Name: determining binding affinity (kd) of radiolabeled antibodies to immobilized antigens
Uploaded: 2022-06-23T13:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Binding Affinity KD of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens at JoVE.com

Авторы благодарят 3D Imaging за производство [89Zr]Zr-оксалата и доктора Шери Мурс из Janssen Pharmaceuticals за предоставление антител.

ПРИМЕЧАНИЕ: Графическое представление протокола приведено на рисунке 2 .
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63927/63927fig02.jpg"> Рисунок 2: Схема протокола. Метки рядов и столбцов указаны в качестве руководства для у?...

<ol>
	<li>Krecisz, P., Czarnecka, K., Krolicki, L., Mikiciuk-Olasik, E., Szymanski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiolabeled+Peptides+and+Antibodies+in+Medicine.">Radiolabeled Peptides and Antibodies in Medicine.</a> Bioconjugate Chemistry. 32 (1), 25-42 (2021).</li><li>Dun, Y., Huang, G., Liu, J., Wei, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoPET+imaging+of+hematological+malignancies:+From+preclinical+promise+to+clinical+reality.">ImmunoPET imaging of hematological malignancies: From preclinical promise to clinical reality.</a> Drug Discovery Today. 27 (4), 1196-1203 (2022).</li><li>Lohrmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retooling+a+Blood-Based+Biomarker:+Phase+I+assessment+of+the+high-affinity+CA19-9+antibody+HuMab-5B1+for+immuno-pet+imaging+of+pancreatic+cancer.">Retooling a Blood-Based Biomarker: Phase I assessment of the high-affinity CA19-9 antibody HuMab-5B1 for immuno-pet imaging of pancreatic cancer.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7014-7023 (2019).</li><li>Pandit-Taskar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I/II+study+for+analytic+validation+of+89Zr-J591+immunoPET+as+a+molecular+imaging+agent+for+metastatic+prostate+cancer.">A phase I/II study for analytic validation of 89Zr-J591 immunoPET as a molecular imaging agent for metastatic prostate cancer.</a> Clinical Cancer Research. 21 (23), 5277-5285 (2015).</li><li>Rousseau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+clinical+results+of+a+novel+immuno-PET+theranostic+probe+in+human+epidermal+growth+factor+receptor+2-negative+breast+cancer.">Initial clinical results of a novel immuno-PET theranostic probe in human epidermal growth factor receptor 2-negative breast cancer.</a> Journal of Nuclear Medicine. 61 (8), 1205-1211 (2020).</li><li>Moek, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theranostics+using+antibodies+and+antibody-related+therapeutics.">Theranostics using antibodies and antibody-related therapeutics.</a> Journal of Nuclear Medicine. 58 (2), 83-90 (2017).</li><li>Chomet, M., van Dongen, G., Vugts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art+in+radiolabeling+of+antibodies+with+common+and+uncommon+radiometals+for+preclinical+and+clinical+immuno-PET.">State of the art in radiolabeling of antibodies with common and uncommon radiometals for preclinical and clinical immuno-PET.</a> Bioconjugate Chemistry. 32 (7), 1315-1330 (2021).</li><li>Kumar, K., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiochemistry,+production+processes,+labeling+methods,+and+immunoPET+imaging+pharmaceuticals+of+Iodine-124.">Radiochemistry, production processes, labeling methods, and immunoPET imaging pharmaceuticals of Iodine-124.</a> Molecules. 26 (2), 414 (2021).</li><li>Vosjan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+and+radiolabeling+of+monoclonal+antibodies+with+zirconium-89+for+PET+imaging+using+the+bifunctional+chelate+p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine.">Conjugation and radiolabeling of monoclonal antibodies with zirconium-89 for PET imaging using the bifunctional chelate p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine.</a> Nature Protocols. 5 (4), 739-743 (2010).</li><li>Zeglis, B. M., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bioconjugation+and+radiosynthesis+of+89Zr-DFO-labeled+antibodies.">The bioconjugation and radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled antibodies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52521 (2015).