Name: characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Vi vill ge ett erkännande till Dr. Dmitry Suslov (Sankt Petersburg State University, Sankt Petersburg, Ryssland) och Prof. Mira Ponomareva (Tatar Scientific Research Institute of Agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Ryssland) för att tillhandahålla majs respektive rågfrön. Den presenterade metoden utvecklades inom ramen för den ryska vetenskapsstiftelsens projekt nr 18-14-00168 som tilldelades LK. Den del av arbetet (erhållande av de presenterade resultaten) utfördes av AP med ekonomiskt stöd från regeringsuppdraget för FRC Kazan Scientific Center of RAS.

1. Provberedning för AFM-mätningar
<ol><li>Växtmaterial: Sterilisera frön av majs (Zea mays L.) och råg (Secale cereale L.) med en 0,35% NaOCl-lösning i 10 min, tvätta 3x med destillerat vatten och växa sedan hydroponiskt i mörkret vid 27 ° C i 4 dagar respektive 2 dagar. Primära rötter användes för experimentet.</li>
	<li>Beredning av lösningar och prov för vibratomsektionering<ol><li>Förbered agaroslösning för rotinbäddning genom att lösa upp 3% (w / w) lågsmä...

<ol>
	<li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties.">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental Biology. 334 (2), 437-446 (2009).</li><li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> Plos One. 8 (3), 57813 (2013).</li><li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy.">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> Plant Journal. 67 (6), 1116-1123 (2011).</li><li>Daher, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anisotropic+growth+is+achieved+through+the+additive+mechanical+effect+of+material+anisotropy+and+elastic+asymmetry.">Anisotropic growth is achieved through the additive mechanical effect of material anisotropy and elastic asymmetry.</a> Elife. 7, 38161 (2018).</li><li>Peaucelle, A., Wightman, R., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+growth+symmetry+breaking+in+the+Arabidopsis+hypocotyl.">The control of growth symmetry breaking in the Arabidopsis hypocotyl.</a> Current Biology. 25 (13), 1746-1752 (2015).</li><li>Petrova, A., Gorshkova, T., Kozlova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradients+of+cell+wall+nano-mechanical+properties+along+and+across+elongating+primary+roots+of+maize.">Gradients of cell wall nano-mechanical properties along and across elongating primary roots of maize.</a> Journal of Experimental Botany. 72 (5), 1764-1781 (2021).</li><li>Chiniquy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+novel+rice+genes+closely+related+to+the+Arabidopsis+IRX9,+IRX9L,+and+IRX14+genes+and+their+roles+in+xylan+biosynthesis.">Three novel rice genes closely related to the Arabidopsis IRX9, IRX9L, and IRX14 genes and their roles in xylan biosynthesis.</a> Frontiers in Plant Science. 4, 83 (2013).</li><li>Majda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanochemical+polarization+of+contiguous+cell+walls+shapes+plant+pavement+cells.">Mechanochemical polarization of contiguous cell walls shapes plant pavement cells.</a> Developmental Cell. 43 (3), 290-304 (2017).</li><li>Bidhendi, A. J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+quantify+primary+plant+cell+wall+mechanics.">Methods to quantify primary plant cell wall mechanics.</a> Journal of Experimental Botany. 70 (14), 3615-3648 (2019).</li><li>Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-based+Mapping+of+the+elastic+properties+of+cell+walls:+at+tissue,+cellular,+and+subcellular+resolutions.">AFM-based Mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), e51317 (2014).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current Biology. 21 (20), 1720-1726 (2011).</li><li>Beauzamy, L., Derr, J., Boudaoud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+hydrostatic+pressure+in+plant+cells+by+using+indentation+with+an+atomic+force+microscope.">Quantifying hydrostatic pressure in plant cells by using indentation with an atomic force microscope.</a> Biophysical Journal. 108 (10), 2448-2456 (2015).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical Journal. 103 (3), 386-394 (2012).</li><li>Yakubov, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+nano-scale+mechanical+heterogeneity+of+primary+plant+cell+walls.">Mapping nano-scale mechanical heterogeneity of primary plant cell walls.</a> Journal of Experimental Botany. 67 (9), 2799-2816 (2016).</li><li>Zdunek, A., Kurenda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+elastic+properties+of+tomato+fruit+cells+with+an+atomic+force+microscope.">Determination of the elastic properties of tomato fruit cells with an atomic force microscope.</a> Sensors. 13 (9), 12175-12191 (2013).</li><li>Evered, C., Majevadia, B., Thompson, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+water+content+has+a+direct+effect+on+extensibility+in+growing+hypocotyls+of+sunflower+(Helianthus+annuus+L).">Cell wall water content has a direct effect on extensibility in growing hypocotyls of sunflower (Helianthus annuus L).</a> Journal of Experimental Botany. 58 (12), 3361-3371 (2007).</li><li>Torode, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branched+pectic+galactan+in+phloem-sieve-element+cell+walls:+implications+for+cell+mechanics.">Branched pectic galactan in phloem-sieve-element cell walls: implications for cell mechanics.</a> Plant Physiology. 176 (2), 1547-1558 (2018).</li><li>Garcia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+mapping+of+soft+materials+with+the+atomic+force+microscope:+methods,+theory+and+applications.">Nanomechanical mapping of soft materials with the atomic force microscope: methods, theory and applications.</a> Chemical Society Reviews. 49 (16), 5850-5884 (2020).</li><li>Kozlova, L., Petrova, A., Ananchenko, B., Gorshkova, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+primary+cell+wall+nanomechanical+properties+in+internal+cells+of+non-fixed+maize+roots.">Assessment of primary cell wall nanomechanical properties in internal cells of non-fixed maize roots.</a> Plants-Basel. 8 (6), 172 (2019).</li><li>Bovio, S., Long, Y. C., Moneger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+atomic+force+microscopy+to+measure+mechanical+properties+and+turgor+pressure+of+plant+cells+and+plant+tissues.">Use of atomic force microscopy to measure mechanical properties and turgor pressure of plant cells and plant tissues.</a> Journal of Visualized Experiments. (149), e59674 (2019).</li><li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy-based+mechanobiology.">Atomic force microscopy-based mechanobiology.</a> Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).</li><li>Braunsmann, C., Schaffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Note:+Artificial+neural+networks+for+the+automated+analysis+of+force+map+data+in+atomic+force+microscopy.">Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104 (2014).</li></ol>

