Name: characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дмитрия Суслова (Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия) и профессора Миру Пономареву (Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства, ФИЦ КАЗНЦ РАН, Казань, Россия) за предоставление семян кукурузы и ржи соответственно. Представленный метод разработан в рамках проекта Российского научного фонда No 18-14-00168, присужденного ЛК. Часть работ (получение представленных результатов) была выполнена АП при финансовой поддержке государственного задания для ФИЦ «Казанский научный центр РАН».

1. Пробоподготовка к измерениям AFM
<ol><li>Растительный материал: Стерилизовать семена кукурузы (Zea mays L.) и ржи (Secale cereale L.) 0,35% раствором NaOCl в течение 10 мин, промыть 3 раза дистиллированной водой, а затем выращивать гидропонно в темноте при 27 °C в течение 4 дней и 2 дней соотве?...

<ol>
	<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties.">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).</li><li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> Plos One. 8 (3), 57813 (2013).</li><li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy.">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).</li><li>Daher, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+growth+is+achieved+through+the+additive+mechanical+effect+of+material+anisotropy+and+elastic+asymmetry.">Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry.</a> Elife. 7, 38161 (2018).</li><li>Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+growth+symmetry+breaking+in+the+Arabidopsis+hypocotyl.">The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl.</a> Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).</li><li>Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+of+cell+wall+nano-mechanical+properties+along+and+across+elongating+primary+roots+of+maize.">Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).</li><li>Chiniquy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+novel+rice+genes+closely+related+to+the+Arabidopsis+IRX9,+IRX9L,+and+IRX14+genes+and+their+roles+in+xylan+biosynthesis.">Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Bidhendi, A. J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+quantify+primary+plant+cell+wall+mechanics.">Methods to quantify primary plant cell wall mechanics.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).</li><li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+Mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls:+at+tissue,+cellular,+and+subcellular+resolutions.">AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+by+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li><li>Yakubov, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nano-scale+mechanical+heterogeneity+of+primary+plant+cell+walls.">Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).</li><li>Zdunek, A., Kurenda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+elastic+properties+of+tomato+fruit+cells+with+an+atomic+force+microscope.">Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope.</a> Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).</li><li>Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+water+content+has+a+direct+effect+on+extensibility+in+growing+hypocotyls+of+sunflower+(Helianthus+annuus+L).">Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L).</a> Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).</li><li>Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+mapping+of+soft+materials+with+the+atomic+force+microscope:+methods,+theory+and+applications.">Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications.</a> Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).</li><li>Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+primary+cell+wall+nanomechanical+properties+in+internal+cells+of+non-fixed+maize+roots.">Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots.</a> Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).</li><li>Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+atomic+force+microscopy+to+measure+mechanical+properties+and+turgor+pressure+of+plant+cells+and+plant+tissues.">Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology.">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).</li><li>Braunsmann, C., Schaffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Note:+Artificial+neural+networks+for+the+automated+analysis+of+force+map+data+in+atomic+force+microscopy.">Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).</li></ol>

Механические свойства первичных клеточных стенок определяют направление и скорость роста растительных клеток, а значит, будущие размеры и форму растения. Метод на основе AFM, представленный здесь, дополняет существующие методы, которые используются для изучения свойств клеточных стен?...

