Name: characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Dmitry Suslov (Universidade Estatal de São Petersburgo, São Petersburgo, Rússia) e à Prof. Mira Ponomareva (Instituto de Pesquisa Científica Tártara de Agricultura, FRC KazSC RAS, Kazan, Rússia) pelo fornecimento de sementes de milho e centeio, respectivamente. O método apresentado foi desenvolvido no âmbito do Projeto da Fundação Científica Russa No. 18-14-00168 concedido à LK. A parte do trabalho (obtenção dos resultados apresentados) foi realizada pela AP com o apoio financeiro da atribuição do governo para o Centro Científico FRC Kazan da RAS.

1. Preparação da amostra para medições de AFM
<ol><li>Material vegetal: Esterilizar as sementes de milho (Zea mays L.) e centeio (Secale cereale L.) com uma solução de NaOCl a 0,35% por 10 min, lavar 3x com água destilada e, em seguida, crescer hidroponicamente no escuro a 27 °C por 4 dias e 2 dias, respectivamente. Raízes primárias foram utilizadas para o experimento.</li>
	<li>Preparação de soluções e amostras para seccionamento de vibratomos<ol><li>Preparar a soluçã...

<ol>
	<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties.">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).</li><li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> Plos One. 8 (3), 57813 (2013).</li><li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy.">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).</li><li>Daher, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+growth+is+achieved+through+the+additive+mechanical+effect+of+material+anisotropy+and+elastic+asymmetry.">Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry.</a> Elife. 7, 38161 (2018).</li><li>Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+growth+symmetry+breaking+in+the+Arabidopsis+hypocotyl.">The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl.</a> Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).</li><li>Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+of+cell+wall+nano-mechanical+properties+along+and+across+elongating+primary+roots+of+maize.">Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).</li><li>Chiniquy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+novel+rice+genes+closely+related+to+the+Arabidopsis+IRX9,+IRX9L,+and+IRX14+genes+and+their+roles+in+xylan+biosynthesis.">Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Bidhendi, A. J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+quantify+primary+plant+cell+wall+mechanics.">Methods to quantify primary plant cell wall mechanics.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).</li><li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+Mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls:+at+tissue,+cellular,+and+subcellular+resolutions.">AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+by+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li><li>Yakubov, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nano-scale+mechanical+heterogeneity+of+primary+plant+cell+walls.">Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).</li><li>Zdunek, A., Kurenda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+elastic+properties+of+tomato+fruit+cells+with+an+atomic+force+microscope.">Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope.</a> Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).</li><li>Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+water+content+has+a+direct+effect+on+extensibility+in+growing+hypocotyls+of+sunflower+(Helianthus+annuus+L).">Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L).</a> Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).</li><li>Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+mapping+of+soft+materials+with+the+atomic+force+microscope:+methods,+theory+and+applications.">Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications.</a> Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).</li><li>Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+primary+cell+wall+nanomechanical+properties+in+internal+cells+of+non-fixed+maize+roots.">Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots.</a> Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).</li><li>Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+atomic+force+microscopy+to+measure+mechanical+properties+and+turgor+pressure+of+plant+cells+and+plant+tissues.">Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology.">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).</li><li>Braunsmann, C., Schaffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Note:+Artificial+neural+networks+for+the+automated+analysis+of+force+map+data+in+atomic+force+microscopy.">Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).</li></ol>

As propriedades mecânicas das paredes celulares primárias determinam a direção e a taxa de crescimento das células vegetais e, portanto, o tamanho e a forma futuros da planta. O método baseado em AFM aqui apresentado complementa as técnicas existentes que são usadas para estudar as propriedades das paredes celulares das plantas. Permite que a elasticidade das paredes celulares, que pertencem aos tecidos internos da planta, seja investigada. Utilizando o método apresentado, as propriedades mecânicas das paredes ...

