Name: characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
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Nos gustaría agradecer al Dr. Dmitry Suslov (Universidad Estatal de San Petersburgo, San Petersburgo, Rusia) y a la Prof. Mira Ponomareva (Instituto de Investigación Científica Tártara de Agricultura, FRC KazSC RAS, Kazán, Rusia) por proporcionar semillas de maíz y centeno, respectivamente. El método presentado fue desarrollado en el marco del Proyecto de la Fundación Rusa de Ciencias No. 18-14-00168 otorgado a LK. La parte del trabajo (obtención de los resultados presentados) fue realizada por AP con el apoyo financiero de la asignación gubernamental para el Centro Científico FRC Kazan de RAS.

1. Preparación de la muestra para mediciones de AFM
<ol><li>Material vegetal: Esterilizar las semillas de maíz (Zea mays L.) y centeno (Secale cereale L.) con una solución de NaOCl al 0,35% durante 10 min, lavar 3 veces con agua destilada y luego cultivar hidropónicamente en la oscuridad a 27 °C durante 4 días y 2 días, respectivamente. Se utilizaron raíces primarias para el experimento.</li>
	<li>Preparación de soluciones y muestra para la sección de vibratomo<ol><li>Prepar...

<ol>
	<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties.">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).</li><li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> Plos One. 8 (3), 57813 (2013).</li><li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy.">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).</li><li>Daher, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+growth+is+achieved+through+the+additive+mechanical+effect+of+material+anisotropy+and+elastic+asymmetry.">Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry.</a> Elife. 7, 38161 (2018).</li><li>Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+growth+symmetry+breaking+in+the+Arabidopsis+hypocotyl.">The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl.</a> Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).</li><li>Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+of+cell+wall+nano-mechanical+properties+along+and+across+elongating+primary+roots+of+maize.">Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).</li><li>Chiniquy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+novel+rice+genes+closely+related+to+the+Arabidopsis+IRX9,+IRX9L,+and+IRX14+genes+and+their+roles+in+xylan+biosynthesis.">Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Bidhendi, A. J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+quantify+primary+plant+cell+wall+mechanics.">Methods to quantify primary plant cell wall mechanics.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).</li><li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+Mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls:+at+tissue,+cellular,+and+subcellular+resolutions.">AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+by+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li><li>Yakubov, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nano-scale+mechanical+heterogeneity+of+primary+plant+cell+walls.">Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).</li><li>Zdunek, A., Kurenda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+elastic+properties+of+tomato+fruit+cells+with+an+atomic+force+microscope.">Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope.</a> Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).</li><li>Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+water+content+has+a+direct+effect+on+extensibility+in+growing+hypocotyls+of+sunflower+(Helianthus+annuus+L).">Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L).</a> Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).</li><li>Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+mapping+of+soft+materials+with+the+atomic+force+microscope:+methods,+theory+and+applications.">Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications.</a> Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).</li><li>Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+primary+cell+wall+nanomechanical+properties+in+internal+cells+of+non-fixed+maize+roots.">Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots.</a> Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).</li><li>Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+atomic+force+microscopy+to+measure+mechanical+properties+and+turgor+pressure+of+plant+cells+and+plant+tissues.">Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology.">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).</li><li>Braunsmann, C., Schaffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Note:+Artificial+neural+networks+for+the+automated+analysis+of+force+map+data+in+atomic+force+microscopy.">Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).</li></ol>

Las propiedades mecánicas de las paredes celulares primarias determinan la dirección y la tasa de crecimiento de las células vegetales y, por lo tanto, el tamaño y la forma futuros de la planta. El método basado en AFM presentado aquí complementa las técnicas existentes que se utilizan para estudiar las propiedades de las paredes celulares de las plantas. Permite investigar la elasticidad de las paredes celulares, que pertenecen a los tejidos internos de la planta. Utilizando el método presentado, se mapearon las...

