Name: characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
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옥수수와 호밀 씨앗을 각각 제공한 드미트리 수슬로프 박사(러시아 상트페테르부르크 상트페테르부르크 주립대학교)와 미라 포노마레바 교수(타타르 농업 연구소, FRC KazSC RAS, 카잔, 러시아)에게 감사를 표합니다. 제시된 방법은 LK에 수여 된 러시아 과학 재단 프로젝트 번호 18-14-00168의 틀 내에서 개발되었습니다. 작업의 일부 (제시된 결과 획득)는 RAS의 FRC 카잔 과학 센터에 대한 정부 할당의 재정 지원으로 AP에 의해 수행되었습니다.

1. AFM 측정을 위한 샘플 준비
<ol><li>식물 재료 : 옥수수 (Zea mays L.)와 호밀 (Secale cereale L.)의 씨앗을 0.35 % NaOCl 용액으로 10 분 동안 살균하고 증류수로 3 배 씻은 다음 27 °C의 어둠 속에서 각각 4 일 및 2 일 동안 수경법으로 자랍니다. 1차 루트를 실험에 사용하였다.</li>
	<li>비브라톰 절단을 위한 용액 및 샘플 준비<ol><li>3%(w/w) 저융점 아가로스를 전자레인지를 사용하여 물에 ...

<ol>
	<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties.">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).</li><li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> Plos One. 8 (3), 57813 (2013).</li><li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy.">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).</li><li>Daher, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+growth+is+achieved+through+the+additive+mechanical+effect+of+material+anisotropy+and+elastic+asymmetry.">Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry.</a> Elife. 7, 38161 (2018).</li><li>Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+growth+symmetry+breaking+in+the+Arabidopsis+hypocotyl.">The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl.</a> Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).</li><li>Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+of+cell+wall+nano-mechanical+properties+along+and+across+elongating+primary+roots+of+maize.">Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).</li><li>Chiniquy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+novel+rice+genes+closely+related+to+the+Arabidopsis+IRX9,+IRX9L,+and+IRX14+genes+and+their+roles+in+xylan+biosynthesis.">Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Bidhendi, A. J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+quantify+primary+plant+cell+wall+mechanics.">Methods to quantify primary plant cell wall mechanics.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).</li><li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+Mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls:+at+tissue,+cellular,+and+subcellular+resolutions.">AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+by+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li><li>Yakubov, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nano-scale+mechanical+heterogeneity+of+primary+plant+cell+walls.">Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).</li><li>Zdunek, A., Kurenda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+elastic+properties+of+tomato+fruit+cells+with+an+atomic+force+microscope.">Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope.</a> Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).</li><li>Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+water+content+has+a+direct+effect+on+extensibility+in+growing+hypocotyls+of+sunflower+(Helianthus+annuus+L).">Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L).</a> Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).</li><li>Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+mapping+of+soft+materials+with+the+atomic+force+microscope:+methods,+theory+and+applications.">Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications.</a> Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).</li><li>Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+primary+cell+wall+nanomechanical+properties+in+internal+cells+of+non-fixed+maize+roots.">Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots.</a> Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).</li><li>Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+atomic+force+microscopy+to+measure+mechanical+properties+and+turgor+pressure+of+plant+cells+and+plant+tissues.">Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology.">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).</li><li>Braunsmann, C., Schaffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Note:+Artificial+neural+networks+for+the+automated+analysis+of+force+map+data+in+atomic+force+microscopy.">Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).</li></ol>

1 차 세포벽의 기계적 특성은 식물 세포 성장의 방향과 속도를 결정하므로 식물의 미래 크기와 모양을 결정합니다. 여기에 제시된 AFM 기반 방법은 식물 세포벽의 특성을 연구하는 데 사용되는 기존 기술을 보완합니다. 그것은 식물의 내부 조직에 속하는 세포벽의 탄력성을 조사 할 수있게합니다. 제시된 방법을 사용하여, 성장하는 옥수수 뿌리의 상이한 조직에서의 세포벽의 기계적 성질을 매핑?...