As propriedades mecânicas da parede celular da planta determinam a forma da célula e sua capacidade de crescer. Por exemplo, a ponta de crescimento do tubo de pólen é mais macia do que as partes não crescentes do mesmo tubo1. A formação de primórdios no meristema Arabidopsis é precedida por uma diminuição local da rigidez da parede celular no local do futuro primordium 2,3. As paredes celulares de Arabidopsis hypocotyl, que são paralelas ao eixo principal de crescimento e crescem mais rapidamente, são mais macias do que aquelas que são perpendiculares a este eixo e crescem mais lentamente 4,5. Na raiz do milho, a transição das células da divisão para o alongamento foi acompanhada por uma diminuição dos módulos elásticos em todos os tecidos da raiz. Os módulos permaneceram baixos na zona de alongamento e aumentaram na zona de alongamento tardio6.
Apesar da disponibilidade de vários métodos, as grandes matrizes de informações bioquímicas e genéticas sobre a biologia da parede celular obtidas anualmente raramente são comparadas com as propriedades mecânicas das paredes celulares. Por exemplo, mutantes em genes relacionados à parede celular frequentemente têm crescimento e desenvolvimento alterados 4,7,8, mas raramente são descritos em termos de biomecânica. Uma das razões para isso é a dificuldade de realizar medições nos níveis celular e subcelular. A microscopia de força atômica (AFM) é atualmente a principal abordagem para tais análises9.
Nos últimos anos, numerosos estudos baseados em AFM sobre biomecânica da parede celular vegetal foram realizados. As propriedades mecânicas das paredes celulares dos tecidos externos de Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 e cebola 12, bem como de células cultivadas 13,14,15, têm sido investigadas. No entanto, as células superficiais de uma planta podem ter paredes celulares cujas propriedades mecânicas diferem das dos tecidos internos6. Além disso, as células vegetais são pressurizadas por turgor, o que as torna mais rígidas. Para se livrar da influência da pressão de turgor, os pesquisadores têm que utilizar soluções plasmolizantes 2,3,4,5,10,11 ou decompor os valores obtidos em aportes de turgor e parede celular 12. A primeira abordagem leva à desidratação da amostra e altera a espessura e as propriedades da parede celular16, enquanto a segunda abordagem requer medidas adicionais e matemática complicada, e se aplica apenas a células de forma relativamente simples12. As propriedades da parede celular dos tecidos internos podem ser avaliadas em criosecções17 ou seções de material vegetal impregnado com resina8. No entanto, ambos os métodos envolvem desidratação e / ou impregnação de amostras, o que inevitavelmente leva a mudanças nas propriedades. As propriedades de células isoladas ou cultivadas são difíceis de relacionar com a fisiologia de toda a planta. Tanto o cultivo quanto o isolamento de células vegetais podem afetar as propriedades mecânicas de suas paredes celulares.
O método aqui apresentado complementa as abordagens supracitadas. Usando ele, as paredes celulares primárias de qualquer tecido e em qualquer estágio do desenvolvimento da planta podem ser examinadas. As observações de seccionamento e AFM foram realizadas em líquido, o que evita a desidratação da amostra. O problema do turgor foi resolvido à medida que as células são cortadas. O protocolo descreve o trabalho com raízes de milho e centeio, mas qualquer outra amostra pode ser examinada se for adequada para o corte de vibratome.
Os estudos de AFM aqui descritos foram realizados utilizando-se a técnica força-volume. Diferentes instrumentos usam nomes diferentes para este método. No entanto, o princípio básico é o mesmo; um mapa força-volume da amostra é obtido por um movimento sinusoidal ou triangular do cantilever (ou amostra) para atingir uma certa força de carga em cada ponto analisado, enquanto se registra a deflexão do cantilever18. O resultado combina uma imagem topográfica da superfície e a matriz de curvas força-distância. Cada curva é usada para calcular a deformação, rigidez, módulo de Young, adesão e dissipação de energia em um ponto específico. Dados semelhantes podem ser obtidos por espectroscopia de força ponto a ponto após a varredura no modode contato 19, embora seja mais demorado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose, low melting point</td>
			<td>Helicon</td>
			<td>B-5000-0.1</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for section moving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NanoTools, Germany</td>
			<td>NT_B150_v0020-5</td>
			<td>Model: Biosphere B150-FM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>FMG01/50</td>
			<td>Model: FMG01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for vibratomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Heinz Herenz</td>
			<td>1042000</td>
			<td>for vibratomy and AFM calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageAnalysis P9 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM1000 epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>11591301</td>
			<td>for section check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova PX 3.4.1 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for experiments conducting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTEGRA Prima microscope with HD controller</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for AFM and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642062</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Leica VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>1404723512</td>
			<td>for sample sectioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy

As propriedades mecânicas das paredes celulares primárias determinam a direção e a taxa de crescimento das células vegetais e, portanto, o tamanho e a forma futuros da planta. Muitas técnicas sofisticadas foram desenvolvidas para medir essas propriedades; no entanto, a microscopia de força atômica (AFM) continua sendo a mais conveniente para estudar a elasticidade da parede celular no nível celular. Uma das limitações mais importantes desta técnica tem sido que apenas células vivas superficiais ou isoladas podem ser estudadas. Aqui, o uso da microscopia de força atômica para investigar as propriedades mecânicas das paredes celulares primárias pertencentes aos tecidos internos de um corpo vegetal é apresentado. Este protocolo descreve medidas do módulo aparente de Young de paredes celulares em raízes, mas o método também pode ser aplicado a outros órgãos vegetais. As medições são realizadas em seções de material vegetal derivadas de vibratomo em uma célula líquida, o que permite (i) evitar o uso de soluções plasmolizantes ou impregnação de amostras com cera ou resina, (ii) tornar os experimentos rápidos e (iii) prevenir a desidratação da amostra. Ambas as paredes celulares anticlinais e periclinais podem ser estudadas, dependendo de como a amostra foi seccionada. Diferenças nas propriedades mecânicas de diferentes tecidos podem ser investigadas em uma única seção. O protocolo descreve os princípios de planejamento do estudo, questões com a preparação e medidas do espécime, bem como o método de seleção de curvas de força-deformação para evitar a influência da topografia nos valores obtidos do módulo elástico. O método não é limitado pelo tamanho da amostra, mas é sensível ao tamanho da célula (ou seja, células com um grande lúmen são difíceis de examinar).