De mekaniska egenskaperna hos de primära cellväggarna bestämmer riktningen och hastigheten för växtcelltillväxt, och därmed växtens framtida storlek och form. Den AFM-baserade metoden som presenteras här kompletterar befintliga tekniker som används för att studera egenskaperna hos växtcellväggar. Det gör det möjligt att undersöka elasticiteten hos cellväggar, som tillhör växtens inre vävnader. Med hjälp av den presenterade metoden kartlades de mekaniska egenskaperna hos cellväggar i olika vävnader ...

De mekaniska egenskaperna hos växtcellväggen bestämmer cellens form och dess förmåga att växa. Till exempel är pollenrörets växande spets mjukare än de icke-växande delarna av samma rör1. Primordiabildningen på Arabidopsis meristem föregås av en lokal minskning av cellväggsstyvheten på platsen för det framtida primordium 2,3. Cellväggarna i Arabidopsis hypocotyl, som är parallella med huvudtillväxtaxeln och växer snabbare, är mjukare än de som är vinkelräta mot denna axel och växer långsammare 4,5. I majsroten åtföljdes övergången av celler från delning till förlängning av en minskning av elastisk moduli i alla vävnader i roten. Moduli förblev låg i förlängningszonen och ökade i den sena förlängningszonen6.
Trots tillgången på olika metoder jämförs sällan de stora uppsättningarna av biokemisk och genetisk information om cellväggsbiologi som erhålls årligen med cellväggarnas mekaniska egenskaper. Till exempel har mutanter på cellväggsrelaterade gener ofta förändrad tillväxt och utveckling 4,7,8, men beskrivs sällan i termer av biomekanik. En av anledningarna till detta är svårigheten att genomföra mätningar på cellulär och subcellulär nivå. Atomkraftsmikroskopi (AFM) är för närvarande den primära metoden för sådana analyser9.
Under de senaste åren har många AFM-baserade studier på växtcellväggsbiomekanik genomförts. De mekaniska egenskaperna hos cellväggarna i de yttre vävnaderna i Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 och lök 12, liksom hos odlade celler13,14,15, har undersökts. De ytliga cellerna i en växt kan emellertid ha cellväggar vars mekaniska egenskaper skiljer sig från de inre vävnaderna6. Dessutom trycksätts växtceller av turgor vilket gör dem styvare. För att bli av med påverkan av turgortrycket måste forskare använda plasmolyserande lösningar 2,3,4,5,10,11 eller sönderdela de erhållna värdena i turgor- och cellväggsbidrag 12. Det första tillvägagångssättet leder till provuttorkning och ändrar cellväggens tjocklek och egenskaper16, medan det andra tillvägagångssättet kräver ytterligare mätningar och komplicerad matematik och endast gäller celler med relativt enkel form12. Cellväggsegenskaperna hos inre vävnader kan utvärderas på kryosektioner17 eller delar av växtmaterial impregnerat med harts8. Båda metoderna innebär dock uttorkning och/eller impregnering av prover, vilket oundvikligen leder till förändringar i egenskaper. Egenskaperna hos isolerade eller odlade celler är svåra att relatera till hela växtens fysiologi. Både odling och isolering av växtceller kan påverka de mekaniska egenskaperna hos deras cellväggar.
Metoden som presenteras här kompletterar de ovan nämnda tillvägagångssätten. Med hjälp av det kan de primära cellväggarna i vilken vävnad som helst och vid varje stadium av växtutveckling undersökas. Sektionering och AFM-observationer utfördes i vätska som undviker uttorkning av provet. Problemet med turgor löstes när cellerna skärs. Protokollet beskriver arbete med majs- och rågrötter, men alla andra prover kan undersökas om det är lämpligt för vibratomsektionering.
AFM-studierna som beskrivs här utfördes med hjälp av kraftvolymtekniken. Olika instrument använder olika namn för denna metod. Grundprincipen är dock densamma; En kraftvolymkarta över provet erhålls genom en sinusformad eller triangulär rörelse av utskjutaren (eller provet) för att uppnå en viss belastningskraft vid varje analyserad punkt, samtidigt som den utskjutande böjningen18 registreras. Resultatet kombinerar en topografisk bild av ytan och uppsättningen kraftavståndskurvor. Varje kurva används för att beräkna deformation, styvhet, Youngs modul, vidhäftning och energiavledning vid en specifik punkt. Liknande data kan erhållas genom punkt-för-punkt-kraftspektroskopi efter skanning i kontaktläge19, även om det är mer tidskrävande.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose, low melting point</td>
			<td>Helicon</td>
			<td>B-5000-0.1</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for section moving</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NanoTools, Germany</td>
			<td>NT_B150_v0020-5</td>
			<td>Model: Biosphere B150-FM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cantilevers</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>FMG01/50</td>
			<td>Model: FMG01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for vibratomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Heinz Herenz</td>
			<td>1042000</td>
			<td>for vibratomy and AFM calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageAnalysis P9 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM1000 epifluorescence microscope</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>11591301</td>
			<td>for section check</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOCl</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>for seed sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nova PX 3.4.1 Software</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for experiments conducting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTEGRA Prima microscope with HD controller</td>
			<td>NT-MDT, Russia</td>
			<td>-</td>
			<td>for AFM and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 mm</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>for sample fixation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 1000 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642092</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 2-20 &#181;L</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4642062</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome Leica VT 1000S</td>
			<td>Leica Biosystems, Germany</td>
			<td>1404723512</td>
			<td>for sample sectioning</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterizing mechanical properties of primary cell wall in living plant organs using atomic force microscopy