Механические свойства клеточной стенки растения определяют форму клетки и ее способность расти. Например, растущий кончик пыльцевой трубки мягче, чем нерастающие части той же трубки1. Образованию примордий на меристеме Arabidopsis предшествует локальное снижение жесткости клеточной стенки на месте будущего примордия 2,3. Клеточные стенки Arabidopsis hypocotyl, которые параллельны основной оси роста и растут быстрее, мягче, чем те, которые перпендикулярны этой оси и растут медленнее 4,5. У корня кукурузы переход клеток от деления к удлинению сопровождался снижением модулей упругости во всех тканях корня. Модули оставались низкими в зоне удлинения и увеличивались в зоне позднего удлинения6.
Несмотря на наличие различных методов, большие массивы биохимической и генетической информации по биологии клеточных стенок, получаемые ежегодно, редко сравниваются с механическими свойствами клеточных стенок. Например, мутанты на генах, связанных с клеточной стенкой, часто имеют измененный рост и развитие 4,7,8, но редко описываются в терминах биомеханики. Одной из причин этого является сложность проведения измерений на клеточном и субклеточном уровнях. Атомно-силовая микроскопия (AFM) в настоящее время является основным подходом для таких анализов9.
В последние годы были проведены многочисленные исследования биомеханики клеточной стенки растений на основе AFM. Исследованы механические свойства клеточных стенок наружных тканей Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 и лука12, а также культивируемых клеток 13,14,15. Однако поверхностные клетки растения могут иметь клеточные стенки, механические свойства которых отличаются от механических свойств внутренних тканей6. Кроме того, растительные клетки находятся под давлением тургора, что делает их более жесткими. Чтобы избавиться от влияния тургорного давления, исследователям приходится использовать плазмолизирующие растворы 2,3,4,5,10,11 или разлагать полученные значения на тургор и вклады клеточной стенки12. Первый подход приводит к обезвоживанию образца и изменяет толщину и свойства клеточной стенки16, в то время как второй подход требует дополнительных измерений и сложной математики и применяется только к клеткам относительно простой формы12. Свойства клеточных стенок внутренних тканей могут быть оценены на криосекции17 или участках растительного материала, пропитанных смолой8. Однако оба метода предполагают обезвоживание и/или пропитку образцов, что неизбежно приводит к изменению свойств. Свойства изолированных или культивируемых клеток трудно соотнести с физиологией всего растения. Как культивирование, так и изоляция растительных клеток могут влиять на механические свойства их клеточных стенок.
Представленный здесь метод дополняет вышеупомянутые подходы. С его помощью можно исследовать первичные клеточные стенки любой ткани и на любой стадии развития растений. Секционирование и наблюдения AFM проводились в жидкости, что позволяет избежать обезвоживания образца. Проблема тургора была решена по мере разрезания клеток. Протокол описывает работу с корнями кукурузы и ржи, но любой другой образец может быть исследован, если он подходит для вибратомного сечения.
Описанные здесь исследования AFM были выполнены с использованием метода силы-объема. Различные инструменты используют разные названия для этого метода. Однако основной принцип тот же; карта силы-объема образца получается синусоидальным или треугольным движением консольного аппарата (или образца) для достижения определенной силы нагрузки в каждой анализируемой точке при регистрации консольного отклонения18. Результат объединяет топографическое изображение поверхности и массив кривых силы-расстояния. Каждая кривая используется для расчета деформации, жесткости, модуля Юнга, адгезии и рассеивания энергии в определенной точке. Аналогичные данные могут быть получены путем точечной силовой спектроскопии после сканирования в контактном режиме19, хотя это более трудоемко.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose, low melting point</td>
			<td>Helicon</td>
			<td>B-5000-0.1</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for section moving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NanoTools, Germany</td>
			<td>NT_B150_v0020-5</td>
			<td>Model: Biosphere B150-FM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>FMG01/50</td>
			<td>Model: FMG01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for vibratomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Heinz Herenz</td>
			<td>1042000</td>
			<td>for vibratomy and AFM calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageAnalysis P9 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM1000 epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>11591301</td>
			<td>for section check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova PX 3.4.1 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for experiments conducting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTEGRA Prima microscope with HD controller</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for AFM and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642062</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Leica VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>1404723512</td>
			<td>for sample sectioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy

Механические свойства первичных клеточных стенок определяют направление и скорость роста растительных клеток и, следовательно, будущие размеры и форму растения. Для измерения этих свойств было разработано много сложных методов; однако атомно-силовая микроскопия (АСМ) остается наиболее удобной для изучения упругости клеточной стенки на клеточном уровне. Одним из наиболее важных ограничений этого метода было то, что только поверхностные или изолированные живые клетки могут быть изучены. Здесь представлено использование атомно-силовой микроскопии для исследования механических свойств первичных клеточных стенок, принадлежащих внутренним тканям растительного тела. Этот протокол описывает измерения кажущегося модуля Юнга клеточных стенок в корнях, но метод также может быть применен к другим органам растений. Измерения проводятся на вибратомных участках растительного материала в жидкой клетке, что позволяет (i) избежать использования плазмолизирующих растворов или пропитки образца воском или смолой, (ii) сделать эксперименты быстрыми и (iii) предотвратить обезвоживание образца. Как антиклинальные, так и периклинальные клеточные стенки могут быть изучены, в зависимости от того, как образец был разделен. Различия в механических свойствах разных тканей могут быть исследованы в одном срезе. В протоколе описаны принципы планирования исследования, вопросы подготовки образцов и измерений, а также метод выбора силовых деформационных кривых во избежание влияния топографии на полученные значения модуля упругости. Метод не ограничен размером выборки, но чувствителен к размеру клеток (т.е. клетки с большим просветом трудно исследовать).