</li><li>Wei, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImmunoPET:+concept,+design,+and+applications.">ImmunoPET: concept, design, and applications.</a> Chemical Reviews. 120 (8), 3787-3851 (2020).</li><li>Tavar&#233;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+effective+immuno-PET+imaging+method+to+monitor+CD8-dependent+responses+to+immunotherapy.">An effective immuno-PET imaging method to monitor CD8-dependent responses to immunotherapy.</a> Cancer Research. 76 (1), 73-82 (2016).</li><li>Tavar&#233;, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+antibody+fragments+for+immuno-PET+imaging+of+endogenous+CD8++T+cells+in+vivo.">Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (3), 1108-1113 (2014).</li><li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoenzymatic+strategy+for+the+synthesis+of+site-specifically+labeled+immunoconjugates+for+multimodal+PET+and+optical+imaging.">Chemoenzymatic strategy for the synthesis of site-specifically labeled immunoconjugates for multimodal PET and optical imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (12), 2123-2128 (2014).</li><li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme-mediated+methodology+for+the+site-specific+radiolabeling+of+antibodies+based+on+catalyst-free+click+chemistry.">Enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).</li><li>Kristensen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specifically+labeled+89Zr-DFO-trastuzumab+improves+immuno-reactivity+and+tumor+uptake+for+immuno-PET+in+a+subcutaneous+HER2-positive+xenograft+mouse+model.">Site-specifically labeled 89Zr-DFO-trastuzumab improves immuno-reactivity and tumor uptake for immuno-PET in a subcutaneous HER2-positive xenograft mouse model.</a> Theranostics. 9 (15), 4409-4420 (2019).</li><li>Maguire, J. J., Kuc, R. E., Davenport, A. P., Davenport, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Radioligand binding assays and their analysis. in Receptor Binding Techniques. , 31-77 (2012).</li><li>Davenport, A. P., Russell, F. D., Mather, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radioligand+bindsing+assays:+theory+and+practice.">Radioligand bindsing assays: theory and practice.</a> Current Directions in Radiopharmaceutical Research and Development. , 169-179 (1996).</li><li>Cavaliere, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+[89Zr]ZrDFO-amivantamab+bispecific+to+EGFR+and+c-MET+for+PET+imaging+of+triple+negative+breast+cancer.">Development of [89Zr]ZrDFO-amivantamab bispecific to EGFR and c-MET for PET imaging of triple negative breast cancer.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 48 (2), 383-394 (2021).</li><li>Marquez, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+(89)Zr-pertuzumab+in+breast+cancer+xenografts.">Evaluation of (89)Zr-pertuzumab in breast cancer xenografts.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (11), 3988-3995 (2014).</li><li>Marquez-Nostra, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+PET+imaging+of+glycoprotein+non-metastatic+melanoma+B+in+triple+negative+breast+cancer:+feasibility+of+an+antibody-based+companion+diagnostic+agent.">Preclinical PET imaging of glycoprotein non-metastatic melanoma B in triple negative breast cancer: feasibility of an antibody-based companion diagnostic agent.</a> Oncotarget. 8 (61), 104303-104314 (2017).</li><li>Ghai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+[(89)Zr]DFO-elotuzumab+for+immunoPET+imaging+of+CS1+in+multiple+myeloma.">Development of [(89)Zr]DFO-elotuzumab for immunoPET imaging of CS1 in multiple myeloma.</a> European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 48 (5), 1302-1311 (2021).</li><li>McKnight, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+EGFR+and+HER3+through+(89)Zr-labeled+MEHD7945A+(Duligotuzumab).">Imaging EGFR and HER3 through (89)Zr-labeled MEHD7945A (Duligotuzumab).</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).</li></ol>