식물 세포벽의 기계적 성질은 세포의 모양과 성장 능력을 결정합니다. 예를 들어, 꽃가루 튜브의 성장 팁은 동일한 튜브1의 성장하지 않는 부분보다 부드럽습니다. Arabidopsis 분열 조직의 원시 형성은 미래의 원시 2,3 부위에서 세포벽 강성의 국부적 감소가 선행됩니다. 주 성장 축과 평행하고 더 빨리 성장하는 Arabidopsis 배축의 세포벽은이 축에 수직이고 느리게 성장하는 세포벽보다 부드럽습니다 4,5. 옥수수 뿌리에서 분열에서 신장으로의 세포 전이는 뿌리의 모든 조직에서 탄성 계수의 감소를 동반했다. 탄성률은 연신율 영역에서 낮게 유지되었고 후기 신장 영역6에서 증가했습니다.
다양한 방법의 가용성에도 불구하고, 매년 얻어지는 세포벽 생물학에 대한 생화학 적 및 유전 적 정보의 큰 배열은 세포벽의 기계적 특성과 거의 비교되지 않습니다. 예를 들어, 세포벽 관련 유전자의 돌연변이는 종종 성장 및 발달을 변경했지만 4,7,8 생체 역학 측면에서 거의 설명되지 않습니다. 그 이유 중 하나는 세포 및 세포 수준에서 측정을 수행하기가 어렵 기 때문입니다. 원자력 현미경 (AFM)은 현재 이러한 분석을위한 주요 접근법입니다9.
최근 몇 년 동안 식물 세포벽 생체 역학에 대한 수많은 AFM 기반 연구가 수행되었습니다. Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 및 양파 12의 외부 조직의 세포벽과 배양 된 세포13,14,15의 기계적 특성이 조사 되었습니다. 그러나, 식물의 표면 세포는 내부 조직6의 기계적 성질과 상이한 세포벽을 가질 수있다. 또한 식물 세포는 팽창에 의해 가압되어 더 뻣뻣 해집니다. 팽창 압력의 영향을 제거하기 위해 연구자들은 플라즈마 분해 용액 2,3,4,5,10,11 을 사용하거나 얻은 값을 팽창 및 세포 벽 기여 12로 분해해야합니다. 제 1 접근법은 샘플 탈수로 이어지고 세포벽(16)의 두께 및 특성을 변화시키는 반면, 제 2 접근법은 추가적인 측정 및 복잡한 수학을 필요로 하며, 비교적 단순한 형상(12)의 세포에만 적용된다. 내부 조직의 세포벽 특성은 냉동 절편17 또는 수지8이 함침 된 식물 재료의 절편에서 평가할 수 있습니다. 그러나 두 방법 모두 샘플의 탈수 및/또는 함침을 포함하며, 이는 필연적으로 특성의 변화로 이어집니다. 분리되거나 배양 된 세포의 특성은 전체 식물의 생리학과 관련되기가 어렵습니다. 식물 세포의 배양과 분리는 모두 세포벽의 기계적 특성에 영향을 줄 수 있습니다.
여기에 제시된 방법은 앞서 언급 한 접근 방식을 보완합니다. 이를 사용하여 모든 조직의 기본 세포벽과 식물 발달의 모든 단계를 검사 할 수 있습니다. 절편 및 AFM 관찰은 샘플 탈수를 피하는 액체에서 수행되었습니다. 팽창의 문제는 세포가 절단됨에 따라 해결되었습니다. 이 프로토콜은 옥수수와 호밀 뿌리에 대한 작업을 설명하지만 다른 샘플은 비브라톰 절단에 적합한 경우 검사 할 수 있습니다.
여기에 설명 된 AFM 연구는 힘-부피 기술을 사용하여 수행되었습니다. 악기마다 이 메서드에 대해 다른 이름을 사용합니다. 그러나 기본 원칙은 동일합니다. 샘플의 힘-체적 맵은 캔틸레버 편향(18)을 기록하면서 각각의 분석된 지점에서 특정 하중을 달성하기 위해 캔틸레버(또는 샘플)의 정현파 또는 삼각형 운동에 의해 얻어진다. 결과는 표면의 지형 이미지와 힘-거리 곡선의 배열을 결합합니다. 각 곡선은 특정 지점에서의 변형, 강성, 영률, 접착력 및 에너지 소산을 계산하는 데 사용됩니다. 유사한 데이터는 접촉 모드19에서 스캐닝 한 후 점별 힘 분광법에 의해 얻어 질 수 있지만, 더 많은 시간이 소요된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose, low melting point</td>
			<td>Helicon</td>
			<td>B-5000-0.1</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for section moving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NanoTools, Germany</td>
			<td>NT_B150_v0020-5</td>
			<td>Model: Biosphere B150-FM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>FMG01/50</td>
			<td>Model: FMG01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for vibratomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Heinz Herenz</td>
			<td>1042000</td>
			<td>for vibratomy and AFM calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageAnalysis P9 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM1000 epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>11591301</td>
			<td>for section check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova PX 3.4.1 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for experiments conducting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTEGRA Prima microscope with HD controller</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for AFM and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642062</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Leica VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>1404723512</td>
			<td>for sample sectioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy

일차 세포벽의 기계적 특성은 식물 세포 성장의 방향과 속도를 결정하므로 식물의 미래 크기와 모양을 결정합니다. 이러한 특성을 측정하기 위해 많은 정교한 기술이 개발되었습니다. 그러나 원자력 현미경 (AFM)은 세포 수준에서 세포벽 탄성을 연구하는 데 가장 편리합니다. 이 기술의 가장 중요한 한계 중 하나는 표면 또는 분리 된 살아있는 세포 만 연구 할 수 있다는 것입니다. 여기에서는 식물체의 내부 조직에 속하는 일차 세포벽의 기계적 특성을 조사하기 위해 원자력 현미경을 사용합니다. 이 프로토콜은 뿌리의 세포벽의 명백한 영률 측정을 설명하지만이 방법은 다른 식물 기관에도 적용될 수 있습니다. 측정은 액체 셀에서 식물 재료의 비브라톰 유래 절편에서 수행되므로 (i) 플라즈마 분해 용액의 사용 또는 왁스 또는 수지 샘플 함침을 피하고 (ii) 실험을 빠르게 수행하며 (iii) 샘플의 탈수를 방지 할 수 있습니다. 항음핵 세포벽과 주위 세포벽 모두 표본이 어떻게 절편되었는지에 따라 연구할 수 있습니다. 다른 조직의 기계적 특성의 차이는 단일 섹션에서 조사 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 연구 계획의 원리, 시편 준비 및 측정 문제, 얻은 탄성 계수 값에 대한 지형의 영향을 피하기 위해 힘 변형 곡선을 선택하는 방법을 설명합니다. 상기 방법은 샘플 크기에 의해 제한되지 않지만, 세포 크기에 민감하다(즉, 큰 내강을 갖는 세포는 검사하기 어렵다).

일반적인 탄성률 및 DFL 맵과 설명된 방법으로 호밀 및 옥수수 뿌리에서 얻은 힘 곡선이 그림 2에 나와 있습니다. 도 2A 는 호밀 1차 뿌리의 횡단면에서 얻어진 탄성률 및 DFL 맵을 나타낸다. 모듈러스 맵(그림 2A, 왼쪽)의 흰색 영역은 스캐너가 z 방향으로 한계에 도달하여 영률의 잘못된 과대 평가에 해당합니다. 이 이미지는 만족스?...

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Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

세포벽 생체 역학에 대한 연구는 식물 성장과 형태 형성을 이해하는 데 필수적입니다. 다음 프로토콜은 원자력 현미경을 사용하여 젊은 식물 기관의 내부 조직에서 얇은 1 차 세포벽을 조사하기 위해 제안됩니다.

