Name: characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Vi ønsker å anerkjenne Dr. Dmitry Suslov (St. Petersburg State University, St. Petersburg, Russland) og Prof. Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Russland) for å gi mais og rugfrø, henholdsvis. Den presenterte metoden ble utviklet innenfor rammen av den russiske vitenskapsstiftelsens prosjekt nr. 18-14-00168 tildelt LK. Den delen av arbeidet (innhenting av resultatene som ble presentert) ble utført av AP med økonomisk støtte fra regjeringsoppdraget til FRC Kazan Scientific Center of RAS.

1. Prøvepreparering for AFM-målinger
<ol><li>Plantemateriale: Sterilisfrø av mais (Zea mays L.) og rug (Secale cereale L.) med en 0,35% NaOCl-løsning i 10 minutter, vask 3x med destillert vann, og vokse deretter hydroponisk i mørket ved 27 ° C i henholdsvis 4 dager og 2 dager. Primære røtter ble brukt til forsøket.</li>
	<li>Fremstilling av løsninger og prøve for vibratomseksjonering<ol><li>Forbered agaroseløsning for rotinnstøping ved å oppløse 3% (w / w) lavsmeltepunk...

<ol>
	<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties.">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).</li><li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> Plos One. 8 (3), 57813 (2013).</li><li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy.">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).</li><li>Daher, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+growth+is+achieved+through+the+additive+mechanical+effect+of+material+anisotropy+and+elastic+asymmetry.">Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry.</a> Elife. 7, 38161 (2018).</li><li>Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+growth+symmetry+breaking+in+the+Arabidopsis+hypocotyl.">The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl.</a> Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).</li><li>Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+of+cell+wall+nano-mechanical+properties+along+and+across+elongating+primary+roots+of+maize.">Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).</li><li>Chiniquy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+novel+rice+genes+closely+related+to+the+Arabidopsis+IRX9,+IRX9L,+and+IRX14+genes+and+their+roles+in+xylan+biosynthesis.">Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Bidhendi, A. J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+quantify+primary+plant+cell+wall+mechanics.">Methods to quantify primary plant cell wall mechanics.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).</li><li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+Mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls:+at+tissue,+cellular,+and+subcellular+resolutions.">AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+by+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li><li>Yakubov, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nano-scale+mechanical+heterogeneity+of+primary+plant+cell+walls.">Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).</li><li>Zdunek, A., Kurenda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+elastic+properties+of+tomato+fruit+cells+with+an+atomic+force+microscope.">Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope.</a> Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).</li><li>Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+water+content+has+a+direct+effect+on+extensibility+in+growing+hypocotyls+of+sunflower+(Helianthus+annuus+L).">Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L).</a> Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).</li><li>Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+mapping+of+soft+materials+with+the+atomic+force+microscope:+methods,+theory+and+applications.">Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications.</a> Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).</li><li>Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+primary+cell+wall+nanomechanical+properties+in+internal+cells+of+non-fixed+maize+roots.">Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots.</a> Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).</li><li>Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+atomic+force+microscopy+to+measure+mechanical+properties+and+turgor+pressure+of+plant+cells+and+plant+tissues.">Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology.">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).</li><li>Braunsmann, C., Schaffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Note:+Artificial+neural+networks+for+the+automated+analysis+of+force+map+data+in+atomic+force+microscopy.">Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).</li></ol>

De mekaniske egenskapene til de primære celleveggene bestemmer retningen og hastigheten på plantecelleveksten, og dermed plantens fremtidige størrelse og form. Den AFM-baserte metoden som presenteres her utfyller eksisterende teknikker som brukes til å studere egenskapene til plantecellevegger. Det gjør at elastisiteten til cellevegger, som tilhører plantens indre vev, kan undersøkes. Ved hjelp av den presenterte metoden ble de mekaniske egenskapene til cellevegger i forskjellige vev av den voksende maisroten kart...