Os mapas típicos de módulo elástico e DFL, bem como as curvas de força obtidas em raízes de centeio e milho pelo método descrito, são apresentados na Figura 2. A Figura 2A mostra o módulo elástico e os mapas DFL obtidos na seção transversal da raiz primária do centeio. As áreas brancas no mapa do módulo (Figura 2A, à esquerda) correspondem a uma superestimação errônea do módulo de Young devido ao scanner atingir s...

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Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

Estudos da biomecânica da parede celular são essenciais para a compreensão do crescimento e morfogênese das plantas. O protocolo a seguir é proposto para investigar paredes celulares primárias finas nos tecidos internos de órgãos de plantas jovens usando microscopia de força atômica.

Caracterizando as Propriedades Mecânicas da Parede Celular Primária em Órgãos de Plantas Vivas Usando Microscopia de Força Atômica

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

O crescimento celular das plantas é controlado pelas propriedades mecânicas de suas paredes celulares. Portanto, é importante conhecer essas propriedades em diferentes órgãos e tecidos das plantas. O método aqui apresentado permite a caracterização biomecânica de paredes celulares não fixas e não desidratadas nos tecidos internos de plantas jovens.Comece com a preparação das soluções e da amostra para o seccionamento do vibratome. Despeje uma camada de quatro milímetros de 3% de agarose derretida no fundo da placa de Petri e deixe esfriar um pouco para evitar danos térmicos à amostra. Coloque cerca de cinco milímetros de comprimento três ou quatro pedaços do órgão da planta horizontalmente sobre a agarose.Cerca de 30 a 60 segundos depois, um filme semissólido fino aparecerá no topo da primeira camada de agarose. Em seguida, despeje cuidadosamente uma segunda camada por cima. Depois que a agarose estiver completamente solidificada, corte o bloco que contém o espécime.Molde o bloco em uma pirâmide truncada hexagonal para garantir sua estabilidade durante o seccionamento adicional. Antes de iniciar a seccionamento da amostra com o vibratome, cole o bloco no estágio vibratório com adesivo de cianoacrilato. Coloque o palco no vibratome, de modo que um dos cantos da pirâmide fique de frente para a lâmina do vibratome e despeje água no banho de vibratome.Defina os parâmetros de seccionamento, como espessura da seção, velocidade da lâmina e frequência de vibração, e corte a amostra. Usando uma escova fina, mova a seção do banho de água para uma lâmina de vidro e coloque uma gota de água na seção para evitar que ela seque. Depois de verificar a qualidade da seção sob um microscópio de luz, selecione a seção adequada com parede celular perpendicular ao plano de seção.Em seguida, imobilize a seção para medições de microscopia de força atômica derramando uma camada de um mililitro de agarose derretida a 1% no fundo da tampa da placa de Petri usando uma pipeta. Depois que a agarose se solidificar, remova o excesso de água da seção, trazendo papel de filtro para sua borda. Transfira cuidadosamente a seção do slide para o centro da tampa da placa de Petri usando um pincel.Em seguida, adicione cuidadosamente 1% de agarose ao redor da seção usando uma pipeta de 20 microlitros e despeje a água ou outra solução para a microscopia de força atômica na tampa da placa de Petri com a seção imobilizada. Guie a amostra sob o cantilever de microscopia de força atômica usando o microscópio óptico. Clique no botão Aproximação e, em seguida, no botão Pouso para se aproximar da amostra no modo de contato com um ponto de ajuste de um nanoampere.Clique no botão Digitalização e, em seguida, no botão Área. Selecione o tamanho da área de 50 micrômetros por 50 micrômetros para digitalizar. Clique no botão Mover sonda e verifique toda a área de varredura movendo o scanner sobre ela e encontrando o ponto mais alto com base no grau de protrusão do scanner.Abra a guia Abordagem. Em seguida, clique no botão Remover para se retirar da amostra. Usando o ponto mais alto como alvo, clique no botão Aterrissagem para se aproximar da amostra novamente.Em seguida, verifique a superfície novamente clicando no botão Mover sonda e movendo o scanner sobre ela. Defina a taxa de varredura para 0,5 hertz e defina o tamanho da varredura para 50 micrômetros por 50 micrômetros e o ponto de varredura para 64 por 64. Clique no botão Executar e digitalize para verificar a superfície da amostra e é possível contaminação com agarose.Depois de clicar no botão Ativado, escolha o modo HDPlus no menu suspenso na janela principal do programa e defina o ponto de ajuste para 0,1 nanoamperes na janela principal do programa. Na aba principal da janela HD, defina os parâmetros de digitalização apropriados para a amostra estudada. Em seguida, abra a guia Ruídos na janela HD e insira a frequência de ressonância do balanço.Abra a guia Quant da janela HD e insira o IOS, a rigidez