Name: determining binding affinity (kd) of radiolabeled antibodies to immobilized antigens
Uploaded: 2022-06-23T13:40:00
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Gli autori ringraziano 3D Imaging per la produzione di [89Zr]Zr-ossalato e la dottoressa Sheri Moores di Janssen Pharmaceuticals per aver fornito anticorpi.

NOTA: fare riferimento alla Figura 2 per una rappresentazione grafica del protocollo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63927/63927fig02.jpg"> Figura 2: Schema del protocollo. Le etichette di riga e colonna sono indicate come guida per la configurazione della piastra frangibile a 96 pozzetti. Il legame anticipato è mostrato in un pozzo di esempio ...

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Come parte dello sviluppo di rAbs, è importante garantire che un rAb si leghi specificamente al suo target con un'elevata affinità di legame. La determinazione dell'affinità di legame può informare se l'immunoreattività del rAb è influenzata dalla radioconiugazione attraverso il test di saturazione del radioligato utilizzando l'antigene immobilizzato. La determinazione del legame di rAb alla BSA può essere utilizzata per quantificare il legame non specifico per misurare il legame specifico all'antigene immobilizza...

Gli anticorpi radiomarcati (rAb) hanno una varietà di usi in medicina. Mentre la maggior parte sono utilizzati in oncologia come agenti di imaging e terapeutici, ci sono applicazioni di imaging per l'infiammazione correlata alla reumatologia, la cardiologia e la neurologia1. Imaging rAbs ha un'alta sensibilità per rilevare le lesioni e ha il potenziale per aiutare nella selezione del paziente per il trattamento 2,3,4,5. Sono anche usati per la terapia a causa della loro specificità per i rispettivi antigeni. In una strategia nota come teranostica, lo stesso rAb viene utilizzato sia per l'imaging che per il trattamento6.
Idealmente, l'anticorpo scelto per la radioetichettatura è già dimostrato di avere un'elevata affinità e specificità di legame utilizzando metodi non radiomarcati. La radioelabazione degli anticorpi può essere ottenuta tramite modifica chimica diretta degli anticorpi con un radionuclide che forma legami covalenti stabili (es. radioiodio), o indirettamente tramite coniugazione con chelanti che successivamente si coordinano ai radiometalli 7,8. La radioetichettatura diretta, ad esempio con il radioiodio, modifica specificamente i residui di tirosina e istidina sull'anticorpo. Se questi residui sono importanti per il legame con l'antigene, allora questa radioconiugazione altererebbe l'affinità di legame. Al contrario, esistono molteplici protocolli stabiliti per la coniugazione e la radioetichettatura indiretta degli anticorpi. Ad esempio, un chelante comune utilizzato per legare lo zirconio-89 (89Zr) per l'imaging PET degli anticorpi è il p-isotiocianatobenzil-desferrioxamina (DFO), che viene coniugato casualmente ai residui di lisina dell'anticorpo 9,10. Se ci sono residui di lisina nella regione di legame con l'antigene, la coniugazione in questi siti potrebbe ostacolare stericamente il legame con l'antigene e quindi compromettere il legame anticorpo-antigene. Pertanto, i diversi metodi di radioconiugazione utilizzati per la radioetichettatura indiretta o diretta degli anticorpi possono potenzialmente influenzare l'immunoreattività, definita come la capacità del radioconiugato anticorpale di legarsi al suo antigene 7,11. I metodi di coniugazione sito-specifici possono aggirare questa limitazione, ma queste tecniche richiedono l'ingegneria anticorpale per incorporare ulteriori residui di cisteina o esperienza nelle reazioni enzimatiche sui residui di carboidrati 12,13,14,15,16. Una volta che un anticorpo è radiomarcato, è importante verificare se l'immunoreattività viene mantenuta come parte della caratterizzazione del rAb. Un modo per misurare l'immunoreattività è determinare l'affinità di legame del rAb.
Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere un processo per determinare l'affinità di legame per rAbs utilizzando un test di saturazione radioligante stabilito per quantificare il legame rAb-antigene. La tendenza vincolante è descritta nella Figura 1. La quantità di antigene legato aumenterà man mano che più rAb viene aggiunto a una quantità fissa di antigene immobilizzato. Una volta che tutti i siti di legame dell'antigene sono saturi, verrà raggiunto un plateau e l'aggiunta di più rAbs non avrà alcun effetto sulla quantità di antigene legato. In questo modello, la costante di dissociazione di equilibrio (KD) è la concentrazione di anticorpi che occupa la metà dei recettori dell'antigene17. Il KD rappresenta quanto bene un anticorpo si lega al suo bersaglio con un KD inferiore corrispondente a una maggiore affinità di legame. In precedenza è stato riportato che un rAb ideale dovrebbe avere un KD di 1 nanomolare o meno18. Tuttavia, rAbs più recenti sono stati sviluppati con KD nella gamma nanomolare bassa e sono considerati adatti per applicazioni di imaging non invasive 19,20,21,22. Un altro parametro che può essere determinato nel test di saturazione radioligidale di rAbs è Bmax, che corrisponde alla quantità massima di legame con l'antigene. Bmax può essere utilizzato per calcolare il numero di molecole di antigene, se necessario.