazione meccanica del tessuto polmonare usando la microscopia a forza atomica

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

Saggi biofisici per sondare le proprietà meccaniche del nucleo della cellula Interphase: Strain supporto Applicazione e manipolazione microago

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Obiettivi Identificazione di microRNA umani con il sistema di analisi Luciferasi LightSwitch utilizzando 3&#39;UTR-reporter Costruisce e un Mimic microRNA in cellule aderenti

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Profiling Glycan dei polimeri cellula vegetale da parete usando i microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Preparazione del campione per microscopia a forza atomica Virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

La misurazione simultanea di pH in endocitosi e citosoliche scomparti nelle cellule viventi usando Microscopia confocale

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Risoluzione Quantificazione alta del cristallino cellulosa accumulo in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots a Monitor tessuto-specifica delle cellule parete Modifiche

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...