В рамках разработки rAbs важно обеспечить, чтобы rAb связывался конкретно со своей целью с высоким сродством связывания. Определение сродства связывания может информировать о том, влияет ли иммунореактивность rAb на радиоконъюгацию через анализ насыщения радиолигандами с использованием ?...

Радиомеченные антитела (rAb) имеют множество применений в медицине. В то время как большинство из них используются в онкологии в качестве визуальных и терапевтических агентов, существуют приложения визуализации для воспаления, связанного с ревматологией, кардиологии и неврологии1. Визуализация rAbs обладает высокой чувствительностью к обнаружению поражений и может помочь в выборе пациента для лечения 2,3,4,5. Они также используются для терапии из-за их специфичности для соответствующих антигенов. В стратегии, известной как тераностика, один и тот же rAb используется как для визуализации, так и для лечения6.
В идеале, антитело, выбранное для радиомаркировки, уже доказало высокое сродство связывания и специфичность с использованием методов без радиомеблирования. Радиомаркировка антител может быть достигнута путем прямой химической модификации антител радионуклидом, который образует стабильные ковалентные связи (например, радиойод), или косвенно путем конъюгации с хелаторами, которые впоследствии координируются с радиометаллами 7,8. Прямая радиомаркировка, такая как с радиоактивным йодом, специфически модифицирует остатки тирозина и гистидина на антителе. Если эти остатки важны для связывания антигенов, то эта радиоконъюгация изменит сродство связывания. И наоборот, существует несколько установленных протоколов для конъюгации и косвенной радиомаркировки антител. Например, общим хелатором, используемым для связывания циркония-89 (89Zr) для ПЭТ-визуализации антител, является p-изотиоцианатобензил-десферриоксамин (DFO), который случайным образом конъюгируется с остатками лизина антитела 9,10. Если в антигенсвязывающей области есть остатки лизина, конъюгация в этих местах может стерически препятствовать связыванию антигена и, следовательно, ставить под угрозу связывание антитело с антигеном. Таким образом, различные методы радиоконъюгации, используемые для косвенной или прямой радиомаркировки антител, могут потенциально влиять на иммунореактивность, определяемую как способность радиоконъюгата антитела связываться со своим антигеном 7,11. Методы конъюгации, специфичные для сайта, могут обойти это ограничение, но эти методы требуют разработки антител для включения дополнительных остатков цистеина или опыта в ферментативных реакциях на углеводных остатках 12,13,14,15,16. После того, как антитело помечено радиоактивным путем, важно проверить, сохраняется ли иммунореактивность как часть характеристики rAb. Одним из способов измерения иммунореактивности является определение сродства связывания rAb.
Целью данного протокола является описание процесса определения сродства связывания для rAbs с использованием установленного анализа насыщения радиолигандами для количественной оценки связывания rAb-антигена. Связующая тенденция показана на рисунке 1. Количество связанного антигена будет увеличиваться по мере добавления большего количества rAb к фиксированному количеству иммобилизованного антигена. Как только все антигенсвязывающие сайты будут насыщены, будет достигнуто плато, и добавление большего количества rAbs не повлияет на количество связанного антигена. В этой модели константа равновесной диссоциации (KD) представляет собой концентрацию антитела, занимающего половину рецепторов антигена17. KD представляет собой то, насколько хорошо антитело связывается со своей мишенью с более низким KD, соответствующим более высокому сродству связывания. Ранее сообщалось, что идеальный rAb должен иметь KD 1 наномоляр или менее18. Тем не менее, более поздние rAbs были разработаны с KD в низком наномолярном диапазоне и считаются подходящими для неинвазивных приложений визуализации 19,20,21,22. Другим параметром, который может быть определен в анализе насыщения радиолигандов rAbs, является Bmax, который соответствует максимальному количеству антигенсвязывающего. Bmax может быть использован для расчета количества молекул антигена, если это необходимо.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63927/63927fig01.jpg"> Рисунок 1: Репрезентативная кривая связывания насыщенности. Процент связывания антигена строится на фоне увеличения концентрации антител, добавленных к фиксированному количеству антигена. Всплывающие окна демонстрируют привязку в различных точках. Показаны концентрация и связывание, соответствующие KD и Bmax, соответственно. Эта фигура была создана с помощью BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63927/63927fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Этот анализ особенно важен для конструкций биспецифических антител с радиомаркированной маркировкой для определения KD для каждого фрагмента антигенсвязывающей области (Fab) меченого радиоактивными биспецифическими антителами, связывающимися с их соответствующими антигенами. Этот протокол может быть использован для определения KD каждого fab-плеча отдельно на иммобилизованных антигенах, чтобы независимо охарактеризовать, было ли затронуто сродство связывания каждой руки Fab для его соответствующего антигена после радиоконъюгации. Этот протокол демонстрируется использованием радиомаркированного амивантамаба, биспецифического антитела к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR) и белкам цитоплазматического мезенхимально-эпителиального перехода (cMET)19. В качестве примеров19 также использовались радиомаркированные однорукие антитела, где одно плечо Fab связывается с EGFR (α-EGFR) или с cMET (α-cMET), а другое плечо Fab является контролем изотипа. Этот протокол также подходит для любого радиомаркированного антитела с известным антигеном, которое может быть иммобилизовано. В этом протоколе серия разбавления rAb добавляется к фиксированному количеству иммобилизованного антигена в назначенных скважинах, специфичных для каждого Fab-плеча rAb. rAb также добавляют в лунки, которые были заблокированы только бычьим сывороточным альбумином (BSA), без антигена, для определения неспецифического связывания. Для определения специфического связывания из общего связывания rAb вычитают неспецифическое связывание с иммобилизованным антигеном. Полученная кривая связывания насыщения затем используется для определения KD, как описано выше.
Одним из преимуществ этого метода является более высокая воспроизводимость при использовании очищенных антигенов по сравнению с использованием клеточных линий в качестве источника антигенов, учитывая, что уровни экспрессии антигенов могут быть затронуты во время клеточной культуры и что различные клеточные линии имеют переменные уровни экспрессии антигенов. В случае радиомаркированных биспецифических антител клеточные линии, которые экспрессируют только один из антигенов без другого, могут быть недоступны, что делает характеристику сродства связывания отдельных рукавов Fab очень сложной. Примечательно, что ключевым преимуществом метода анализа насыщения радиолигандами перед методами без радиомечания является специфическая характеристика сродства связывания rAb без вклада несопряженной фракции rAb. Насколько известно авторам, в настоящее время не существует методов очистки, отделяющих rAb от его родительского неконъюгированного антитела. Учитывая относительно небольшие размеры хелатора и радионуклида, их вклад в общую молекулярную массу rAb незначителен по размерам исключающей хроматографии. Таким образом, продукт, полученный в результате любой техники радиомаркировки, почти всегда представляет собой смесь rAb и его родительского неконъюгированного антитела. Характеристика сродства связывания с использованием радиомаркированного анализа насыщения гарантирует, что тестируемый продукт является исключительно rAb.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma Counter</td>
			<td>Hidex</td>
			<td>Hidex Automatic Gamma Counter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>version 9.2; used for statistical analyses in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno Breakable MaxiSorp 96-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>473768</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Sealing Tape</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3506-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining binding affinity (kd) of radiolabeled antibodies to immobilized antigens