De mekaniska egenskaperna hos de primära cellväggarna bestämmer riktningen och hastigheten för växtcelltillväxt och därmed växtens framtida storlek och form. Många sofistikerade tekniker har utvecklats för att mäta dessa egenskaper; atomkraftmikroskopi (AFM) är dock fortfarande den mest praktiska för att studera cellväggselasticitet på cellulär nivå. En av de viktigaste begränsningarna med denna teknik har varit att endast ytliga eller isolerade levande celler kan studeras. Här presenteras användningen av atomkraftmikroskopi för att undersöka de mekaniska egenskaperna hos primära cellväggar som tillhör de inre vävnaderna i en växtkropp. Detta protokoll beskriver mätningar av den uppenbara Youngs modul av cellväggar i rötter, men metoden kan också tillämpas på andra växtorgan. Mätningarna utförs på vibratom-härledda delar av växtmaterial i en flytande cell, vilket gör det möjligt att (i) undvika användning av plasmolyserande lösningar eller provimpregnering med vax eller harts, (ii) göra experimenten snabba och (iii) förhindra uttorkning av provet. Både antikliniska och perikliniska cellväggar kan studeras, beroende på hur provet sektionerades. Skillnader i de mekaniska egenskaperna hos olika vävnader kan undersökas i en enda sektion. Protokollet beskriver principerna för studieplanering, problem med provberedning och mätningar, samt metoden för att välja kraftdeformationskurvor för att undvika påverkan av topografi på de erhållna värdena för elastisk modul. Metoden är inte begränsad av provstorlek utan är känslig för cellstorlek (dvs celler med stor lumen är svåra att undersöka).

Typiska elastiska modul- och DFL-kartor, liksom kraftkurvor erhållna på råg- och majsrötter med den beskrivna metoden, presenteras i figur 2. Figur 2A visar elastisk modul och DFL-kartor erhållna på den tvärgående delen av rågens primära rot. De vita områdena i modulkartan (figur 2A, vänster) motsvarar en felaktig överskattning av Youngs modul på grund av att skannern når sin gräns i z-riktningen. Denna bild är inte...

Watch this Scientific Journal Video about Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

Studier av cellväggsbiomekanik är viktiga för att förstå växttillväxt och morfogenes. Följande protokoll föreslås för att undersöka tunna primära cellväggar i de inre vävnaderna hos unga växtorgan med hjälp av atomkraftmikroskopi.

Karakterisera mekaniska egenskaper hos primär cellvägg i levande växtorgan med hjälp av atomkraftsmikroskopi

