Deze techniek zorgde voor een completer en 3D-beeld van hele transparante organen en was nuttig voor kwantificering, niet alleen van replicerende, maar ook slapende parasiet- en immuunfactorcellen. Deze techniek stelt ons in staat om de speciale associatie van parasieten, immuuncellen en de weefselschade als gevolg van de infectie te bepalen. Epitoop immunostaining en DNA-etikettering waren ook vergelijkbaar met deze techniek.
Dit protocol werd effectief gebruikt voor het beoordelen van behandelingsresultaten in muismodellen van de ziekte van Chagas. Een behandeling van hogere individuele doses, minder vaak gegeven gedurende een langere behandelingsperiode, elimineert zowel replicerende als slapende parasieten. Caleb Hawkins, een onderzoekstechnicus uit het laboratorium van Rick Tarleton, demonstreert de procedure.
Na het euthanaseren, ontleden en fixeren van de organen van een geïnfecteerde muis zoals beschreven in het manuscript, dompelt u individuele organen onder in 10 milliliter van 50% met water verdunde CUBIC-L, met zacht schudden bij kamertemperatuur in conische buizen van 50 milliliter 's nachts beschermd tegen licht. Vervang de volgende dag 50% CUBIC-L door 10 milliliter 100% CUBIC-L en incubeer gedurende zes dagen bij 37 graden Celsius, terwijl de buis plat op de shaker-incubator blijft. Aan het einde van deze incubatieperiode moeten de weefsels bijna volledig transparant zijn.
Was de transparante organen twee keer met PBS gedurende twee uur bij 37 graden Celsius, met zacht schudden. Breng bij elke wasbeurt de weefsels over naar een nieuwe conische buis van 50 milliliter om Triton X-100 te verwijderen. Verdun voor DNA-kleuring de in de handel verkrijgbare nucleïnezuurkleurstof in vijf milliliter kleuringsbuffer op 1:2.500.
Dompel vervolgens het weefsel onder in een conische buis van 15 milliliter met nucleaire kleurstofoplossing en incubeer bij 37 graden Celsius, met zachte rotatie gedurende vijf dagen in een staande positie. Was het weefsel drie keer met 15 milliliter 3D nucleaire vlekkenwasbuffer gedurende twee uur bij kamertemperatuur, met zacht schudden. Bereken de vereiste hoeveelheid primaire en secundaire antilichamen.
Meng primaire en secundaire antilichamen in een amberkleurige buis van twee milliliter en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 1,5 uur. Meng voor bufferuitwisseling 7,5 milliliter 2x HV1 3D immunostaining buffer met 7,5 milliliter dubbel gedestilleerd water. Dompel het weefselmonster onder in de buffer en incubeer gedurende 1,5 uur bij 32 graden Celsius, met zacht schudden in een conische buis van 15 milliliter in een horizontale positie.
Verzamel het weefselmonster uit de bufferuitwisselingsmedia en dompel het onder in de antilichaamkleuringsoplossing. Incubeer weefsels individueel gedurende een week bij 32 graden Celsius en schud de buizen voorzichtig in een staande positie weg van het licht. Verplaats de weefselmonsters naar vier graden Celsius en incubeer in een staande positie.
Na het afkoelen van de HV1 3D immunostaining wasbuffer tot vier graden Celsius, wast u het monster tweemaal met 15 milliliter buffer op vier graden Celsius gedurende 30 minuten, elk met zacht schudden in een horizontale positie. Verdun formaline tot 1% in HV1 3D immunostaining wasbuffer en dompel het monster onder in acht milliliter van de oplossing gedurende 24 uur bij vier graden Celsius, met zacht schudden. Incubeer het monster nu gedurende een uur in verse 1% formaline-oplossing bij 37 graden Celsius en was het gedurende twee uur in 15 milliliter PBS bij 25 graden Celsius.
Dompel transparante organen onder in een conische buis van 50 milliliter met vijf milliliter 50% water verdunde CUBIC-R +oplossing bij kamertemperatuur, met zacht schudden. Vervang het door vijf milliliter 100% CUBIC-R + en incubeer met zacht schudden gedurende twee dagen. Droog de weefsels met Kimwipes en breng ze vervolgens over naar vijf milliliter montageoplossing in een kweekplaat met zes putten en incubeer ze bij kamertemperatuur.
Hecht de weefsels aan de microscoopmonsterhouder met behulp van gelsuperlijm. Dompel de monsters onder in het microscoopkwartscuvet gevuld met 120 milliliter montageoplossing. Stel ze dwars voor op hun lengteas en hecht het hart, met de apex en de aorta horizontaal uitgelijnd.
3D gereconstrueerd Trypanosoma cruzi-geïnfecteerd hart vertoonde een hoger aandeel geïnfecteerde cellen in het atrium, vergeleken met ventrikels. Slapende parasieten kunnen in het hart worden geïdentificeerd, zoals afgebeeld in de 3D-vergrote inzetstukken. ZsGreen1-tot expressie brengende T-cellen, evenals Trypanosoma cruzi-geïnfecteerde cellen, werden gevisualiseerd in de skeletspieren van een CD8-reportermuis geïnfecteerd met Trypanosoma cruzi.
3D-zoom-ins van 3D-gereconstrueerde afbeeldingen identificeerden T-cellen in het gebied van een geïnfecteerde cel. De interface van T-cellen in gastheer-geïnfecteerde cellen werd gevisualiseerd door confocale microscopie. In het hart van een immunodeficiënte muis werden gastheercellen gedetecteerd die waren geïnfecteerd met twee verschillende stammen van Trypanosoma cruzi, en het snijden door de weefsels toonde overvloedige met parasieten geïnfecteerde cellen in de hartboezems op verschillende weefseldiepten.
Immunodetectie van vasculatuur in trypanosoma cruzi-geïnfecteerd en geklaard hart onthult de ingewikkelde vasculatuur van het hart. Met parasieten geïnfecteerde cellen konden worden waargenomen in de hartboezems. Nucleaire kleuring van skeletspieren toonde een opeenhoping van kernen in gebieden met weinig of niet-detecteerbare tdTomato-parasieten.
Het stimuleren van tdTomato en GFP parasiet reporter markers met antilichamen tegen RFP, en GFP, en hele geklaarde skeletspieren resulteerde in sterke fluorescentie. De kritieke punten zijn dus de incubatietijd in de CUBIC-buffer, de verdunnings- en incubatietijd in de DNA-kleurstof, de incubatietijd in de antilichamen en de incubatietijd in de gebroken index-matchingoplossing. Het gebruik van extra kleuring, met specifieke antilichamen kleurstof en snelle reactie, zou het potentieel van deze techniek aanzienlijk kunnen vergroten, waardoor de detectie van meerdere cellen, processen en structuur in intacte organen mogelijk wordt.
We hebben nu een betere en completere manier om de immuuncellen te verkennen die verantwoordelijk zijn voor het doden van de parasieten, de weefsels waar de parasieten chronisch blijven bestaan en de distributie van de specifieke medicijnen in de weefsels.