Определение сродства связывания (KD) является важным аспектом характеристики радиомеченных антител (rAb). Как правило, сродство связывания представлено константой диссоциации равновесия, KD, и может быть рассчитано как концентрация антитела, при которой половина сайтов связывания антител занята в равновесии. Этот метод может быть обобщен на любое радиомаркированное антитело или другие белковые и пептидные каркасы. В отличие от клеточных методов, выбор иммобилизованных антигенов особенно полезен для подтверждения сродства связывания после длительного хранения антител, различения связывающего сродства фрагмента антигенсвязывающей области (Fab) в биспецифических конструкциях антител и определения того, есть ли изменчивость экспрессии антигена между различными клеточными линиями. Этот метод включает иммобилизацию фиксированного количества антигена в определенные скважины на бьющейся 96-луночной пластине. Затем неспецифическое связывание было заблокировано во всех скважинах бычьим сывороточным альбумином (BSA). Впоследствии rAb добавляли в градиент концентрации ко всем скважинам. Был выбран диапазон концентраций, позволяющих rAb достичь насыщения, т.е. концентрации антитела, при которой все антигены непрерывно связаны rAb. В назначенных лунках без иммобилизованного антигена может быть определено неспецифическое связывание rAb. Путем вычитания неспецифического связывания из общего связывания в лунках с иммобилизованным антигеном можно определить специфическое связывание rAb с антигеном. KD rAb был рассчитан на основе полученной кривой связывания насыщения. В качестве примера, сродство связывания определяли с использованием радиомаркированного амивантамаба, биспецифического антитела к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR) и белкам цитоплазматического мезенхимально-эпителиального перехода (cMET).

Этот метод рассчитывает сродство связывания (KD) для rAb на основе анализа связывания насыщения, где различные концентрации rAb были добавлены к фиксированному количеству иммобилизованного антигена. Кривая связывания должна следовать за логарифмическим ростом, где он изначально кр...

Watch this Scientific Journal Video about Determining Binding Affinity KD of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens at JoVE.com

Determining Binding Affinity KD of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

Здесь описан способ определения сродства связывания (KD) радиомеченных антител к обездвиженным антигенам. KD - константа равновесной диссоциации, которая может быть определена из эксперимента по связыванию насыщения путем измерения общего, специфического и неспецифического связывания радиомеченого антитела в различных концентрациях с его антигеном.

