Name: determining binding affinity (kd) of radiolabeled antibodies to immobilized antigens
Uploaded: 2022-06-23T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Binding Affinity KD of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens at JoVE.com

يشكر المؤلفون 3D Imaging على إنتاج [89Zr] Zr-oxalate والدكتورة شيري مورس في Janssen Pharmaceuticals لتوفير الأجسام المضادة.

ملاحظة: ارجع إلى الشكل 2 للحصول على تمثيل بياني للبروتوكول.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63927/63927fig02.jpg"> الشكل 2: مخطط البروتوكول. يشار إلى تسميات الصفوف والأعمدة كدليل لإعداد لوحة 96 بئرا القابلة للكسر. يظهر ?...

<ol>
	<li>Krecisz, P., Czarnecka, K., Krolicki, L., Mikiciuk-Olasik, E., Szymanski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiolabeled+Peptides+and+Antibodies+in+Medicine.">Radiolabeled Peptides and Antibodies in Medicine.</a> Bioconjugate Chemistry. 32 (1), 25-42 (2021).</li><li>Dun, Y., Huang, G., Liu, J., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoPET+imaging+of+hematological+malignancies:+From+preclinical+promise+to+clinical+reality.">ImmunoPET imaging of hematological malignancies: From preclinical promise to clinical reality.</a> Drug Discovery Today. 27 (4), 1196-1203 (2022).</li><li>Lohrmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retooling+a+Blood-Based+Biomarker:+Phase+I+assessment+of+the+high-affinity+CA19-9+antibody+HuMab-5B1+for+immuno-pet+imaging+of+pancreatic+cancer.">Retooling a Blood-Based Biomarker: Phase I assessment of the high-affinity CA19-9 antibody HuMab-5B1 for immuno-pet imaging of pancreatic cancer.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7014-7023 (2019).</li><li>Pandit-Taskar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I/II+study+for+analytic+validation+of+89Zr-J591+immunoPET+as+a+molecular+imaging+agent+for+metastatic+prostate+cancer.">A phase I/II study for analytic validation of 89Zr-J591 immunoPET as a molecular imaging agent for metastatic prostate cancer.</a> Clinical Cancer Research. 21 (23), 5277-5285 (2015).</li><li>Rousseau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+clinical+results+of+a+novel+immuno-PET+theranostic+probe+in+human+epidermal+growth+factor+receptor+2-negative+breast+cancer.">Initial clinical results of a novel immuno-PET theranostic probe in human epidermal growth factor receptor 2-negative breast cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 61 (8), 1205-1211 (2020).</li><li>Moek, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theranostics+using+antibodies+and+antibody-related+therapeutics.">Theranostics using antibodies and antibody-related therapeutics.</a> Journal of Nuclear Medicine. 58 (2), 83-90 (2017).</li><li>Chomet, M., van Dongen, G., Vugts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+radiolabeling+of+antibodies+with+common+and+uncommon+radiometals+for+preclinical+and+clinical+immuno-PET.">State of the art in radiolabeling of antibodies with common and uncommon radiometals for preclinical and clinical immuno-PET.</a> Bioconjugate Chemistry. 32 (7), 1315-1330 (2021).</li><li>Kumar, K., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiochemistry,+production+processes,+labeling+methods,+and+immunoPET+imaging+pharmaceuticals+of+Iodine-124.">Radiochemistry, production processes, labeling methods, and immunoPET imaging pharmaceuticals of Iodine-124.</a> Molecules. 26 (2), 414 (2021).</li><li>Vosjan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+and+radiolabeling+of+monoclonal+antibodies+with+zirconium-89+for+PET+imaging+using+the+bifunctional+chelate+p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine.">Conjugation and radiolabeling of monoclonal antibodies with zirconium-89 for PET imaging using the bifunctional chelate p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine.</a> Nature Protocols. 5 (4), 739-743 (2010).</li><li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bioconjugation+and+radiosynthesis+of+89Zr-DFO-labeled+antibodies.">The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52521 (2015).</li><li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoPET:+concept,+design,+and+applications.">ImmunoPET: concept, design, and applications.</a> Chemical Reviews. 120 (8), 3787-3851 (2020).</li><li>Tavar&#233;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+immuno-PET+imaging+method+to+monitor+CD8-dependent+responses+to+immunotherapy.">An effective immuno-PET imaging method to monitor CD8-dependent responses to immunotherapy.</a> Cancer Research. 76 (1), 73-82 (2016).</li><li>Tavar&#233;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+antibody+fragments+for+immuno-PET+imaging+of+endogenous+CD8++T+cells+in+vivo.">Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (3), 1108-1113 (2014).</li><li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoenzymatic+strategy+for+the+synthesis+of+site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+multimodal+PET+and+optical+imaging.">Chemoenzymatic strategy for the synthesis of site-specifically labeled immunoconjugates for multimodal PET and optical imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (12), 2123-2128 (2014).</li><li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+methodology+for+the+site-specific+radiolabeling+of+antibodies+based+on+catalyst-free+click+chemistry.">Enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).</li><li>Kristensen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+89Zr-DFO-trastuzumab+improves+immuno-reactivity+and+tumor+uptake+for+immuno-PET+in+a+subcutaneous+HER2-positive+xenograft+mouse+model.">Site-specifically labeled 89Zr-DFO-trastuzumab improves immuno-reactivity and tumor uptake for immuno-PET in a subcutaneous HER2-positive xenograft mouse model.</a> Theranostics. 9 (15), 4409-4420 (2019).</li><li>Maguire, J. J., Kuc, R. E., Davenport, A. P., Davenport, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Radioligand binding assays and their analysis. in Receptor Binding Techniques. , 31-77 (2012).</li><li>Davenport, A. P., Russell, F. D., Mather, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioligand+bindsing+assays:+theory+and+practice.">Radioligand bindsing assays: theory and practice.</a> Current Directions in Radiopharmaceutical Research and Development. , 169-179 (1996).</li><li>Cavaliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+[89Zr]ZrDFO-amivantamab+bispecific+to+EGFR+and+c-MET+for+PET+imaging+of+triple+negative+breast+cancer.">Development of [89Zr]ZrDFO-amivantamab bispecific to EGFR and c-MET for PET imaging of triple negative breast cancer.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 48 (2), 383-394 (2021).</li><li>Marquez, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+(89)Zr-pertuzumab+in+breast+cancer+xenografts.">Evaluation of (89)Zr-pertuzumab in breast cancer xenografts.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (11), 3988-3995 (2014).</li><li>Marquez-Nostra, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+PET+imaging+of+glycoprotein+non-metastatic+melanoma+B+in+triple+negative+breast+cancer:+feasibility+of+an+antibody-based+companion+diagnostic+agent.">Preclinical PET imaging of glycoprotein non-metastatic melanoma B in triple negative breast cancer: feasibility of an antibody-based companion diagnostic agent.</a> Oncotarget. 8 (61), 104303-104314 (2017).</li><li>Ghai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+[(89)Zr]DFO-elotuzumab+for+immunoPET+imaging+of+CS1+in+multiple+myeloma.">Development of [(89)Zr]DFO-elotuzumab for immunoPET imaging of CS1 in multiple myeloma.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 48 (5), 1302-1311 (2021).</li><li>McKnight, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+EGFR+and+HER3+through+(89)Zr-labeled+MEHD7945A+(Duligotuzumab).">Imaging EGFR and HER3 through (89)Zr-labeled MEHD7945A (Duligotuzumab).</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li></ol>