Типичные карты модулей упругости и DFL, а также кривые силы, полученные на корнях ржи и кукурузы описанным способом, представлены на фиг.2. На рисунке 2А показаны карты модулей упругости и DFL, полученные на поперечном сечении первичного корня ржи. Белые обла?...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

Исследования биомеханики клеточных стенок необходимы для понимания роста и морфогенеза растений. Следующий протокол предлагается исследовать тонкие первичные клеточные стенки во внутренних тканях молодых органов растений с помощью атомно-силовой микроскопии.

Характеристика механических свойств первичной клеточной стенки в органах живых растений с помощью атомно-силовой микроскопии

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

Рост растительных клеток контролируется механическими свойствами их клеточных стенок. Поэтому важно знать эти свойства в разных органах и тканях растений. Представленный здесь способ позволяет биомеханическую характеристику неподвижных и не обезвоженных клеточных стенок во внутренних тканях молодых растений.Начните с подготовки растворов и образца для вибратомного сечения. Налейте четырехмиллиметровый слой расплавленной 3%-агарозы на дно чашки Петри и дайте ей немного остыть, чтобы предотвратить термическое повреждение образца. Поместите около пяти миллиметров длиной три или четыре куска растительного органа горизонтально на агарозу.Примерно через 30-60 секунд на вершине первого слоя агарозы появится тонкая полутвердая пленка. Затем аккуратно насыпьте сверху второй слой. После того, как агароза полностью затвердеет, вырежьте блок, содержащий образец.Придайте блоку форму шестиугольной усеченной пирамиды, чтобы обеспечить его устойчивость при дальнейшем сечении. Перед началом секционирования образца с помощью вибратома приклейте блок к стадии вибратома с помощью цианоакрилатного клея. Поместите сцену в вибратом, так, чтобы один из углов пирамиды был обращен к лезвию вибратома, и налейте воду в ванну вибратома.Установите параметры сечения, такие как толщина сечения, скорость лезвия и частота вибрации, и вырежьте образец. Используя тонкую щетку, переместите секцию с водяной бани на стеклянную горку и поместите каплю воды на секцию, чтобы предотвратить ее высыхание. Проверив качество секции под световым микроскопом, выберите соответствующий участок, имеющий клеточную стенку перпендикулярно плоскости сечения.Затем обездвижите секцию для измерений атомно-силовой микроскопии, налив слой из одного миллилитра 1% расплавленной агарозы на дно крышки чашки Петри с помощью пипетки. После того, как агароза затвердеет, удалите лишнюю воду из секции, поднеся фильтровальную бумагу к ее краю. Аккуратно перенесите срез от слайда к центру крышки чашки Петри с помощью кисти.Затем осторожно добавьте 1% агарозы вокруг секции с помощью 20-микролитровой пипетки и налейте воду или другой раствор для атомно-силовой микроскопии в крышку чашки Петри с иммобилизованным сечением. Направьте образец под атомно-силовую микроскопическую консоль с помощью оптического микроскопа. Нажмите кнопку «Подход», а затем кнопку «Посадка», чтобы приблизиться к образцу в режиме контакта с заданным значением одного наноампера.Нажмите кнопку Сканирование, а затем кнопку Область. Выберите площадь 50 микрометров на 50 микрометров для сканирования. Нажмите кнопку «Переместить зонд» и проверьте всю область сканирования, переместив сканер над ней и найдя самую высокую точку в зависимости от степени протрузии сканера.Откройте вкладку Подход. Затем нажмите кнопку Удалить, чтобы удалить образец. Используя самую высокую точку в качестве цели, нажмите кнопку Landing, чтобы снова приблизиться к образцу.Затем проверьте поверхность еще раз, нажав на кнопку Move Probe и переместив сканер над ней. Установите скорость сканирования на 0,5 герц и установите размер сканирования на 50 микрометров на 50 микрометров, а точку сканирования на 64 на 64. Нажмите кнопку «Выполнить» и просканируйте, чтобы проверить поверхность образца и возможное загрязнение агарозой.После нажатия кнопки Вкл., выберите режим HDPlus в выпадающем меню в главном окне программы и установите заданное значение 0.1 наноампер в главном окне программы. В главной вкладке окна HD задайте параметры сканирования, соответствующие исследуемому образцу. Затем откройте вкладку «Шумы» в окне HD и введите резонансную частоту консольного устройства.Откройте вкладку «Квант» окна HD и введите IOS, консольную жесткость, радиус наконечника и угол. Выберите модель контакта, которая будет использоваться для расчетов в зависимости от геометрии наконечника. После этого откройте вкладку Scan окна HD и выберите сигналы, а также направление, в котором сигнал записывается.