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

Växtcelltillväxt styrs av de mekaniska egenskaperna hos deras cellväggar. Därför är det viktigt att känna till dessa egenskaper i olika organ och vävnader hos växterna. Metoden som presenteras här möjliggör biomekanisk karakterisering av icke-fixerade och icke-dehydrerade cellväggar i de inre vävnaderna hos unga växter.Börja med att förbereda lösningarna och provet för vibratomsektionering. Häll ett fyra millimeter lager smält 3% agaros på botten av petriskålen och låt den svalna något för att förhindra termisk skada på provet. Placera cirka fem millimeter långa tre eller fyra bitar av växtorganet horisontellt på agarosen.Cirka 30 till 60 sekunder senare kommer en tunn halvfast film att visas ovanpå det första agarosskiktet. Häll sedan försiktigt ett andra lager ovanpå. När agarosen är helt stelnad, skär ut blocket som innehåller provet.Forma blocket till en sexkantig stympad pyramid för att säkerställa dess stabilitet under ytterligare sektionering. Innan provsnittet påbörjas med vibratomet, limma blocket på vibratomsteget med cyanoakrylatlim. Placera scenen i vibratomen, så att ett av pyramidhörnen vetter mot vibratombladet och häll vatten i vibratombadet.Ställ in sektionsparametrarna som sektionstjocklek, bladhastighet och vibrationsfrekvens och klipp provet. Använd en fin borste, flytta sektionen från vattenbadet till en glasskiva och placera en droppe vatten på sektionen för att förhindra att den torkar ut. Efter att ha kontrollerat kvaliteten på sektionen under ett ljusmikroskop, välj rätt sektion med cellvägg vinkelrätt mot sektionsplanet.Immobilisera sedan sektionen för atomkraftsmikroskopimätningar genom att hälla ett lager av en milliliter 1% smält agaros på botten av petriskålens lock med en pipett. När agarosen har stelnat, ta bort överflödigt vatten från sektionen genom att föra filterpapper till kanten. Överför försiktigt sektionen från bilden till mitten av petriskålens lock med en borste.Tillsätt sedan försiktigt 1% agaros runt sektionen med en 20 mikroliter pipett och häll vattnet eller annan lösning för atomkraftmikroskopin i petriskålens lock med den immobiliserade sektionen. Styr provet under atomkraftsmikroskopin med hjälp av det optiska mikroskopet. Klicka på knappen Tillvägagångssätt och sedan på landningsknappen för att närma sig provet i kontaktläge med ett börvärde på en nanoampere.Klicka på skanningsknappen och sedan på knappen Område. Välj områdesstorleken på 50 mikrometer med 50 mikrometer för att skanna. Klicka på knappen Flytta sond och kontrollera hela skanningsområdet genom att flytta skannern över den och hitta den högsta punkten baserat på graden av skannerutsprång.Öppna fliken Tillvägagångssätt. Klicka sedan på knappen Ta bort för att dra tillbaka från provet. Använd den högsta punkten som mål och klicka på knappen Landning för att närma dig exemplet igen.Kontrollera sedan ytan igen genom att klicka på knappen Flytta sond och flytta skannern över den. Ställ in skanningshastigheten till 0,5 hertz och ställ in skanningsstorleken till 50 mikrometer med 50 mikrometer och skanningspunkten till 64 x 64. Klicka på knappen Kör och skanna för att kontrollera provets yta och det är möjligt att förorena med agaros.När du har klickat på On-knappen väljer du HDPlus-läget i rullgardinsmenyn i programmets huvudfönster och ställer in börvärdet till 0,1 nanoampere i huvudprogramfönstret. På huvudfliken i HD-fönstret ställer du in skanningsparametrarna som är lämpliga för det studerade provet. Öppna sedan fliken Brus i HD-fönstret och ange cantileverens resonansfrekvens.