원자력 현미경을 사용한 살아있는 식물 장기의 일차 세포벽의 기계적 특성 특성 분석

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

식물 세포 성장은 세포벽의 기계적 특성에 의해 제어됩니다. 따라서 식물의 다양한 기관과 조직에서 이러한 특성을 아는 것이 중요하다. 여기에 제시된 방법은 어린 식물의 내부 조직에서 고정되지 않은 세포벽과 탈수되지 않은 세포벽의 생체 역학적 특성을 허용합니다.비브라톰 절단을 위한 솔루션과 샘플 준비부터 시작하십시오. 페트리 접시 바닥에 녹은 3%아가로스의 4mm 층을 붓고 샘플의 열 손상을 방지하기 위해 약간 식힙니다. 약 5 밀리미터 길이의 식물 기관 3-4 개를 아가 로스에 수평으로 놓습니다.약 30 내지 60 초 후에, 얇은 반고체 필름이 첫 번째 아가 로스 층의 상부에 나타날 것이다. 그런 다음 조심스럽게 두 번째 레이어를 위에 붓습니다. 아가 로스가 완전히 응고 된 후, 시편이 들어있는 블록을 잘라냅니다.블록을 육각형 잘린 피라미드로 만들어 추가 절단 중에 안정성을 보장합니다. 비브라톰으로 샘플 절단을 시작하기 전에 시아노아크릴레이트 접착제로 블록을 비브라톰 스테이지에 붙입니다. 피라미드 모서리 중 하나가 비브라톰의 날을 향하고 비브라톰 욕조에 물을 붓도록 무대를 비브라톰에 놓습니다.단면 두께, 블레이드 속도 및 진동 빈도와 같은 단면 매개변수를 설정하고 샘플을 절단합니다. 가는 솔을 사용하여 수조에서 유리 슬라이드로 섹션을 옮기고 섹션 위에 물 한 방울을 놓아 건조를 방지합니다. 광학 현미경으로 단면의 품질을 확인한 후 단면 평면에 수직인 세포벽이 있는 적절한 단면을 선택합니다.그런 다음 피펫을 사용하여 페트리 접시 캡의 바닥에 1 % 용융 아가 로스 1 밀리리터 층을 부어 원자력 현미경 측정을위한 섹션을 고정시킵니다. 아가 로스가 고형화 된 후 여과지를 가장자리로 가져와 섹션에서 과도한 물을 제거하십시오. 브러시를 사용하여 슬라이드에서 페트리 접시 캡의 중앙으로 섹션을 조심스럽게 옮깁니다.그런 다음 20 마이크로 리터 피펫을 사용하여 섹션 주위에 1 % 아가 로스를 조심스럽게 추가하고 원자력 현미경 검사를위한 물 또는 기타 용액을 고정 된 섹션이있는 페트리 접시 캡에 붓습니다. 광학 현미경을 사용하여 원자력 현미경 캔틸레버 아래에서 샘플을 안내합니다. 접근 버튼을 클릭한 다음 랜딩 버튼을 클릭하여 1나노암페어의 설정점으로 접촉 모드에서 샘플에 접근합니다.스캔 버튼을 클릭 한 다음 영역 버튼을 클릭하십시오. 스캔할 영역 크기를 50마이크로미터 x 50마이크로미터로 선택합니다. Move Probe 버튼을 클릭하고 스캐너를 그 위로 이동하고 스캐너 돌출 정도에 따라 가장 높은 지점을 찾아 전체 스캔 영역을 확인합니다.접근 탭을 엽니다. 그런 다음 제거 버튼을 클릭하여 샘플에서 철회합니다. 가장 높은 지점을 대상으로 사용하여 랜딩 버튼을 클릭하여 샘플에 다시 접근합니다.그런 다음 Move Probe 버튼을 클릭하고 스캐너를 그 위로 이동하여 표면을 다시 확인하십시오. 스캔 속도를 0.5Hz로 설정하고 스캔 크기를 50마이크로미터 x 50마이크로미터로, 스캔 지점을 64 x 64로 설정합니다. 실행 버튼을 클릭하고 스캔하여 샘플 표면을 확인하면 아가로스로 오염될 수 있습니다.On 버튼을 클릭한 후 프로그램 메인 창의 드롭다운 메뉴에서 HDPlus 모드를 선택하고 메인 프로그램 창에서 설정값을 0.1나노암페어로 설정합니다. HD 창의 기본 탭에서 연구된 샘플에 적합한 스캔 매개변수를 설정합니다. 그런 다음 HD 창에서 소음 탭을 열고 캔틸레버의 공진 주파수를 입력합니다.HD 창의 퀀트 탭을 열고 IOS, 캔틸레버 강성, 팁 반경 및 각도를 입력합니다. 팁 형상에 따라 계산에 사용할 접촉 모델을 선택합니다. 그런 다음 HD 창의 스캔 탭을 열고 신호와 신호가 기록되는 방향을 선택하십시오.체크 힘 볼륨 상자를 클릭하여 모든 힘 곡선의 기록을 얻고 메인 프로그램 창 상단의 끄기 버튼을 클릭하여 피드백 루프를 켭니다. 메인 HD 창에서 위상 코어 버튼을 클릭하여 광학 시스템의 감도를 수정합니다. 메인 HD 창의 시간 대비 탭은 DFL 신호 대 시간의 기능을 실시간으로 표시합니다. 기준선 수준 결정에 사용하고 추가 계산을 위해 접촉 모델을 피팅하는 데 사용할 이 함수의 부품을 선택합니다.이제 프로그램의 기본 창에서 스캔 포인트 값을 256 x 256으로 설정하십시오. 