Установите флажок «Громкость усилия», чтобы получить запись всех кривых силы, и нажмите кнопку «Выкл.» в верхней части главного окна программы, чтобы включить петлю обратной связи Нажмите кнопку Phase Core в главном окне HD, чтобы исправить чувствительность оптической системы. Вкладка Versus Time главного окна HD представляет функцию сравнения сигнала DFL со временем в режиме реального времени. Выберите части этой функции, которые будут использоваться для определения базового уровня и для соответствия контактной модели для дальнейших расчетов.Теперь установите значение точки сканирования 256 на 256 в главном окне программы. Затем установите скорость сканирования на 0,2 герц и нажмите кнопку «Выполнить», чтобы отсканировать образец. После остановки сканирования нажмите кнопку «Вкл.» в верхней части главного окна, чтобы отключить петлю обратной связи.Выберите Режим контакта в раскрывающемся меню, откройте вкладку Подход и нажмите кнопку Удалить, чтобы отозвать образец. Нажмите кнопку Данные, чтобы открыть программное обеспечение для анализа и сохранить выходные данные. Откройте сохраненный файл в аналитическом программном обеспечении.Выберите кадр громкости силы HD. Удерживая нажатой клавишу Control, выберите один визуальный кадр, полученный в том же направлении сканирования. Нажмите кнопку Загрузить внешнюю карту, чтобы увидеть, где расположены клеточные стенки.Проверьте значения InvOptSens и консольной жесткости на главной вкладке. Откройте вкладку Дополнительно и проверьте параметры наконечника и контактную модель. Нажимайте на различные точки на клеточных стенках на визуальном кадре и выбирайте только те кривые, которые хорошо описаны моделью.Белые области на карте модулей соответствуют ошибочной переоценке модуля Юнга из-за того, что сканер достигает своего предела в направлении Z. Это изображение неудобно использовать в качестве внешней карты для дальнейшего выбора удовлетворительных кривых силы. Однако карта сигналов DFL, представленная справа, здесь лучше подходит.Различные приборы могут относиться к сигналам DFL как к сигналам отклонения или ошибки. Сканер, который был полностью расширен при попытке достичь нижней части образца, может привести к ошибочным измерениям и даже прерванному сканированию. Наличие агарозы может быть проверено при получении первого сканирования в контактном режиме, так как клеточные стенки и некоторые клеточные днища видны на таких сканированиях.Однако в случае неточной иммобилизации поверхность может быть покрыта агарозой, которая маскирует топографию образца. Из четырех различных кривых силы, зарегистрированных в разных точках одной и той же клеточной стенки, кривая, зарегистрированная при 0,1, не показывает базовой линии, что означает отсутствие отделения кончика консольной части от клеточной стенки. Кривая, зарегистрированная на уровне 0,3, показывает плечо на приближающейся части, указывающее на изгиб клеточной стенки.Точки вторая и четвертая показывают удовлетворительные кривые силы с аналогичными значениями модулей. Пробоподготовка и экспертиза требуют практики, но ее можно освоить. Важной частью этого протокола является фильтрация результирующих кривых.Не полагайтесь на модули, которые были рассчитаны автоматически. Этот же метод может быть использован для измерения сил адгезии или рассеивания энергии. Это также может быть важно для описания вискозного или вязкоупругого поведения некоторых материалов.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Измерение завод клеточной стенки Extension (Creep), индуцированный кислой и Альфа-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Живая клеточного ответа на механическое раздражение Учился по комплексному Оптические и атомно-силовой микроскопии

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Изображениями сотовый изменения формы в живых Drosophila Эмбрионы

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Микро-механические характеристики легочной ткани с помощью атомно-силовой микроскопии

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

Биофизические Анализы для исследования механических свойств клеточного ядра Interphase: Субстрат приложений Процедить и микроиглы Манипуляция

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Определение целей по правам микроРНК с Пробирной LightSwitch люциферазы системы с помощью 3&#39;UTR-репортер Формирует и микроРНК Mimic в прилипшие клетки

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Glycan Профилирование Plant Cell стены полимеров с использованием Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Подготовка образцов для одной микроскопии атомной силы Virion и флуоресценции супер-разрешения

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Измерение Одновременное рН в эндоцитотических и цитозольные отсеков в живых клетках с помощью конфокальной микроскопии

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Высокое разрешение Количественное кристаллической целлюлозы Накопление в<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Корни для мониторинга Тканеспецифическая клеточной стенки Модификации

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...