كجزء من تطوير rAbs ، من المهم التأكد من ارتباط rAb على وجه التحديد بهدفه بتقارب ربط عال. يمكن أن يفيد تحديد تقارب الارتباط ما إذا كان التفاعل المناعي ل rAb يتأثر بالاقتران الإشعاعي من خلال اختبار التشبع الإشعاعي باستخدام مستضد مجمد. يمكن استخدام تحديد ارتباط rAb ب BSA لتحديد الارتباط غير المحدد لق?...

الأجسام المضادة ذات العلامات الإشعاعية (rAb) لها مجموعة متنوعة من الاستخدامات في الطب. في حين يتم استخدام الغالبية العظمى في علم الأورام كعوامل تصوير وعلاجية ، هناك تطبيقات تصوير للالتهابات المرتبطة بالروماتيزم وأمراض القلب والأعصاب1. التصوير rAbs لديه حساسية عالية للكشف عن الآفات ولديه القدرة على المساعدة في اختيار المريض للعلاج2،3،4،5. كما أنها تستخدم للعلاج بسبب خصوصيتها لمستضداتها الخاصة. في استراتيجية تعرف باسم theranostics ، يتم استخدام نفس rAb لكل من التصوير والعلاج6.
من الناحية المثالية ، فإن الجسم المضاد المختار لوضع العلامات الإشعاعية هو واحد ثبت بالفعل أن لديه تقارب وخصوصية ربط عالية باستخدام طرق غير موسومة إشعاعيا. يمكن تحقيق وضع العلامات الإشعاعية للأجسام المضادة عن طريق التعديل الكيميائي المباشر للأجسام المضادة مع النويدات المشعة التي تشكل روابط تساهمية مستقرة (مثل اليود المشع) ، أو بشكل غير مباشر عن طريق الاقتران مع المخلبات التي تنسق لاحقا مع المعادن المشعة 7,8. وضع العلامات الإشعاعية المباشرة مثل اليود المشع يعدل على وجه التحديد التيروزين وبقايا الهيستيدين على الجسم المضاد. إذا كانت هذه المخلفات مهمة لربط المستضدات ، فإن هذا الاقتران الإشعاعي سيغير تقارب الربط. وعلى العكس من ذلك، هناك العديد من البروتوكولات المعمول بها للاقتران ووضع العلامات الإشعاعية غير المباشرة للأجسام المضادة. على سبيل المثال ، المخلب الشائع المستخدم لربط الزركونيوم-89 (89Zr) لتصوير PET للأجسام المضادة هو p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine (DFO) ، والذي يقترن عشوائيا ببقايا ليسين من الجسم المضاد 9,10. إذا كانت هناك بقايا ليسين في منطقة ربط المستضدات ، فإن الاقتران في هذه المواقع يمكن أن يعيق ارتباطا بالمستضد بشكل معقم وبالتالي يعرض ربط الأجسام المضادة بالمستضدات للخطر. وبالتالي ، فإن طرق الاقتران الإشعاعي المختلفة المستخدمة في وضع العلامات الإشعاعية غير المباشرة أو المباشرة للأجسام المضادة يمكن أن تؤثر على التفاعل المناعي ، والذي يعرف بأنه قدرة الاقتران الإشعاعي للأجسام المضادة على الارتباط بمستضده 7,11. يمكن لطرق الاقتران الخاصة بالموقع التحايل على هذا القيد ، ولكن هذه التقنيات تتطلب هندسة الأجسام المضادة لدمج بقايا السيستين الإضافية أو الخبرة في التفاعلات الأنزيمية على بقايا الكربوهيدرات12،13،14،15،16. بمجرد وضع علامة إشعاعية على الجسم المضاد ، من المهم اختبار ما إذا كان يتم الاحتفاظ بالتفاعل المناعي كجزء من توصيف rAb. تتمثل إحدى طرق قياس التفاعل المناعي في تحديد التقارب الملزم ل rAb.
الغرض من هذا البروتوكول هو وصف عملية لتحديد التقارب الملزم ل rAbs باستخدام اختبار تشبع راديوي ثابت لتحديد ارتباط مستضد rAb. ويرد في الشكل 1 بيان بالاتجاه الملزم. ستزداد كمية المستضد المرتبط مع إضافة المزيد من rAb إلى كمية ثابتة من المستضد المجمد. بمجرد تشبع جميع مواقع ربط المستضدات ، سيتم الوصول إلى هضبة ، ولن يكون لإضافة المزيد من rAbs أي تأثير على كمية المستضد المرتبط. في هذا النموذج ، ثابت تفكك التوازن (KD) هو تركيز الجسم المضاد الذي يشغل نصف مستقبلات المستضد17. يمثل K D مدى ارتباط الجسم المضاد بهدفه مع KD أقل يتوافق مع تقارب ربط أعلى. وقد أفيد سابقا أن rAb المثالي يجب أن يكون KD من 1 نانومولار أو أقلمن 18. ومع ذلك ، تم تطوير rAbs أحدث مع KD في نطاق نانومولار منخفض ، وتعتبر مناسبة لتطبيقات التصوير غير الباضعة19،20،21،22. معلمة أخرى يمكن تحديدها في اختبار التشبع الإشعاعي ل rAbs هي Bmax ، والتي تتوافق مع الحد الأقصى لكمية ربط المستضدات. يمكن استخدام Bmax لحساب عدد جزيئات المستضد إذا لزم الأمر.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63927/63927fig01.jpg"> الشكل 1: منحنى ربط التشبع التمثيلي. يتم رسم النسبة المئوية للمستضد المرتبط مقابل زيادة تركيزات الأجسام المضادة المضافة إلى كمية ثابتة من المستضد. تظهر النوافذ المنبثقة أنها ملزمة في نقاط مختلفة. يتم عرض التركيز والربط المقابل ل KD و Bmax ، على التوالي. تم إنشاء هذا الرقم مع BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63927/63927fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