De mekaniske egenskapene til plantecelleveggen bestemmer cellens form og dens evne til å vokse. For eksempel er den voksende spissen av pollenrøret mykere enn de ikke-voksende delene av samme rør1. Primordia-dannelsen på Arabidopsis meristem innledes av en lokal reduksjon i celleveggstivhet på stedet for det fremtidige primordium 2,3. Celleveggene til Arabidopsis hypocotyl, som er parallelle med hovedvekstaksen og vokser raskere, er mykere enn de som er vinkelrett på denne aksen og vokser langsommere 4,5. I maisroten ble overgangen av celler fra divisjon til forlengelse ledsaget av en reduksjon i elastisk moduli i alle vev av roten. Moduli forble lav i forlengelsessonen og økte i sen forlengelsessone6.
Til tross for tilgjengeligheten av ulike metoder, blir de store utvalgene av biokjemisk og genetisk informasjon om celleveggbiologi oppnådd årlig sjelden sammenlignet med de mekaniske egenskapene til cellevegger. For eksempel har mutanter på celleveggrelaterte gener ofte endret vekst og utvikling 4,7,8, men er sjelden beskrevet i form av biomekanikk. En av grunnene til dette er vanskeligheten med å gjennomføre målinger på cellulært og subcellulært nivå. Atomkraftmikroskopi (AFM) er i dag den primære tilnærmingen for slike analyser9.
I de senere år har det blitt utført en rekke AFM-baserte studier på plantecelleveggbiomekanikk. De mekaniske egenskapene til cellevegger i det ytre vevet av Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 og løk 12, samt av dyrkede celler13,14,15, har blitt undersøkt. Imidlertid kan overfladiske celler av en plante ha cellevegger hvis mekaniske egenskaper er forskjellige fra de indre vevene6. I tillegg er planteceller trykksatt av turgor, noe som gjør dem stivere. For å bli kvitt påvirkning av turgortrykk, må forskere bruke plasmolyserende løsninger 2,3,4,5,10,11 eller dekomponere verdiene oppnådd i turgor og celleveggbidrag 12. Den første tilnærmingen fører til prøvedehydrering og endrer tykkelsen og egenskapene til celleveggen16, mens den andre tilnærmingen krever ytterligere målinger og komplisert matematikk, og gjelder bare for celler med relativt enkel form12. Celleveggegenskapene til indre vev kan evalueres på kryoseksjoner17 eller seksjoner av plantemateriale impregnert med harpiks8. Imidlertid innebærer begge metodene dehydrering og / eller impregnering av prøver, noe som uunngåelig fører til endringer i egenskaper. Egenskapene til isolerte eller dyrkede celler er vanskelige å forholde seg til fysiologien til hele planten. Både dyrking og isolering av planteceller kan påvirke de mekaniske egenskapene til celleveggene.
Metoden som presenteres her utfyller de nevnte tilnærmingene. Ved å bruke den kan de primære celleveggene i noe vev og på et hvilket som helst stadium av planteutvikling undersøkes. Seksjonerings- og AFM-observasjoner ble utført i væske som unngår dehydrering av prøver. Problemet med turgor ble løst da cellene ble kuttet. Protokollen beskriver arbeid med mais og rugrøtter, men enhver annen prøve kan undersøkes om den er egnet for vibratomseksjonering.
AFM-studiene beskrevet her ble utført ved bruk av kraftvolumteknikken. Ulike instrumenter bruker forskjellige navn for denne metoden. Det grunnleggende prinsippet er imidlertid det samme; Et kraftvolumkart over prøven oppnås ved en sinusformet eller trekantet bevegelse av utkrageren (eller prøven) for å oppnå en viss belastningskraft ved hvert analysert punkt, mens du registrerer utkragingsavbøyningen18. Resultatet kombinerer et topografisk bilde av overflaten og rekken av kraftavstandskurver. Hver kurve brukes til å beregne deformasjon, stivhet, Youngs modul, vedheft og energispredning på et bestemt punkt. Lignende data kan fås ved punkt-for-punkt kraftspektroskopi etter skanning i kontaktmodus19, selv om det er mer tidkrevende.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose, low melting point</td>
			<td>Helicon</td>
			<td>B-5000-0.1</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for section moving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NanoTools, Germany</td>
			<td>NT_B150_v0020-5</td>
			<td>Model: Biosphere B150-FM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>FMG01/50</td>
			<td>Model: FMG01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for vibratomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Heinz Herenz</td>
			<td>1042000</td>
			<td>for vibratomy and AFM calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageAnalysis P9 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM1000 epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>11591301</td>
			<td>for section check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova PX 3.4.1 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for experiments conducting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTEGRA Prima microscope with HD controller</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for AFM and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642062</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Leica VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>1404723512</td>
			<td>for sample sectioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy