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63927/63927fig01.jpg"> Figura 1: Curva di legame di saturazione rappresentativa. La percentuale di antigene legata è tracciata contro concentrazioni crescenti di anticorpi aggiunti a una quantità fissa di antigene. I pop-out dimostrano la rilegatura in vari punti. Vengono mostrate la concentrazione e il legame corrispondenti a KD e Bmax, rispettivamente. Questa figura è stata creata con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63927/63927fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Questo test è particolarmente importante per i costrutti anticorpali bispecifici radiomarcati per determinare il KD per ciascun braccio della regione legante l'antigene (Fab) del legame dell'anticorpo bispecifico radiomarcato con i rispettivi antigeni. Questo protocollo può essere utilizzato per determinare il KD di ciascun braccio Fab separatamente su antigeni immobilizzati per caratterizzare in modo indipendente se l'affinità di legame di ciascun braccio Fab per il rispettivo antigene è stata influenzata dopo la radioconiugazione. Questo protocollo è dimostrato dall'uso di amivantamab radiomarcato, un anticorpo bispecifico per il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e le proteine di transizione mesenchimale-epiteliale citoplasmatica (cMET)19. Gli anticorpi a braccio singolo radiomarcati, in cui un braccio Fab si lega a EGFR (α-EGFR) o a cMET (α-cMET) e l'altro braccio Fab è un controllo isotipico, sono stati utilizzati anche come esempi19. Questo protocollo è anche appropriato per qualsiasi anticorpo radiomarcato con un antigene noto che può essere immobilizzato. In questo protocollo, una serie di diluizione del rAb viene aggiunta a una quantità fissa di antigene immobilizzato in pozzetti designati specifici per ciascun braccio Fab del rAb. Il rAb viene anche aggiunto a pozzetti che sono stati bloccati solo con albumina sierica bovina (BSA), senza antigene, per determinare il legame non specifico. Per determinare il legame specifico, il legame non specifico all'antigene immobilizzato viene sottratto dal legame totale rAb. La curva di legame di saturazione risultante viene quindi utilizzata per determinare KD, come descritto sopra.
Un vantaggio di questo metodo è una maggiore riproducibilità quando si utilizzano antigeni purificati rispetto all'utilizzo di linee cellulari come fonte di antigeni, dato che i livelli di espressione dell'antigene potrebbero essere influenzati durante la coltura cellulare e che diverse linee cellulari hanno livelli variabili di espressione dell'antigene. Nel caso di anticorpi bispecifici radiomarcati, le linee cellulari che esprimono solo uno degli antigeni senza l'altro potrebbero non essere disponibili, il che renderebbe molto impegnativa la caratterizzazione dell'affinità di legame dei singoli bracci Fab. In particolare, il vantaggio principale del metodo di saggio di saturazione radioligida rispetto ai metodi non radiomarcati è la caratterizzazione specifica dell'affinità di legame del rAb senza il contributo della frazione non coniugata del rAb. Per quanto a conoscenza degli autori, attualmente non esistono tecniche di purificazione per separare il rAb dal suo anticorpo genitore non coniugato. Date le dimensioni relativamente piccole del chelante e del radionuclide, il loro contributo al peso molecolare complessivo del rAb è insignificante nella cromatografia di esclusione dimensionale. Pertanto, il prodotto generato da qualsiasi tecnica di radioetichettatura è quasi sempre una miscela del rAb e del suo anticorpo genitore non coniugato. La caratterizzazione dell'affinità di legame utilizzando il test di saturazione radiomarcato garantisce che il prodotto da testare sia esclusivamente il rAb.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Counter</td>
			<td>Hidex</td>
			<td>Hidex Automatic Gamma Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>version 9.2; used for statistical analyses in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno Breakable MaxiSorp 96-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>473768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Sealing Tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3506-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining binding affinity (kd) of radiolabeled antibodies to immobilized antigens

