Name: sample preparation for rapid lipid analysis in drosophila brain using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging
Uploaded: 2022-07-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging at JoVE.com

Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy og Maya Hein støttes af Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP). Jun Yin understøttes af det intramurale forskningsprogram fra National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137. Støtte til dette projekt blev ydet af en PSC-CUNY Award til Ye He og Rinat Abzalimov, finansieret i fællesskab af The Professional Staff Congress og The City University of New York.

1. Indlejring af fluehoved
BEMÆRK: Hele proceduren tager ~ 45-60 min.
<ol><li>Forbered det optimale skæretemperaturforbindelsestrin (OCT-forbindelse) med en plan overflade.<ol><li>Oct tilsættes i en plastkryomold (15 mm x 15 mm x 5 mm) til halvdelen af kryompildybden, og undgå bobledannelse. Lad formen stå på en plan overflade i flere minutter, og overfør den derefter til tøris.</li>
		<li>Hold kryoflen flad på tørisen, og lad OCT danne en flad og jævn overflade. ...

<ol>
	<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+lipids+and+their+derivatives+in+biomedical+applications.">Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).</li><li>Augustin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+for+the+medium-chain+triglyceride+ketogenic+diet+in+neurological+and+metabolic+disorders.">Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders.</a> Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).</li><li>Baldwin, K. T., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+astrocyte-induced+synaptogenesis.">Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).</li><li>Mauch, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cns+synaptogenesis+promoted+by+glia-derived+cholesterol.">Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol.</a> Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+using+lipopolysaccharide-stimulated+bone+marrow-derived+dendritic+cells+to+treat+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).</li><li>Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+lipid+analysis+towards+lipidomics,+a+new+challenge+for+the+analytical+chemistry+of+the+21st+century.+Part+I:+Modern+lipid+analysis.">From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).</li><li>Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+lipids+analysis+towards+lipidomics,+a+new+challenge+for+the+analytical+chemistry+of+the+21st+century.+Part+II:+Analytical+lipidomics.">From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).</li><li>Yang, K., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+Techniques,+applications,+and+outcomes+related+to+biomedical+sciences.">Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).</li><li>Norris, J. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+tissue+specimens+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+imaging+mass+spectrometry+in+biological+and+clinical+research.">Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research.</a> Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).</li><li>Veerasammy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+for+metabolic+profiling+using+MALDI+mass+spectrometry+imaging.">Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).</li><li>Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+lipid+metabolism:+Multiple+pathways+driving+functional+outcomes+in+health+and+disease.">Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).</li><li>Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+their+trafficking:+An+integral+part+of+cellular+organization.">Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization.</a> Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).</li><li>Wang, H., Eckel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+lipoproteins+doing+in+the+brain.">What are lipoproteins doing in the brain.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).</li><li>Palm, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+in+Drosophila+melanogaster-Assembly,+function,+and+influence+on+tissue+lipid+composition.">Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition.</a> PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).</li><li>Parra-Peralbo, E., Culi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+lipophorin+receptors+mediate+the+uptake+of+neutral+lipids+in+oocytes+and+imaginal+disc+cells+by+an+endocytosis-independent+mechanism.">Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism.</a> PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-specific+lipoprotein+receptors+interact+with+astrocyte+derived+apolipoprotein+and+mediate+neuron-glia+lipid+shuttling.">Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).</li><li>Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+analysis+of+lipid+species+in+Drosophila+during+overnutrition+by+UHPLC-MS/MS+and+MALDI-MSI.">Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI.</a> Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).</li><li>Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+chemical+imaging+of+a+single+brain+tissue+section+using+ToF-SIMS,+MALDI-ToF+and+immuno/histochemical+staining.">Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining.</a> Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).</li><li>Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+structural+effects+of+oral+administration+of+methylphenidate+in+Drosophila+brain+by+secondary+ion+mass+spectrometry+imaging.">Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).</li><li>Dienel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+and+imaging+mass+spectrometric+assays+of+labile+brain+metabolites:+Critical+importance+of+brain+harvest+procedures.">Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures.</a> Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).</li><li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry:+Practical+aspects+of+sample+preparation.">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation.</a> Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).</li><li>Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+imaging+of+Drosophila+brain+using+matrix+sublimation+versus+modification+with+nanoparticles.">Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).</li><li>Niehoff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Drosophila+lipids+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometric+imaging.">Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).</li><li>Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+imaging+of+GABA+in+the+Drosophila+melanogaster+adult+head.">Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head.</a> Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).</li><li>Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+fly+malpighian+tubule+lipidome+by+imaging+mass+spectrometry.">Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).</li><li>Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+mass+spectrometry+for+lipidomics.">Advances in mass spectrometry for lipidomics.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+for+studying+metabolism.">Lipidomics for studying metabolism.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+internal+standards+for+accurate+quantification+of+complex+lipid+species+in+biological+extracts+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry-What,+how+and+why.">Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why.</a> Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).</li></ol>

Som demonstreret i undersøgelsen af variationerne i lipidsammensætning i mutante og vildtype Drosophila-hjerner kan MALDI MSI være en værdifuld etiketfri billeddannelsesteknik til in situ-analyse af molekylære distributionsmønstre i organer af små insekter. Faktisk, fordi lipider er fordelt i både hjernevæv og fedtlegemer af Drosophila-hoveder, kan konventionelle lipidomics-tilgange baseret på væskekromatografi og massespektrometri (LC-MS) kun detektere kombinerede signaler fra begge...