Определение сродства связывания (KD) радиомеченных антител к обездвиженным антигенам

Determining binding affinity (KD) is an important aspect of the characterization of radiolabeled antibodies (rAb). Typically, binding affinity is ...

Этот метод может определить сродство связывания радиомаркированного антитела к его антигену. Он также будет измерять специфику связывания. Основным преимуществом этого простого метода является специфическая характеристика сродства связывания только радиомеченого антитела без помех от неконъюгированного родительского антитела.Этот метод количественно подтверждает способность радиомаркированного антитела связываться со своей мишенью. Это важно для применения в ядерной визуализации и в ядерной терапии при различных заболеваниях. Продемонстрировать процедуру будет Эрика Белицки, аспирант из моей лаборатории.Для начала подготовьте буфер иммобилизации, добавив 191 миллиграмм бикарбоната натрия и 23,9 миллиграмма карбоната натрия в 50-миллилитровую коническую трубку. Затем добавьте 40 миллилитров 18-мегаомной воды и растворите путем вихря. Теперь отрегулируйте pH до 9,0, прежде чем довести общий объем до 50 миллилитров.Затем подготовьте 200 миллилитров промывочного буфера, добавив 200 миллилитров PBS и 100 микролитров Tween 20 в бутылку с 250 миллилитрами. Также готовят 50 миллилитров связывающего буфера, добавляя 50 миллиграммов BSA и 25 микролитров Tween от 20 до 50 миллилитров PBS и смешивают путем вихря. Добавьте 1,5 грамма BSA к 50 миллилитрам PBS, чтобы подготовить блокирующий буфер и аккуратно перемешать.Разбавляют антиген в иммобилизационном буфере. Затем возьмите бьющуюся плиту с плоским дном на 96 лунок и добавьте 100 микролитров антигена на дно каждой скважины из 24 скважин в массиве восемь на три. Накройте пластину уплотнительной лентой и высиживайте при четырех градусах Цельсия в течение ночи.На следующий день трижды вымойте тарелку с помощью промывочного буфера. Быстро переверните пластину в раковине, чтобы избавиться от жидкости, и постучите пластиной по куче бумажных полотенец, чтобы удалить лишнюю жидкость. Затем к скважинам, содержащим антиген, добавляют 300 микролитров промывочного буфера на скважину с помощью многоканальной пипетки.Добавьте 300 микролитров блокирующего буфера на скважину как в скважины с 24 антигенным покрытием, так и в 24 пустые скважины из 96 скважин. Затем инкубируйте пластину в течение одного часа при температуре окружающей среды и трижды промывайте каждую лунку пластины 300 микролитрами промывочного буфера. Производят трехкратное последовательное разведение радиомеченого антитела в буфере связывания в течение восьми рядов, обозначенных на пластине как от А до Н.Во-первых, рассчитают объем запаса радиомеченного антитела, необходимого для получения 1,2-миллилитра раствора первой концентрации. Затем добавляют 800 микролитров связывающего буфера к микроцентрифужным трубкам с маркировкой от B до H и добавляют необходимый объем связывающего буфера к микроцентрифужной трубке с маркировкой A.Добавьте расчетный объем запаса радиомаркированного антитела к трубке A и осторожно вихрь. Затем раскрутите вниз, используя мини-микроцентрифугу, чтобы собрать всю жидкость на дне трубки.Затем добавьте 400 микролитров жидкости из двух А в трубку Б. После вихря раскрутите ее вниз с помощью мини-микроцентрифуги. Аналогично добавляют раствор из трубки B в трубку C, C в D, до трубки H.Добавьте 100 микролитров каждого разведения на лунку в три лунки, иммобилизованные антигеном, и три лунки, заблокированные только BSA. Теперь добавьте 100 микролитров каждого разведения к микроцентрифужным лампам, помеченным стандартом A до стандарта H, и сохраните эти трубки в качестве стандартов антител с радиомаркированной маркировкой для анализа в гамма-счетчике.Инкубируйте пластину в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия с нежным раскачиванием. Маркировка микроцентрифужных трубок для каждой скважины так, как описано в рукописи. Аспирировать радиомеченое антитело из скважин 96-луночной пластины с помощью вакуумного аспиратора.Теперь, используя многоканальную пипетку, добавьте в каждую скважину 300 микролитров промывочного буфера. Аспирируйте буфер для стирки и повторите стирку еще четыре раза. Разбейте колодцы на соответствующие микроцентрифужные трубы.Подсчитайте радиоактивность в лампах с антигеном, помеченным как H1, H2, H3, H3 до A1, A2, A3, а затем с BSA только с маркировкой H4, H5, H6, до A4, A5, A6 с помощью гамма-счетчика. Радиомаркированный амивантамаб показал специфическое связывание с белками EGFR и cMET. Аналогичное сродство связывания также сохранялось однорукими радиомеченными фабами, связанными с белками EGFR и cMET.Графики связывания насыщенности показали, что когда концентрации меченых радиоактивными антителами были слишком низкими, насыщение не достигалось, о чем свидетельствует линейная кривая. Концентрации радиомеченных антител, которые были слишком высокими, приводили к насыщению без отчетливого логарифмического роста, как показывает горизонтальное плато. Также наблюдалось высокое неспецифическое связывание из-за высоких концентраций радиомеченных антител.Эта процедура может потребовать нескольких попыток оптимизировать диапазон концентраций для каждого конкретного радиомаркированного антитела. Используйте данные из отрицательных результатов, чтобы помочь в разработке будущих экспериментов. Как только сродство связывания известно, его можно использовать в качестве ориентира для других анализов in vitro как часть характеристики радиомеченого антитела.