هذا الفحص مهم بشكل خاص لبنى الأجسام المضادة ثنائية النوعية ذات العلامات الإشعاعية لتحديد KD لكل ذراع منطقة ربط مستضد شظايا (Fab) من الجسم المضاد ثنائي النوعية الموسوم إشعاعيا مع المستضدات الخاصة به. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد KD لكل ذراع Fab على حدة على المستضدات المجمدة لتحديد ما إذا كان التقارب الملزم لكل ذراع Fab للمستضد الخاص به قد تأثر بشكل مستقل بعد الاقتران الإشعاعي. ويتضح هذا البروتوكول من خلال استخدام أميفانتاماب المسمى إشعاعيا، وهو جسم مضاد ثنائي النوعية لمستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) وبروتينات الانتقال الوسيط الظهاري السيتوبلازمي (cMET)19. كما استخدمت كأمثلة19 الأجسام المضادة أحادية الذراع المصنفة إشعاعيا، حيث يرتبط أحد أذرع Fab ب EGFR (α-EGFR) أو ب cMET (α-cMET) وذراع Fab الآخر هو عنصر تحكم متساوي النوع. هذا البروتوكول مناسب أيضا لأي جسم مضاد يحمل علامة إشعاعية مع مستضد معروف يمكن شل حركته. في هذا البروتوكول ، تتم إضافة سلسلة تخفيف من rAb إلى كمية ثابتة من المستضد المثبت في آبار معينة محددة لكل ذراع Fab من rAb. يضاف rAb أيضا إلى الآبار التي تم حظرها فقط باستخدام ألبومين مصل البقر (BSA) ، بدون مستضد ، لتحديد الارتباط غير المحدد. لتحديد الربط المحدد ، يتم طرح الربط غير المحدد للمستضد المعطل من إجمالي ربط rAb. ثم يتم استخدام منحنى ربط التشبع الناتج لتحديد KD ، كما هو موضح أعلاه.
تتمثل إحدى مزايا هذه الطريقة في زيادة قابلية التكرار عند استخدام المستضدات النقية مقارنة باستخدام خطوط الخلايا كمصدر للمستضدات ، بالنظر إلى أن مستويات التعبير عن المستضدات يمكن أن تتأثر أثناء زراعة الخلايا وأن خطوط الخلايا المختلفة لها مستويات متغيرة من تعبير المستضد. في حالة الأجسام المضادة ثنائية النوعية ذات العلامات المشعة ، قد لا تتوفر خطوط الخلايا التي تعبر فقط عن أحد المستضدات دون الآخر ، مما يجعل توصيف التقارب الملزم لأذرع Fab الفردية أمرا صعبا للغاية. ومن الجدير بالذكر أن الميزة الرئيسية لطريقة فحص التشبع الإشعاعي على الطرق غير الموسومة إشعاعيا هي التوصيف المحدد لتقارب ربط rAb دون مساهمة الجزء غير المقترن من rAb. على حد علم المؤلفين ، لا توجد حاليا تقنيات تنقية لفصل rAb عن الجسم المضاد الأم غير المقترن. وبالنظر إلى الحجم الصغير نسبيا للمخلب والنويدات المشعة، فإن مساهمتهما في الوزن الجزيئي الكلي لل rAb ضئيلة في كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. وبالتالي ، فإن المنتج الناتج عن أي تقنية لوضع العلامات الإشعاعية هو دائما تقريبا خليط من rAb والجسم المضاد الأم غير المقترن. إن توصيف تقارب الربط باستخدام اختبار التشبع الموسوم إشعاعيا يضمن أن المنتج الذي يتم اختباره هو rAb فقط.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Counter</td>
			<td>Hidex</td>
			<td>Hidex Automatic Gamma Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>version 9.2; used for statistical analyses in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno Breakable MaxiSorp 96-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>473768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Sealing Tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3506-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining binding affinity (kd) of radiolabeled antibodies to immobilized antigens