De mekaniske egenskapene til de primære celleveggene bestemmer retningen og hastigheten på plantecelleveksten og dermed plantens fremtidige størrelse og form. Mange sofistikerte teknikker er utviklet for å måle disse egenskapene; Atomkraftmikroskopi (AFM) er imidlertid fortsatt den mest praktiske for å studere celleveggelastisitet på mobilnivå. En av de viktigste begrensningene ved denne teknikken har vært at bare overfladiske eller isolerte levende celler kan studeres. Her presenteres bruken av atomkraftmikroskopi for å undersøke de mekaniske egenskapene til primære cellevegger som tilhører det indre vevet i en plantekropp. Denne protokollen beskriver målinger av den tilsynelatende Youngs modul av cellevegger i røtter, men metoden kan også brukes på andre planteorganer. Målingene utføres på vibratomavledede seksjoner av plantemateriale i en flytende celle, noe som gjør det mulig (i) å unngå bruk av plasmolyserende løsninger eller prøveimpregnering med voks eller harpiks, (ii) gjøre forsøkene raske og (iii) forhindre dehydrering av prøven. Både antiklinale og periklinale cellevegger kan studeres, avhengig av hvordan prøven ble seksjonert. Forskjeller i de mekaniske egenskapene til forskjellige vev kan undersøkes i en enkelt seksjon. Protokollen beskriver prinsippene for studieplanlegging, problemer med prøvepreparering og målinger, samt metoden for å velge kraftdeformasjonskurver for å unngå påvirkning av topografi på de oppnådde verdiene av elastisk modul. Metoden er ikke begrenset av prøvestørrelse, men er følsom for cellestørrelse (dvs. celler med stort lumen er vanskelig å undersøke).

Typiske elastiske modul- og DFL-kart, samt kraftkurver oppnådd på rug- og maisrøtter ved den beskrevne metoden, er presentert i figur 2. Figur 2A viser elastiske modul- og DFL-kart oppnådd på den tverrgående delen av rugens primære rot. De hvite områdene i modulkartet (figur 2A, til venstre) tilsvarer en feilaktig overestimering av Youngs modul på grunn av at skanneren når grensen i z-retningen. Dette bildet er ikke prakti...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

Studier av celleveggbiomekanikk er avgjørende for å forstå plantevekst og morfogenese. Følgende protokoll foreslås å undersøke tynne primære cellevegger i det indre vevet av unge planteorganer ved hjelp av atomkraftmikroskopi.