Research

JoVE Journal

Medicine

Determining Binding Affinity (KD) of Radiolabeled Antibodies to Immobilized Antigens

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Измерение и лечение в борьбе с амблиопией

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Determining The Electromyographic Fatigue Threshold Following a Single Visit Exercise Test

Определение электромиографического порог усталости после одного посещения Упражнение тест

Theoretically, the electromyographic (EMG) fatigue threshold is the exercise intensity an individual can maintain indefinitely without the need to recruit ...

Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT

Determining Glucose Metabolism Kinetics Using 18F-FDG Micro-PET/CT

Определение Метаболизм глюкозы Kinetics Использование<sup&gt; 18</sup&gt; F-ФДГ Micro-PET / CT

This paper describes the use of 18F-FDG and micro-PET/CT imaging to determine in vivo glucose metabolism kinetics in mice (and is transferable to rats). ...

A Clinical Trial Assessing the Safety, Efficacy, and Delivery of Olive-Oil-Based Three-Chamber Bags for Parenteral Nutrition

Клиническое испытание Оценка безопасности, эффективности и доставки оливкового масла основе трехкамерных мешков для парентерального питания

Limited evidence exists to precisely estimate efficacy and safety differences between parenteral nutrition (PN) prepared using olive-oil-based ...

Determining and Controlling External Power Output During Regular Handrim Wheelchair Propulsion

Определение и управление внешней мощностью во время регулярного движения инвалидных колясок Handrim

The use of a manual wheelchair is critical to 1% of the world&#39;s population. Human powered wheeled mobility research has considerably matured, which ...

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

Мониторинг PD-1-Блокирование антител, связанных с Т-клеток, полученных от капли периферической крови

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers

Биологический препарат и механическая методика определения вязкоупругих свойств зональных волокон

Elasticity is essential to the function of tissues such as blood vessels, muscles, and lungs. This property is derived mostly from the extracellular ...

Improved Renal Denervation Mitigated Hypertension Induced by Angiotensin II Infusion

Улучшенная почечная денервация Смягченная гипертония, вызванная инфузией ангиотензина II

The benefits of renal sympathetic denervation (RDN) on blood pressure have been proved in a large number of clinical trials in recent years. However, the ...

Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma

Network Pharmacology Prediction and Experimental Validation of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii Action Mechanism Against Lung Adenocarcinoma

Прогнозирование сетевой фармакологии и экспериментальная проверка механизма действия Trichosanthes-Fritillaria thunbergii против аденокарциномы легкого

We aimed to study the mechanism of Trichosanthes-Fritillaria thunbergii in treating lung adenocarcinoma (LUAD) based on network pharmacology and ...

Standardized Tuina Manipulation for Knee Osteoarthritis in Rats

Tuina Manipulation to Reduce Inflammation and Cartilage Loss in Knee Osteoarthritis Rats

Author Spotlight: Understanding the Mechanism of Tuina Manipulation in Rats 

Манипуляция Tuina для уменьшения воспаления и потери хряща у крыс с остеоартритом коленного сустава

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its ...