يعد تحديد تقارب الارتباط (KD) جانبا مهما من جوانب توصيف الأجسام المضادة ذات العلامات الإشعاعية (rAb). عادة ، يتم تمثيل تقارب الارتباط بثابت تفكك التوازن ، KD ، ويمكن حسابه على أنه تركيز الأجسام المضادة التي يتم فيها شغل نصف مواقع ربط الأجسام المضادة عند التوازن. يمكن تعميم هذه الطريقة على أي جسم مضاد يحمل علامة إشعاعية أو سقالات أخرى من البروتين والببتيد. وعلى النقيض من الطرق القائمة على الخلايا، فإن اختيار المستضدات المجمدة مفيد بشكل خاص للتحقق من صحة تقاربات الارتباط بعد التخزين طويل الأجل للأجسام المضادة، والتمييز بين التقاربات الملزمة لأذرع منطقة ربط المستضدات الشظايا (Fab) في تركيبات الأجسام المضادة ثنائية النوعية، وتحديد ما إذا كان هناك تباين في التعبير عن المستضد بين خطوط الخلايا المختلفة. تتضمن هذه الطريقة شل حركة كمية ثابتة من المستضد إلى آبار محددة على صفيحة قابلة للكسر من 96 بئرا. ثم ، تم حظر الربط غير المحدد في جميع الآبار مع ألبومين مصل البقر (BSA). في وقت لاحق ، تمت إضافة rAb في تدرج تركيز لجميع الآبار. تم اختيار مجموعة من التركيزات للسماح ل rAb بالوصول إلى التشبع ، أي تركيز الأجسام المضادة التي ترتبط فيها جميع المستضدات باستمرار ب rAb. في الآبار المعينة بدون مستضد مشدود ، يمكن تحديد الربط غير المحدد ل rAb. من خلال طرح الربط غير المحدد من الربط الكلي في الآبار باستخدام مستضد مجمد ، يمكن تحديد ربط محدد ل rAb بالمستضد. تم حساب KD من rAb من منحنى ربط التشبع الناتج. على سبيل المثال ، تم تحديد تقارب الارتباط باستخدام amivantamab المسمى إشعاعيا ، وهو جسم مضاد ثنائي النوعية لمستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) وبروتينات الانتقال الوسيط الوسيط الظهاري (cMET).