Öppna fliken Quant i HD-fönstret och ange IOS, cantilever-styvhet, spetsradie och vinkel. Välj kontaktmodell, som kommer att användas för beräkningar beroende på spetsgeometri. Öppna sedan fliken Skanna i HD-fönstret och välj signalerna, liksom i vilken riktning signalen spelas in.Markera rutan Force Volume för att få ett register över alla kraftkurvor och klicka på Av-knappen högst upp i huvudprogramfönstret för att slå på återkopplingsslingan Klicka på Phase Core-knappen i HD-huvudfönstret för att korrigera känsligheten hos det optiska systemet. Fliken Versus Time i HD-huvudfönstret visar funktionen för DFL-signalen kontra tiden i realtid. Välj de delar av denna funktion som ska användas för bestämning av baslinjenivå och för att passa kontaktmodellen för ytterligare beräkningar.Ställ nu in skanningspunktsvärdet till 256 x 256 i programmets huvudfönster. Ställ sedan in skanningshastigheten till 0,2 hertz och klicka på knappen Kör för att skanna provet. När skanningen har stoppats klickar du på På-knappen högst upp i huvudfönstret för att stänga av återkopplingsslingan.Välj kontaktläge i rullgardinsmenyn, öppna fliken Tillvägagångssätt och klicka på knappen Ta bort för att dra tillbaka från exemplet. Klicka på knappen Data för att öppna analysprogramvaran och spara utdata. Öppna den sparade filen i analysprogramvaran.Välj HD-kraftvolymramen. Håll ned kontrolltangenten och välj en visuell ram som erhållits i samma skanningsriktning. Klicka på knappen Ladda extern karta för att se var cellväggarna finns.Kontrollera värdena för InvOptSens och utskjutande styvhet på huvudfliken. Öppna fliken Ytterligare och kontrollera tipsparametrarna och kontaktmodellen. Klicka på olika punkter på cellväggarna på den visuella ramen och välj bara de kurvor som beskrivs väl av modellen.De vita områdena i modulkartan motsvarar en felaktig överskattning av Youngs modul på grund av att skannern når sin gräns i Z-riktningen. Denna bild är inte lämplig att användas som en extern karta för ytterligare val av tillfredsställande kraftkurvor. DFL-signalkartan som presenteras till höger passar dock bättre här.Olika instrument kan hänvisa till DFL-signaler som avböjnings- eller felsignaler. Skannern som har förlängts helt medan du försöker nå botten av provet kan resultera i felaktiga mätningar och till och med avbrutna skanningar. Agarosnärvaron kan kontrolleras medan du får den första skanningen i kontaktläget eftersom cellväggarna och vissa cellbottnar är synliga på sådana skanningar.Vid felaktig immobilisering kan ytan emellertid täckas med agaros, vilket maskerar provtopografin. Av fyra olika kraftkurvor som registrerats vid olika punkter i samma cellvägg visar kurvan som registrerats vid 0,1 ingen baslinje, vilket innebär ingen separation av utskjutande spets från cellväggen. Kurvan som registrerats vid 0,3 visar en axel på den närmande delen som indikerar böjning av cellväggen.Punkterna två och fyra visar tillfredsställande kraftkurvor med liknande modulvärden. Provberedning och undersökning kräver övning, men det kan behärskas. En viktig del av detta protokoll är att filtrera resulterande kurvor.Lita inte på moduli, som beräknades automatiskt. Samma teknik kan användas för att mäta vidhäftningskrafterna eller energiavledningen. Det kan också vara viktigt för beskrivning av viskos eller viskoelastiskt beteende hos vissa material.