Las propiedades mecánicas de la pared celular de la planta determinan la forma de la célula y su capacidad para crecer. Por ejemplo, la punta en crecimiento del tubo polínico es más suave que las partes que no crecen del mismo tubo1. La formación de primordios en el meristemo de Arabidopsis está precedida por una disminución local de la rigidez de la pared celular en el sitio del futuro primordio 2,3. Las paredes celulares de Arabidopsis hypocotyl, que son paralelas al eje de crecimiento principal y crecen más rápido, son más suaves que las que son perpendiculares a este eje y crecen más lentamente 4,5. En la raíz de maíz, la transición de las células de la división al alargamiento se acompañó de una disminución de los módulos elásticos en todos los tejidos de la raíz. Los módulos se mantuvieron bajos en la zona de elongación y aumentaron en la zona de elongación tardía6.
A pesar de la disponibilidad de varios métodos, las grandes cantidades de información bioquímica y genética sobre la biología de la pared celular obtenida anualmente rara vez se comparan con las propiedades mecánicas de las paredes celulares. Por ejemplo, los mutantes en genes relacionados con la pared celular a menudo tienen un crecimiento y desarrollo alterados 4,7,8, pero rara vez se describen en términos de biomecánica. Una de las razones de esto es la dificultad de realizar mediciones a nivel celular y subcelular. La microscopía de fuerza atómica (AFM) es actualmente el enfoque principal para tales análisis9.
En los últimos años, se han llevado a cabo numerosos estudios basados en AFM sobre biomecánica de la pared celular vegetal. Se han investigado las propiedades mecánicas de las paredes celulares de los tejidos externos de Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 y cebolla 12, así como de células cultivadas 13,14,15. Sin embargo, las células superficiales de una planta pueden tener paredes celulares cuyas propiedades mecánicas difieren de las de los tejidos internos6. Además, las células vegetales son presurizadas por turgencia, lo que las hace más rígidas. Para deshacerse de la influencia de la presión de turgencia, los investigadores tienen que utilizar soluciones plasmolizantes 2,3,4,5,10,11 o descomponer los valores obtenidos en turgencia y aportes de pared celular 12. El primer enfoque conduce a la deshidratación de la muestra y cambia el grosor y las propiedades de la pared celular16, mientras que el segundo enfoque requiere mediciones adicionales y matemáticas complicadas, y se aplica solo a células de forma relativamente simple12. Las propiedades de la pared celular de los tejidos internos pueden evaluarse en criosecciones17 o secciones de material vegetal impregnado con resina8. Sin embargo, ambos métodos implican deshidratación y/o impregnación de muestras, lo que inevitablemente conduce a cambios en las propiedades. Las propiedades de las células aisladas o cultivadas son difíciles de relacionar con la fisiología de toda la planta. Tanto el cultivo como el aislamiento de las células vegetales pueden afectar las propiedades mecánicas de sus paredes celulares.
El método presentado aquí complementa los enfoques antes mencionados. Usándolo, se pueden examinar las paredes celulares primarias de cualquier tejido y en cualquier etapa del desarrollo de la planta. Las observaciones de seccionamiento y AFM se realizaron en líquido, lo que evita la deshidratación de la muestra. El problema de la turgencia se resolvió a medida que se cortan las células. El protocolo describe el trabajo con raíces de maíz y centeno, pero cualquier otra muestra puede ser examinada si es adecuada para la sección de vibratomo.
Los estudios de MFA descritos aquí se realizaron utilizando la técnica de fuerza-volumen. Diferentes instrumentos usan diferentes nombres para este método. Sin embargo, el principio básico es el mismo; Un mapa fuerza-volumen de la muestra se obtiene mediante un movimiento sinusoidal o triangular del voladizo (o muestra) para lograr una cierta fuerza de carga en cada punto analizado, mientras se registra la deflexión del voladizo18. El resultado combina una imagen topográfica de la superficie y la matriz de curvas fuerza-distancia. Cada curva se utiliza para calcular la deformación, rigidez, módulo de Young, adhesión y disipación de energía en un punto específico. Se pueden obtener datos similares por espectroscopia de fuerza punto por punto después de escanear en el modode contacto 19, aunque lleva más tiempo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose, low melting point</td>
			<td>Helicon</td>
			<td>B-5000-0.1</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for section moving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NanoTools, Germany</td>
			<td>NT_B150_v0020-5</td>
			<td>Model: Biosphere B150-FM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>FMG01/50</td>
			<td>Model: FMG01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for vibratomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Heinz Herenz</td>
			<td>1042000</td>
			<td>for vibratomy and AFM calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageAnalysis P9 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM1000 epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>11591301</td>
			<td>for section check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova PX 3.4.1 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for experiments conducting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTEGRA Prima microscope with HD controller</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for AFM and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642062</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Leica VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>1404723512</td>
			<td>for sample sectioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy

Las propiedades mecánicas de las paredes celulares primarias determinan la dirección y la tasa de crecimiento de las células vegetales y, por lo tanto, el tamaño y la forma futuros de la planta. Se han desarrollado muchas técnicas sofisticadas para medir estas propiedades; sin embargo, la microscopía de fuerza atómica (AFM) sigue siendo la más conveniente para estudiar la elasticidad de la pared celular a nivel celular. Una de las limitaciones más importantes de esta técnica ha sido que solo se pueden estudiar células vivas superficiales o aisladas. Aquí se presenta el uso de la microscopía de fuerza atómica para investigar las propiedades mecánicas de las paredes celulares primarias pertenecientes a los tejidos internos del cuerpo vegetal. Este protocolo describe las mediciones del módulo aparente de Young de las paredes celulares en las raíces, pero el método también se puede aplicar a otros órganos de la planta. Las mediciones se realizan en secciones de material vegetal derivadas de vibratomas en una celda líquida, lo que permite (i) evitar el uso de soluciones plasmolizantes o impregnación de muestras con cera o resina, (ii) hacer que los experimentos sean rápidos y (iii) prevenir la deshidratación de la muestra. Se pueden estudiar tanto las paredes celulares anticlinales como las periclinas, dependiendo de cómo se seccionó la muestra. Las diferencias en las propiedades mecánicas de diferentes tejidos se pueden investigar en una sola sección. El protocolo describe los principios de planificación del estudio, los problemas con la preparación y las mediciones de la muestra, así como el método de selección de curvas de fuerza-deformación para evitar la influencia de la topografía en los valores obtenidos del módulo elástico. El método no está limitado por el tamaño de la muestra, pero es sensible al tamaño de la célula (es decir, las células con una gran luz son difíciles de examinar).

En la Figura 2 se presentan mapas típicos de módulo elástico y DFL, así como curvas de fuerza obtenidas en raíces de centeno y maíz por el método descrito. La Figura 2A muestra el módulo elástico y los mapas DFL obtenidos en la sección transversal de la raíz primaria de centeno. Las áreas blancas en el mapa de módulos (Figura 2A, izquierda) corresponden a una sobreestimación errónea del módulo de Young debido a que e...

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Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

Los estudios de biomecánica de la pared celular son esenciales para comprender el crecimiento y la morfogénesis de las plantas. Se propone el siguiente protocolo para investigar las paredes celulares primarias delgadas en los tejidos internos de órganos de plantas jóvenes utilizando microscopía de fuerza atómica.

Caracterización de las propiedades mecánicas de la pared celular primaria en órganos vegetales vivos mediante microscopía de fuerza atómica