تحسب هذه الطريقة تقارب الربط (KD) ل rAb بناء على فحص ربط التشبع حيث تمت إضافة تركيزات مختلفة من rAb إلى كمية ثابتة من المستضد المجمد. يجب أن يتبع منحنى الربط النمو اللوغاريتمي حيث يكون حادا في البداية ثم الهضاب عندما يكون المستضد مشبعا. لضمان دقة KD المحددة ، يجب أن تكون تركيزات rAb عال?...

Watch this Scientific Journal Video about Determining Binding Affinity KD of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens at JoVE.com

Determining Binding Affinity KD of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

هنا ، يتم وصف طريقة لتحديد تقارب الارتباط (KD) للأجسام المضادة ذات العلامات المشعة للمستضدات المجمدة. KD هو ثابت تفكك التوازن الذي يمكن تحديده من تجربة ربط التشبع عن طريق قياس الارتباط الكلي والمحدد وغير المحدد لجسم مضاد يحمل علامة إشعاعية بتركيزات مختلفة لمستضدها.

تحديد تقارب الارتباط (KD) للأجسام المضادة ذات العلامات المشعة للمستضدات المجمدة

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is ...

يمكن لهذه الطريقة تحديد التقارب الملزم للجسم المضاد الموسوم إشعاعيا لمستضده. وسوف يقيس أيضا خصوصية الربط. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة البسيطة هي التوصيف المحدد للتقارب الملزم للجسم المضاد المشع فقط دون تدخل من الجسم المضاد الأبوي غير المقترن.تتحقق هذه التقنية كميا من قدرة الجسم المضاد الموسوم إشعاعيا على الارتباط بهدفه. هذا مهم للتطبيقات في التصوير النووي وفي العلاج النووي في مجموعة متنوعة من الأمراض. ستوضح الإجراء إريكا بيليتزكي ، وهي زميلة دراسات عليا من مختبري.للبدء ، قم بإعداد مخزن مؤقت للتجميد بإضافة 191 ملليغرام من بيكربونات الصوديوم و 23.9 ملليغرام من كربونات الصوديوم إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. ثم ، أضف 40 ملليلتر من الماء 18 ميجا أوم وتذوب عن طريق الدوامة. الآن ، اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 9.0 قبل رفع الحجم الإجمالي إلى 50 ملليلتر.بعد ذلك ، قم بإعداد 200 ملليلتر من مخزن الغسيل المؤقت عن طريق إضافة 200 ملليلتر من PBS و 100 ميكرولتر من Tween 20 إلى زجاجة 250 ملليلتر. قم أيضا بإعداد 50 ملليلتر من المخزن المؤقت الملزم عن طريق إضافة 50 ملليغرام من BSA و 25 ميكرولتر من Tween 20 إلى 50 ملليلتر من PBS واخلطها عن طريق الدوامة. أضف 1.5 جرام من BSA إلى 50 ملليلتر من PBS لإعداد المخزن المؤقت للحجب والدوامة بلطف للخلط.تمييع المستضد في المخزن المؤقت للتجميد. ثم خذ صفيحة قابلة للكسر ، 96 بئرا ، مسطحة القاع وأضف 100 ميكرولتر من المستضد إلى قاع كل بئر من 24 بئرا في مصفوفة ثمانية في ثلاثة. غطي اللوحة بشريط مانع للتسرب واحتضنها عند أربع درجات مئوية طوال الليل.في اليوم التالي ، اغسل الطبق ثلاث مرات باستخدام مخزن مؤقت للغسيل. اقلب اللوحة بسرعة في الحوض للتخلص من السائل واضغط على اللوحة على كومة من المناشف الورقية لإزالة السائل الزائد. ثم ، إلى الآبار التي تحتوي على المستضد ، أضف 300 ميكرولتر من مخزن الغسيل العازل لكل بئر باستخدام ماصة متعددة القنوات.