do cantilever, o raio da ponta e o ângulo. Selecione o modelo de contato, que será usado para cálculos dependendo da geometria da ponta. Depois disso, abra a guia Scan da janela HD e selecione os sinais, bem como a direção em que o sinal é gravado.Marque a caixa Forçar Volume para obter um registro de todas as curvas de força e clique no botão Desligar na parte superior da janela principal do programa para ativar o loop de feedback Clique no botão Phase Core na janela HD principal para corrigir a sensibilidade do sistema óptico. A guia Versus Time da janela HD principal apresenta a função do sinal DFL versus tempo em tempo real. Selecione as partes dessa função que serão usadas para a determinação do nível de linha de base e para ajustar o modelo de contato para cálculos adicionais.Agora, defina o valor do ponto de verificação para 256 por 256 na janela principal do programa. Em seguida, defina a taxa de varredura para 0,2 hertz e clique no botão Executar para digitalizar a amostra. Depois que a digitalização parar, clique no botão Ativado na parte superior da janela principal para desligar o loop de feedback.Escolha Modo de contato no menu suspenso, abra a guia Abordagem e clique no botão Remover para se retirar da amostra. Clique no botão Dados para abrir o software de análise e salvar a saída. Abra o arquivo salvo no software de análise.Selecione o quadro de volume de força HD. Mantenha pressionada a tecla Control e selecione um quadro visual obtido na mesma direção de digitalização. Clique no botão Carregar Mapa Externo para ver onde as paredes celulares estão localizadas.Verifique os valores de rigidez InvOptSens e cantilever na guia principal. Abra a guia Adicional e verifique os parâmetros de dica e o modelo de contato. Clique em vários pontos nas paredes celulares do quadro visual e selecione apenas as curvas bem descritas pelo modelo.As áreas brancas no mapa do módulo correspondem a uma superestimação errônea do módulo de Young devido ao scanner atingir seu limite na direção Z. Esta imagem não é conveniente para ser usada como um mapa externo para uma seleção adicional de curvas de força satisfatórias. No entanto, o mapa de sinal DFL apresentado à direita é mais adequado aqui.Diferentes instrumentos podem se referir a sinais DFL como sinais de deflexão ou erro. O scanner que foi totalmente estendido ao tentar chegar ao fundo da amostra pode resultar em medições errôneas e até mesmo varreduras interrompidas. A presença de agarose pode ser verificada durante a obtenção da primeira varredura no modo de contato, pois as paredes celulares e alguns fundos celulares são visíveis em tais varreduras.No entanto, em caso de imobilização imprecisa, a superfície pode ser coberta com agarose, que mascara a topografia da amostra. De quatro curvas de força diferentes registradas em diferentes pontos da mesma parede celular, a curva registrada em 0,1 não mostra linha de base, o que significa que não há separação da ponta do cantilever da parede celular. A curva registrada em 0,3 mostra um ombro na parte que se aproxima indicando flexão da parede celular.Os pontos dois e quatro mostram curvas de força satisfatórias com valores de módulos semelhantes. A preparação da amostra e o exame exigem prática, mas podem ser dominados. Uma parte crucial deste protocolo é filtrar as curvas resultantes.Não confie em módulos, que foram calculados automaticamente. A mesma técnica pode ser usada para medir as forças de adesão ou dissipação de energia. Também pode ser importante para a descrição do comportamento viscose ou viscoelástico de alguns materiais.

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Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Micro-Mecânica Caracterização do tecido pulmonar Usando Microscopia de Força Atômica

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

Ensaios biofísicos para investigar as propriedades mecânicas do núcleo da célula Interphase: Aplicação de substrato Strain e Manipulação de microagulhas

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Metas de identificação de microRNAs humanos com o Sistema de ensaio de luciferase lightswitch usando 3&#39;UTR repórter-Constrói e um microRNA em células aderentes Mimic

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Profiling glicana de Polímeros da planta da parede celular usando Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Preparação da amostra para microscopia da força atômica de virion único e imagem de fluorescência de super-resolução

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Medição simultânea em pH endocítica e citossólicos Compartimentos em células vivas usando microscopia confocal

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Quantificação de alta resolução Celulose cristalina Acumulação em<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Raízes para monitorar celular específico do tecido da parede Modificações

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...