Research

JoVE Journal

Biology

Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Measuring Plant Cell Wall Extension Creep Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin

Mätning Plant Cell Wall Extension (Creep) induceras av surt pH-värde och Alpha-Expansin

Growing plant cell walls characteristically exhibit a property known as 'acid growth', by which we mean they are more extensible at low pH (&lt; 5) 1. The ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Levande cell Svar på mekanisk stimulering studerats av integrerad optisk och atomkraftsmikroskopi

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Imaging Cell Shape Förändring Living Drosophila Embryon

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Micro-Mechanical Characterization of Lung Tissue Using Atomic Force Microscopy

Mikromekaniska Karakterisering av lungvävnad Använda atomkraftsmikroskopi

Matrix stiffness strongly influences growth, differentiation and function of adherent cells1-3.  On the macro scale the stiffness of tissues and organs ...

Biophysical Assays to Probe the Mechanical Properties of the Interphase Cell Nucleus: Substrate Strain Application and Microneedle Manipulation

Biofysiska analyser för att undersöka mekaniska egenskaper Interphase cellkärnan: grundmaterial Sila Ansökan och Microneedle Manipulation

In most eukaryotic cells, the nucleus is the largest organelle and is typically 2 to 10 times stiffer than the surrounding cytoskeleton; consequently, the ...

Identifying Targets of Human microRNAs with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter Constructs and a microRNA Mimic in Adherent Cells

Identifiera mål om mänskliga mikroRNA med lightswitch luciferas analyssystem med 3&#39;UTR-reporter Konstruerar och ett mikroRNA Mimic i Vidhäftande Cells

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression and play a role in many biological processes.  More than 700 human miRNAs have been ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Glykan Profilering av växtcellväggnedbrytande Polymerer med Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Provberedning för single virion atomic force mikroskopi och superupplösning fluorescensavbildning

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Simultaneous pH Measurement in Endocytic and Cytosolic Compartments in Living Cells using Confocal Microscopy

Samtidig pH-mätning i endocytic och Cytosoliska fack i levande celler med hjälp av konfokalmikroskopi

Intracellular pH is tightly regulated and differences in pH between the cytoplasm and organelles have been reported1. Regulation of cellular pH is crucial ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Högupplöst Kvantifiering av kristallin cellulosa Ackumulering i<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Roots att övervaka Vävnadsspecifik cellvägg Ändringar

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...