Karakterisering av mekaniske egenskaper til primærcellevegg i levende planteorganer ved bruk av atomkraftmikroskopi

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

Plantecellevekst styres av de mekaniske egenskapene til celleveggene deres. Derfor er det viktig å kjenne disse egenskapene i forskjellige organer og vev i plantene. Metoden som presenteres her tillater biomekanisk karakterisering av ikke-faste og ikke-dehydrerte cellevegger i det indre vevet av unge planter.Begynn med å forberede løsningene og prøven for vibratomseksjonering. Hell et fire millimeter lag smeltet 3% agarose på bunnen av petriskålen og la den avkjøles litt for å forhindre termisk skade på prøven. Plasser omtrent fem millimeter lange tre eller fire stykker av planteorganet horisontalt på agarose.Rundt 30 til 60 sekunder senere vil en tynn halvfast film vises på toppen av det første agaroselaget. Hell deretter forsiktig et andre lag på toppen. Etter at agarosen er fullstendig størknet, kutt ut blokken som inneholder prøven.Form blokken til en sekskantet avkortet pyramide for å sikre stabiliteten under videre seksjonering. Før du starter prøveseksjoneringen med vibratomet, lim blokken til vibratometrinnet med cyanoakrylatlim. Plasser scenen i vibratomet, slik at et av pyramidehjørnene vender mot vibratomets blad og hell vann inn i vibratomebadet.Still inn seksjoneringsparametrene som seksjonstykkelse, bladhastighet og vibrasjonsfrekvens og kutt prøven. Bruk en fin børste, flytt seksjonen fra vannbadet til en glasssklie og legg en dråpe vann på seksjonen for å forhindre at den tørker ut. Etter å ha sjekket kvaliteten på seksjonen under et lysmikroskop, velg den riktige delen som har cellevegg vinkelrett på seksjonsplanet.Immobiliser deretter seksjonen for atomkraftmikroskopimålinger ved å helle et lag på en milliliter 1% smeltet agarose på bunnen av petriskålhetten ved hjelp av en pipette. Etter at agarose har størknet, fjern overflødig vann fra seksjonen ved å bringe filterpapir til kanten. Overfør delen forsiktig fra lysbildet til midten av petriskålhetten ved hjelp av en børste.Tilsett deretter forsiktig 1% agarose rundt seksjonen ved hjelp av en 20 mikroliter pipette og hell vannet eller annen løsning for atomkraftmikroskopi i petriskålhetten med den immobiliserte delen. Før prøven under atomkraftmikroskopi cantilever ved hjelp av det optiske mikroskopet. Klikk på Approach-knappen og deretter Landing-knappen for å nærme seg prøven i kontaktmodus med et settpunkt på en nanoampere.Klikk på Skanning-knappen og deretter Område-knappen. Velg områdestørrelsen på 50 mikrometer med 50 mikrometer for å skanne. Klikk på Move Probe-knappen og sjekk hele skanneområdet ved å flytte skanneren over den og finne det høyeste punktet basert på graden av skannerfremspring.Åpne Tilnærming-fanen. Klikk deretter på Fjern-knappen for å trekke seg fra prøven. Bruk det høyeste punktet som mål og klikk Landing-knappen for å nærme deg prøven på nytt.Kontroller deretter overflaten igjen ved å klikke på Flytt sonde-knappen og flytte skanneren over den. Sett skannehastigheten til 0,5 hertz, og sett skannestørrelsen til 50 mikrometer med 50 mikrometer og skannepunktet til 64 x 64. Klikk på Kjør-knappen og skann for å sjekke overflaten på prøven, og det er mulig forurensning med agarose.Etter å ha klikket på På-knappen, velg HDPlus-modus i rullegardinmenyen i programmets hovedvindu og sett settpunktet til 0,1 nanoampere i hovedprogramvinduet. I hovedfanen i HD-vinduet angir du skanneparametrene som passer til den studerte prøven. Åpne deretter Noises-fanen i HD-vinduet og skriv inn cantileverens resonansfrekvens.