그런 다음 스캔 속도를 0.2Hz로 설정하고 실행 버튼을 클릭하여 샘플을 스캔합니다. 스캔이 중지되면 기본 창 상단의 On 버튼을 클릭하여 피드백 루프를 끕니다.드롭다운 메뉴에서 접촉 모드를 선택하고 접근 탭을 연 다음 제거 버튼을 클릭하여 샘플에서 철회합니다. 데이터 버튼을 클릭하여 분석 소프트웨어를 열고 출력을 저장합니다. 분석 소프트웨어에서 저장된 파일을 엽니다.HD 포스 볼륨 프레임을 선택합니다. Control 키를 누른 상태에서 동일한 스캔 방향으로 얻은 하나의 시각적 프레임을 선택합니다. 외부 맵 로드 버튼을 클릭하여 셀 벽이 어디에 있는지 확인합니다.기본 탭에서 InvOptSens 및 캔틸레버 강성 값을 확인합니다. 추가 탭을 열고 팁 매개변수와 접촉 모델을 확인합니다. 시각적 프레임의 셀 벽에서 다양한 점을 클릭하고 모델에서 잘 설명한 곡선만 선택합니다.모듈러스 맵의 흰색 영역은 스캐너가 Z 방향으로 한계에 도달하여 영률의 잘못된 과대 평가에 해당합니다. 이 이미지는 만족스러운 힘 곡선을 추가로 선택하기 위한 외부 맵으로 사용하기에 편리하지 않습니다. 그러나 오른쪽에 표시된 DFL 신호 맵이 여기에 더 적합합니다.다른 계측기는 DFL 신호를 편향 또는 오류 신호로 참조할 수 있습니다. 샘플 바닥에 도달하려고 시도하는 동안 완전히 확장된 스캐너는 잘못된 측정과 스캔을 중단할 수 있습니다. 아가로스 존재는 접촉 모드에서 첫 번째 스캔을 획득하는 동안 세포벽 및 일부 세포 바닥이 이러한 스캔에서 볼 수 있으므로 확인할 수 있습니다.그러나, 부정확 한 고정의 경우, 표면은 샘플 지형을 가리는 아가 로스로 덮일 수있다. 동일한 세포벽의 다른 지점에 기록된 4개의 서로 다른 힘 곡선 중에서 0.1로 기록된 곡선은 기준선을 나타내지 않으며, 이는 캔틸레버 팁이 세포벽에서 분리되지 않음을 의미합니다. 0.3으로 기록된 곡선은 세포벽의 굽힘을 나타내는 접근 부분의 숄더를 보여줍니다.점 2와 4는 유사한 계수 값을 가진 만족스러운 힘 곡선을 보여줍니다. 샘플 준비 및 검사는 연습이 필요하지만 마스터 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 중요한 부분은 결과 곡선을 필터링하는 것입니다.자동으로 계산 된 모듈리에 의존하지 마십시오. 동일한 기술을 사용하여 접착력 또는 에너지 소산을 측정할 수 있습니다. 또한 일부 재료의 점성 또는 점탄성 거동을 설명하는 데 중요 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

측정 식물 세포 벽 확장 (크리프)는 산성 산도에 의해 및 알파 Expansin에 의해 유도된

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

연구

생물학

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

생활의 이미징 셀 모양 변경 Drosophila 태아

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

원자 힘 현미경을 사용하여 폐 조직의 미세 기계적 특성

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

계면 세포 핵의 기계적 성질을 알아내기 위해 Biophysical Assays : 기판 스트레인 신청 및 Microneedle 조작

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

3&#39;UTR - 기자의 구성과 microRNA를 사용하여 LightSwitch의 루시페라제 분석 시스템과 인간 microRNAs의 확인 대상이 자기편 세포의 모방

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

단일 비리온 원자력 현미경 검사및 초분해성 형광 이미징을 위한 샘플 준비

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 세포 내 이입과 세포질 구획 동시 pH 측정

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

에서 결정 셀룰로오스 축적의 높은 해상도 정량<em&gt; 애기 장대</em&gt; 뿌리 조직 특이 세포 벽 수정을 모니터링하는

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...