أضف 300 ميكرولتر من العازل المانع لكل بئر إلى كل من 24 بئرا مغلفة بالمستضدات و 24 بئرا فارغة من الصفيحة المكونة من 96 بئرا. ثم ، احتضن الطبق لمدة ساعة واحدة في درجة الحرارة المحيطة واغسل كل بئر من الطبق ثلاث مرات باستخدام 300 ميكرولتر من الغسيل المؤقت. قم بعمل تخفيفات تسلسلية ثلاثية الأضعاف للجسم المضاد الموسوم إشعاعيا في المخزن المؤقت الملزم لثمانية صفوف مخصصة من A إلى H على اللوحة.أولا ، احسب حجم الأجسام المضادة ذات العلامات الإشعاعية اللازمة لصنع محلول 1.2 ملليلتر من التركيز الأول. ثم ، أضف 800 ميكرولتر من العازلة الملزمة إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المسماة B إلى H وأضف الحجم المطلوب من المخزن المؤقت للربط إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق المسمى A.أضف الحجم المحسوب للأجسام المضادة ذات العلامات الإشعاعية إلى الأنبوب A والدوامة بلطف. ثم ، قم بالدوران لأسفل باستخدام جهاز طرد مركزي صغير لجمع كل السوائل في قاع الأنبوب.بعد ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من السائل من اثنين من A إلى أنبوب B.بعد الدوامة ، قم بتدويرها باستخدام جهاز طرد مركزي صغير الصغر. وبالمثل ، أضف محلولا من الأنبوب B إلى الأنبوب C ، ومن C إلى D ، وحتى الأنبوب H.أضف 100 ميكرولتر من كل تخفيف لكل بئر إلى ثلاثة آبار مثبتة بالمستضد وثلاثة آبار مسدودة باستخدام BSA فقط. الآن ، أضف 100 ميكرولتر من كل تخفيف إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المسماة A Standard إلى H Standard واحفظ هذه الأنابيب كمعايير للأجسام المضادة ذات العلامات الإشعاعية ليتم فحصها في عداد غاما.احتضن الطبق لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية مع هزاز لطيف. تسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيق لكل بئر كما هو موضح في المخطوطة. قم بشفط الجسم المضاد الموسوم إشعاعيا من آبار الصفيحة المكونة من 96 بئرا باستخدام شفاط فراغي.الآن ، باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 300 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت إلى كل بئر. استنشق المخزن المؤقت للغسيل وكرر الغسيل أربع مرات أخرى. قم بتقسيم الآبار إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المناسبة.عد النشاط الإشعاعي في الأنابيب مع وضع علامة على المستضد على أنه H1 و H2 و H3 و H3 إلى A1 و A2 و A3 ، ثم مع وضع علامة BSA فقط على أنها H4 و H5 و H6 و A4 و A5 و A6 باستخدام عداد غاما. أظهر أميفانتاماب الموسوم إشعاعيا ارتباطا محددا لبروتينات EGFR و cMET. وبالمثل ، تم الاحتفاظ بالتقاربات الملزمة بواسطة fabs ذات الذراع الواحدة ذات العلامات المشعة المرتبطة ببروتينات EGFR و cMET.أظهرت مخططات ربط التشبع أنه عندما تكون تركيزات الأجسام المضادة ذات العلامات المشعة منخفضة للغاية ، لم يتم تحقيق التشبع ، كما هو موضح في المنحنى الخطي. أدت تركيزات الأجسام المضادة ذات العلامات الإشعاعية التي كانت عالية جدا إلى التشبع دون نمو لوغاريتمي متميز ، كما هو موضح في الهضبة الأفقية. أيضا ، شوهد ارتباط غير محدد مرتفع بسبب تركيزات عالية من الأجسام المضادة ذات العلامات الإشعاعية.قد يستغرق هذا الإجراء محاولات متعددة لتحسين نطاق التركيز لكل جسم مضاد محدد يحمل علامة إشعاعية. استخدم البيانات من النتائج السلبية للمساعدة في تصميم التجارب المستقبلية. بمجرد معرفة التقارب الملزم ، يمكن استخدامه كمعيار للفحوصات المخبرية الأخرى كجزء من توصيف الجسم المضاد الموسوم إشعاعيا.