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

El crecimiento de las células vegetales está controlado por las propiedades mecánicas de sus paredes celulares. Por lo tanto, es importante conocer estas propiedades en diferentes órganos y tejidos de las plantas. El método aquí presentado permite la caracterización biomecánica de paredes celulares no fijas y no deshidratadas en los tejidos internos de plantas jóvenes.Comience con la preparación de las soluciones y la muestra para la sección de vibratomo. Vierta una capa de cuatro milímetros de agarosa derretida al 3% en el fondo de la placa de Petri y deje que se enfríe ligeramente para evitar daños térmicos en la muestra. Coloque horizontalmente sobre la agarosa tres o cuatro piezas de cinco milímetros de largo del órgano vegetal.Alrededor de 30 a 60 segundos después, aparecerá una fina película semisólida sobre la primera capa de agarosa. Luego, vierta con cuidado una segunda capa en la parte superior. Después de que la agarosa esté completamente solidificada, corte el bloque que contiene la muestra.Dé forma al bloque en una pirámide truncada hexagonal para garantizar su estabilidad durante la sección posterior. Antes de comenzar la sección de la muestra con el vibratomo, pegue el bloque a la etapa de vibratomo con adhesivo de cianoacrilato. Coloque el escenario en el vibratomo, de modo que una de las esquinas de la pirámide se enfrente a la hoja del vibratomo y vierta agua en el baño de vibratomo.Establezca los parámetros de seccionamiento como el grosor de la sección, la velocidad de la cuchilla y la frecuencia de vibración y corte la muestra. Con un cepillo fino, mueva la sección del baño de agua a un tobogán de vidrio y coloque una gota de agua en la sección para evitar que se seque. Después de verificar la calidad de la sección bajo un microscopio óptico, seleccione la sección adecuada que tenga la pared celular perpendicular al plano de sección.Luego inmovilice la sección para mediciones de microscopía de fuerza atómica vertiendo una capa de un mililitro de agarosa fundida al 1% en el fondo de la tapa de la placa de Petri con una pipeta. Después de que la agarosa se haya solidificado, retire el exceso de agua de la sección llevando el papel de filtro a su borde. Transfiera con cuidado la sección de la diapositiva al centro de la tapa de la placa de Petri con un cepillo.Luego agregue cuidadosamente 1% de agarosa alrededor de la sección usando una pipeta de 20 microlitros y vierta el agua u otra solución para la microscopía de fuerza atómica en la tapa de la placa de Petri con la sección inmovilizada. Guiar la muestra bajo el voladizo de microscopía de fuerza atómica utilizando el microscopio óptico. Haga clic en el botón Aproximación y luego en el botón Aterrizaje para acercarse a la muestra en modo de contacto con un punto de ajuste de un nanoamperio.Haga clic en el botón Escanear y luego en el botón Área. Seleccione el tamaño de área de 50 micrómetros por 50 micrómetros para escanear. Haga clic en el botón Mover sonda y compruebe toda el área de escaneo moviendo el escáner sobre él y encontrando el punto más alto según el grado de protuberancia del escáner.Abra la pestaña Enfoque. Luego haga clic en el botón Eliminar para retractarse de la muestra. Usando el punto más alto como objetivo, haga clic en el botón Aterrizaje para acercarse de nuevo a la muestra.A continuación, compruebe la superficie de nuevo haciendo clic en el botón Mover sonda y moviendo el escáner sobre ella. Establezca la velocidad de escaneo en 0.5 hertzios y establezca el tamaño de escaneo en 50 micrómetros por 50 micrómetros y el punto de escaneo en 64 por 64. Haga clic en el botón Ejecutar y escanee para verificar la superficie de la muestra y su posible contaminación con agarosa.Después de hacer clic en el botón Activado, elija el modo HDPlus en el menú desplegable en la ventana principal del programa y establezca el punto de ajuste en 0.1 nanoamperios en la ventana principal del programa. En la pestaña principal de la ventana HD, establezca los parámetros de escaneo apropiados para la muestra estudiada. Luego abra la pestaña Ruidos en la ventana HD e ingrese la frecuencia de resonancia del voladizo.Abra la pestaña Quant de la ventana HD e ingrese el IOS, la rigidez en voladizo, el radio de la punta y el ángulo. Seleccione el modelo de contacto, que se utilizará para los cálculos en función de la geometría de la punta. Después de esto, abra la pestaña Escanear de la ventana HD y seleccione las señales, así como la dirección en la que se graba la señal.Marque la casilla Forzar volumen para obtener un registro de todas las curvas de fuerza y haga clic en el botón Apagado en la parte superior de la ventana principal del programa para activar