Åpne Quant-fanen i HD-vinduet og skriv inn IOS, cantilever stivhet, spissradius og vinkel. Velg kontaktmodellen, som skal brukes til beregninger avhengig av spissgeometri. Etter dette åpner du Skann-fanen i HD-vinduet og velger signalene, samt retningen signalet spilles inn i.Merk av for Force Volume-boksen for å få en oversikt over alle kraftkurver, og klikk på Av-knappen øverst i hovedprogramvinduet for å slå på tilbakemeldingssløyfen Klikk på fasekjerneknappen i hovedvinduet for HD for å korrigere følsomheten til det optiske systemet. Versus Time-fanen i HD-hovedvinduet presenterer funksjonen til DFL-signalet versus tid i sanntid. Velg delene av denne funksjonen som skal brukes til bestemmelse av grunnlinjenivå og for å tilpasse kontaktmodellen for videre beregninger.Sett nå skannepunktverdien til 256 x 256 i hovedvinduet til programmet. Sett deretter skannehastigheten til 0,2 hertz og klikk på Kjør-knappen for å skanne prøven. Etter at skanningen stopper, klikker du på På-knappen øverst i hovedvinduet for å slå av tilbakemeldingssløyfen.Velg Kontaktmodus i rullegardinmenyen, åpne Tilnærming-fanen, og klikk på Fjern-knappen for å trekke seg fra prøven. Klikk på Data-knappen for å åpne analyseprogramvaren og lagre utdataene. Åpne den lagrede filen i analyseprogramvaren.Velg HD-kraftvolumrammen. Hold nede Kontroll-tasten og velg en visuell ramme oppnådd i samme skanneretning. Klikk på Last inn eksternt kart-knappen for å se hvor celleveggene er plassert.Sjekk InvOptSens og cantilever stivhetsverdier i hovedfanen. Åpne kategorien Tillegg og sjekk tipsparametrene og kontaktmodellen. Klikk på forskjellige punkter på celleveggene på den visuelle rammen, og velg bare de kurvene som er godt beskrevet av modellen.De hvite områdene i modulkartet tilsvarer en feilaktig overestimering av Youngs modul på grunn av at skanneren når grensen i Z-retningen. Dette bildet er ikke praktisk å bruke som et eksternt kart for et videre utvalg av tilfredsstillende kraftkurver. Imidlertid er DFL-signalkartet presentert til høyre bedre egnet her.Ulike instrumenter kan referere til DFL-signaler som avbøynings- eller feilsignaler. Skanneren som har blitt fullstendig utvidet mens du prøver å nå bunnen av prøven, kan resultere i feilaktige målinger og til og med avbrutte skanninger. Agarosetilstedeværelsen kan kontrolleres mens du får den første skanningen i kontaktmodus, da celleveggene og noen cellebunner er synlige på slike skanninger.Ved unøyaktig immobilisering kan overflaten imidlertid dekkes med agarose, som maskerer prøvetopografien. Av fire forskjellige kraftkurver registrert på forskjellige punkter i samme cellevegg, viser kurven registrert ved 0,1 ingen grunnlinje, noe som betyr ingen separasjon av utkragespissen fra celleveggen. Kurven registrert på 0,3 viser en skulder på den nærliggende delen som indikerer bøyning av celleveggen.Punkt to og fire viser tilfredsstillende kraftkurver med tilsvarende moduliverdier. Prøveforberedelse og undersøkelse krever øvelse, men det kan mestres. En viktig del av denne protokollen er å filtrere resulterende kurver.Ikke stol på moduli, som ble beregnet automatisk. Den samme teknikken kan brukes til å måle adhesjonskreftene eller energispredningen. Det kan også være viktig for beskrivelse av viskose eller viskoelastisk oppførsel av enkelte materialer.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Glycan Profilering av Plant Cell Wall Polymers med Mikromatriser

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Prøvepreparering for mikroskopi av enkeltvirionakroskopi og superoppløselig fluorescensavbildning

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Samtidig måling av pH i endocytic og cytosoliske avdelinger i levende celler ved hjelp konfokalmikroskopi

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Kvantifisering av krystallinsk cellulose akkumulering i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots å overvåke Tissue-spesifikke Cell Wall Modifikasjoner

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...