Research

JoVE Journal

Medicine

Determining Binding Affinity (KD) of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

قياس وعلاج الحول في قمع

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Determining The Electromyographic Fatigue Threshold Following a Single Visit Exercise Test

تحديد عتبة Electromyographic التعب بعد واحدة زيارة ممارسة اختبار

Theoretically, the electromyographic (EMG) fatigue threshold is the exercise intensity an individual can maintain indefinitely without the need to recruit ...

Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT

Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT

تحديد الجلوكوز الأيض حركية عن طريق<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG مايكرو-PET / CT

This paper describes the use of 18F-FDG and micro-PET/CT imaging to determine in vivo glucose metabolism kinetics in mice (and is transferable to rats). ...

A Clinical Trial Assessing the Safety, Efficacy, and Delivery of Olive-Oil-Based Three-Chamber Bags for Parenteral Nutrition

تجربة سريرية لتقييم سلامة وفعالية وتسليم أكياس ثلاث غرف من زيت الزيتون للتغذية بالحقن

Limited evidence exists to precisely estimate efficacy and safety differences between parenteral nutrition (PN) prepared using olive-oil-based ...

Determining and Controlling External Power Output During Regular Handrim Wheelchair Propulsion

تحديد ومراقبة خرج الطاقة الخارجية أثناء دفع كرسي متحرك منتظم

The use of a manual wheelchair is critical to 1% of the world&#39;s population. Human powered wheeled mobility research has considerably matured, which ...

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

رصد PD-1-حظر الأجسام المضادة ملزمة الخلايا التائية المستمدة من قطرة من الدم المحيطي

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers

التحضير البيولوجي والتقنية الميكانيكية لتحديد الخصائص اللزجة المرنة للألياف المناطقية

Elasticity is essential to the function of tissues such as blood vessels, muscles, and lungs. This property is derived mostly from the extracellular ...

Improved Renal Denervation Mitigated Hypertension Induced by Angiotensin II Infusion

تحسين إزالة التعصيب الكلوي تخفيف ارتفاع ضغط الدم الناجم عن ضخ الأنجيوتنسين الثاني

The benefits of renal sympathetic denervation (RDN) on blood pressure have been proved in a large number of clinical trials in recent years. However, the ...

Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma

Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma

التنبؤ بعلم الأدوية الشبكي والتحقق التجريبي من آلية عمل Trichosanthes-Fritillaria thunbergii ضد سرطان الرئة الغدي

We aimed to study the mechanism of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii in treating lung adenocarcinoma (LUAD) based on network pharmacology and ...

Standardized Tuina Manipulation for Knee Osteoarthritis in Rats

Tuina Manipulation to Reduce Inflammation and Cartilage Loss in Knee Osteoarthritis Rats

Author Spotlight: Understanding the Mechanism of Tuina Manipulation in Rats 

التلاعب Tuina للحد من الالتهاب وفقدان الغضروف في الفئران هشاشة العظام في الركبة

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its ...