el bucle de retroalimentación Haga clic en el botón Phase Core en la ventana principal de HD para corregir la sensibilidad del sistema óptico. La pestaña Versus Time de la ventana principal de HD presenta la función de la señal DFL versus tiempo en tiempo real. Seleccione las partes de esta función que se utilizarán para la determinación del nivel de referencia y para ajustar el modelo de contacto para cálculos posteriores.Ahora, establezca el valor del punto de escaneo en 256 por 256 en la ventana principal del programa. Luego, establezca la velocidad de escaneo en 0.2 hertz y haga clic en el botón Ejecutar para escanear la muestra. Después de que se detenga el escaneo, haga clic en el botón Activado en la parte superior de la ventana principal para desactivar el bucle de retroalimentación.Elija Modo de contacto en el menú desplegable, abra la pestaña Enfoque y haga clic en el botón Eliminar para retirarse de la muestra. Haga clic en el botón Datos para abrir el software de análisis y guardar la salida. Abra el archivo guardado en el software de análisis.Seleccione el fotograma de volumen de fuerza HD. Mantenga pulsada la tecla Control y seleccione un fotograma visual obtenido en la misma dirección de escaneo. Haga clic en el botón Cargar mapa externo para ver dónde se encuentran las paredes celulares.Compruebe InvOptSens y los valores de rigidez en voladizo en la pestaña principal. Abra la pestaña Adicional y verifique los parámetros de la punta y el modelo de contacto. Haga clic en varios puntos de las paredes celulares en el marco visual y seleccione solo aquellas curvas bien descritas por el modelo.Las áreas blancas en el mapa de módulos corresponden a una sobreestimación errónea del módulo de Young debido a que el escáner alcanza su límite en la dirección Z. Esta imagen no es conveniente para ser utilizada como un mapa externo para una selección adicional de curvas de fuerza satisfactorias. Sin embargo, el mapa de señal DFL presentado a la derecha es más adecuado aquí.Diferentes instrumentos pueden referirse a las señales DFL como señales de desviación o error. El escáner que se ha extendido completamente al intentar llegar a la parte inferior de la muestra puede provocar mediciones erróneas e incluso escaneos interrumpidos. La presencia de agarosa se puede verificar mientras se obtiene el primer escaneo en el modo de contacto, ya que las paredes celulares y algunos fondos celulares son visibles en dichos escaneos.Sin embargo, en caso de inmovilización inexacta, la superficie puede cubrirse con agarosa, que enmascara la topografía de la muestra. De cuatro curvas de fuerza diferentes registradas en diferentes puntos de la misma pared celular, la curva registrada en 0.1 no muestra una línea de base, lo que significa que no hay separación de la punta en voladizo de la pared celular. La curva registrada en 0,3 muestra un hombro en la parte que se aproxima que indica la flexión de la pared celular.Los puntos dos y cuatro muestran curvas de fuerza satisfactorias con valores de módulos similares. La preparación y el examen de la muestra requieren práctica, pero se puede dominar. Una parte crucial de este protocolo es filtrar las curvas resultantes.No confíe en los módulos, que se calcularon automáticamente. La misma técnica se puede utilizar para medir las fuerzas de adhesión o disipación de energía. También puede ser importante para la descripción de la viscosa o el comportamiento viscoelástico de algunos materiales.

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Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Celular imagen Cambiar forma de vida Drosophila Los embriones

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Micro-Mecánica Caracterización del tejido pulmonar con microscopía de fuerza atómica

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

Los ensayos biofísicos investigará las propiedades mecánicas del núcleo celular Interfase: Aplicación del sustrato deformación y manipulación de Microneedle

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Objetivos la identificación de los microARN humanos con el sistema de ensayo con luciferasa LightSwitch reportero 3&#39;UTR-Construye y microRNA un imitador de las células adherentes

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Perfiles de Polímeros Glycan la pared celular vegetal utilizando microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Preparación de muestras para microscopía de fuerza atómica de virión único e imágenes de fluorescencia de súper resolución

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Medición pH simultánea en Endocítica y citosólicas compartimentos en las células vivas usando microscopía confocal

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...