Determinare l'affinità di legame (KD) è un aspetto importante della caratterizzazione degli anticorpi radiomarcati (rAb). Tipicamente, l'affinità di legame è rappresentata dalla costante di dissociazione di equilibrio, KD, e può essere calcolata come la concentrazione di anticorpi alla quale metà dei siti di legame anticorpale sono occupati all'equilibrio. Questo metodo può essere generalizzato a qualsiasi anticorpo radiomarcato o ad altre scaffold proteiche e peptidiche. A differenza dei metodi basati sulle cellule, la scelta degli antigeni immobilizzati è particolarmente utile per convalidare le affinità di legame dopo la conservazione a lungo termine degli anticorpi, distinguere le affinità di legame dei bracci della regione legante l'antigene del frammento (Fab) nei costrutti anticorpali bispecifici e determinare se esiste variabilità nell'espressione dell'antigene tra diverse linee cellulari. Questo metodo prevede l'immobilizzazione di una quantità fissa di antigene in pozzetti specificati su una piastra frangibile a 96 pozzetti. Quindi, il legame non specifico è stato bloccato in tutti i pozzetti con albumina sierica bovina (BSA). Successivamente, il rAb è stato aggiunto in un gradiente di concentrazione a tutti i pozzi. È stato scelto un intervallo di concentrazioni per consentire al rAb di raggiungere la saturazione, cioè una concentrazione di anticorpi alla quale tutti gli antigeni sono continuamente legati dal rAb. Nei pozzetti designati senza antigene immobilizzato, è possibile determinare il legame non specifico del rAb. Sottraendo il legame non specifico dal legame totale nei pozzetti con antigene immobilizzato, è possibile determinare il legame specifico del rAb all'antigene. Il KD del rAb è stato calcolato dalla curva di legame di saturazione risultante. Ad esempio, l'affinità di legame è stata determinata utilizzando amivantamab radiomarcato, un anticorpo bispecifico per il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e le proteine di transizione mesenchimale-epiteliale citoplasmatica (cMET).

Questo metodo calcola l'affinità di legame (KD) per un rAb in base al saggio di legame di saturazione in cui diverse concentrazioni di rAb sono state aggiunte a una quantità fissa di antigene immobilizzato. La curva di legame dovrebbe seguire la crescita logaritmica dove è inizialmente ripida e poi si stabilizza quando l'antigene è saturo. Per garantire che il KD determinato sia accurato, le concentrazioni di rAb devono essere abbastanza alte da raggiungere la saturazione. Per questo test, gli a...

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Determining Binding Affinity KD of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

Qui, viene descritto un metodo per determinare l'affinità di legame (KD) degli anticorpi radiomarcati agli antigeni immobilizzati. KD è la costante di dissociazione di equilibrio che può essere determinata da un esperimento di legame di saturazione misurando il legame totale, specifico e non specifico di un anticorpo radiomarcato a varie concentrazioni al suo antigene.

Determinazione dell'affinità di legame (KD) degli anticorpi radiomarcati contro gli antigeni immobilizzati

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is ...

Questo metodo può determinare l'affinità di legame di un anticorpo radiomarcato per il suo antigene. Misurerà anche la specificità del binding. Il vantaggio principale di questo semplice metodo è la caratterizzazione specifica dell'affinità di legame del solo anticorpo radiomarcato senza interferenze da parte dell'anticorpo parentale non coniugato.Questa tecnica convalida quantitativamente la capacità di un anticorpo radiomarcato di legarsi al suo bersaglio. Questo è importante per le applicazioni nell'imaging nucleare e nella terapia nucleare in una varietà di malattie. A dimostrare la procedura sarà Erika Belitzky, una post-laurea associata del mio laboratorio.Per iniziare, preparare un tampone di immobilizzazione aggiungendo 191 milligrammi di bicarbonato di sodio e 23,9 milligrammi di carbonato di sodio a un tubo conico da 50 millilitri. Quindi, aggiungere 40 millilitri di acqua da 18 megaohm e sciogliere vorticosamente. Ora, regola il pH a 9,0 prima di portare il volume totale a 50 millilitri.Quindi, preparare 200 millilitri di tampone di lavaggio aggiungendo 200 millilitri di PBS e 100 microlitri di Tween 20 a una bottiglia da 250 millilitri. Preparare anche 50 millilitri di tampone legante aggiungendo 50 milligrammi di BSA e 25 microlitri di Tween da 20 a 50 millilitri di PBS e mescolare per vortice. Aggiungere 1,5 grammi di BSA a 50 millilitri di PBS per preparare il tampone di blocco e vortice delicatamente per mescolare.Diluire l'antigene nel tampone di immobilizzazione. Quindi, prendi una piastra a fondo piatto frangibile, a 96 pozzetti, e aggiungi 100 microlitri di antigene sul fondo di ogni pozzetto di 24 pozzetti in un array otto per tre. Coprire la piastra con nastro sigillante e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte.Il giorno dopo, lavare il piatto tre volte con tampone di lavaggio. Capovolgere rapidamente la piastra nel lavandino per smaltire il liquido e picchiettare la piastra su una pila di asciugamani di carta per rimuovere il liquido in eccesso. Quindi, ai pozzetti contenenti l'antigene, aggiungere 300 microlitri di tampone di lavaggio per pozzo utilizzando una pipetta multicanale.Aggiungere 300 microlitri di tampone bloccante per pozzetto sia a 24 pozzi rivestiti di antigene che a 24 pozzetti vuoti della piastra a 96 pozzetti. Quindi, incubare la piastra per un'ora a temperatura ambiente e lavare ogni pozzetto della piastra tre volte con 300 microlitri di tampone di lavaggio. Effettuare tre diluizioni seriali dell'anticorpo radiomarcato nel tampone di legame per otto righe designate come da A a H sulla piastra.In primo luogo, calcolare il volume di anticorpi radiomarcati di riserva necessari per produrre una soluzione da 1,2 millilitri della prima concentrazione. Quindi, aggiungere 800 microlitri di tampone legante ai tubi di microcentrifuga etichettati da B a H e aggiungere il volume richiesto di tampone di legame a un tubo di microcentrifuga etichettato A.Aggiungere delicatamente il volume calcolato di anticorpo radiomarcato di serie al tubo A e al vortice. Quindi, girare verso il basso usando un mini-microcentrifuga per raccogliere tutto il liquido sul fondo del tubo.Quindi, aggiungere 400 microlitri di liquido da due A al tubo B.Dopo il vortice, ruotarlo verso il basso usando un mini-microcentrifuga. Allo stesso modo, aggiungere la soluzione dal tubo B al tubo C, da C a D, fino al tubo H.Aggiungere 100 microlitri di ogni diluizione per pozzetto a tre pozzetti immobilizzati con antigene e tre pozzetti bloccati solo con BSA. Ora, aggiungi 100 microlitri di ogni diluizione ai tubi microcentrifuga etichettati come standard A allo standard H e salva questi tubi come standard di anticorpi radiomarcati da dosare nel contatore gamma.Incubare la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius con un leggero dondolio. Etichettare i tubi microcentrifuga per ciascun pozzetto come descritto nel manoscritto. Aspirare l'anticorpo radiomarcato dai pozzetti della piastra a 96 pozzetti usando un aspiratore a vuoto.Ora, utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 300 microlitri di tampone di lavaggio a ciascun pozzetto. Aspirare il tampone di lavaggio e ripetere il lavaggio altre quattro volte. Rompere i pozzetti negli appositi tubi microcentrifuga.Contare la radioattività nei tubi con l'antigene contrassegnato come H1, H2, H3, da H3 ad A1, A2, A3, e poi con BSA contrassegnato solo come H4, H5, H6, ad A4, A5, A6 usando un contatore gamma. Amivantamab radiomarcato ha mostrato un legame specifico per le proteine EGFR e cMET. Affinità di legame simili sono state mantenute anche da fabbriche radiomarcate a braccio singolo legate alle proteine EGFR e cMET.I grafici di legame della saturazione hanno mostrato che quando le concentrazioni di anticorpi radiomarcati erano troppo basse, la saturazione non era raggiunta, come indicato dalla curva lineare. Le concentrazioni di anticorpi radiomarcati troppo elevate hanno portato alla saturazione senza una crescita logaritmica distinta, come mostrato dal plateau orizzontale. Inoltre, è stato osservato un elevato legame non specifico a causa di alte concentrazioni di anticorpi radiomarcati.Questa procedura può richiedere più tentativi per ottimizzare l'intervallo di concentrazione per ogni specifico anticorpo radiomarcato. Utilizza i dati dei risultati negativi per progettare esperimenti futuri. Una volta che l'affinità di legame è nota, può essere utilizzata come punto di riferimento per altri saggi in vitro come parte della caratterizzazione di un anticorpo radiomarcato.

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