Lipider er involveret i en bred vifte af biologiske processer og kan bredt klassificeres i fem kategorier baseret på deres strukturelle mangfoldighed: fedtsyrer, triacylglyceroler (TAGs), fosfolipider, sterollipider og sphingolipider1. Lipidernes grundlæggende funktioner er at tilvejebringe energikilder til biologiske processer (dvs. TAGs) og danne cellulære membraner (dvs. fosfolipider og kolesterol). Imidlertid er yderligere roller af lipider blevet noteret i udvikling og sygdomme og er blevet grundigt undersøgt på det biomedicinske område. For eksempel har rapporter vist, at fedtsyrer af forskellig længde kan have unikke terapeutiske roller. Korte fedtsyrekæder kan være involveret i forsvarsmekanismer mod autoimmune sygdomme, mellemlange fedtsyrekæder producerer metabolitter, der kan afbøde anfald, og lange fedtsyrekæder genererer metabolitter, der kan bruges til behandling af metaboliske lidelser2. I nervesystemet har glia-afledt kolesterol og fosfolipider vist sig at være afgørende for synaptogenese 3,4. Andre typer af lipider har vist løfte i medicinske applikationer, herunder sphingolipider anvendes i lægemiddelafgivelsessystemer og saccharolipider, der anvendes til at understøtte immunsystemet 5,6. De mange roller og potentielle terapeutiske anvendelser af lipider på det biomedicinske område har gjort lipidomics - undersøgelsen af veje og interaktioner mellem cellulære lipider - et kritisk og stadig vigtigere felt.
Lipidomics gør brug af analytisk kemi til at studere lipidomet i stor skala. De vigtigste eksperimentelle metoder, der anvendes i lipidomics, er baseret på massespektrometri (MS) kombineret med forskellige kromatografi- og ionmobilitetsteknikker 7,8. Brugen af MS i området er fordelagtig på grund af dets høje specificitet og følsomhed, erhvervelseshastighed og unikke evner til (1) at detektere lipider og lipidmetabolitter, der forekommer selv ved lave og forbigående niveauer, (2) detektere hundredvis af forskellige lipidforbindelser i et enkelt eksperiment, (3) identificere tidligere ukendte lipider og (4) skelne mellem lipidisomerer. Blandt udviklingen inden for MS, herunder desorptionselektrosprayionisering (DESI), MALDI og sekundær ionmassespektrometri (SIMS), har MALDI MSI vist sig som en kraftfuld billeddannelsesteknik, der supplerer konventionelle MS-baserede tilgange ved at give unik information om den rumlige fordeling af lipider i vævsrum 9,10.
Den typiske arbejdsgang for lipidomics består af prøveforberedelse, dataindsamling ved hjælp af massespektrometriteknologi og dataanalyse11. Undersøgelsen af lipider og metabolitter i prøver har ført til fremkomsten af teknikker til at forstå de fysiologiske og patologiske tilstande af metaboliske processer i organismer. Mens forståelse af biologiske interaktioner er vigtig, gør følsomheden af lipider og metabolitter dem vanskelige at afbilde og identificere uden farvestoffer eller anden modifikation. Ændringer i metabolitniveauer eller fordeling kan føre til fænotypiske ændringer. Et værktøj, der bruges til metabolomisk profilering, er MALDI MSI, en etiketfri, in situ-billeddannelsesteknik , der er i stand til at detektere hundredvis af molekyler samtidigt. MALDI-billeddannelse giver mulighed for visualisering af metabolitter og lipider i prøver, samtidig med at deres integritet og rumlige fordeling bevares. Tidligere teknologi til lipidprofilering involverede brugen af radioaktive kemikalier til individuelt at kortlægge lipider, mens MALDI-billeddannelse giver afkald på dette og giver mulighed for påvisning af en række lipider samtidigt.
Lipidmetabolisme og homeostase spiller vigtige funktioner i cellefysiologi, såsom vedligeholdelse og udvikling af nervesystemet. Et væsentligt aspekt af nervesystemets lipidmetabolisme er lipidkredsløbet mellem neuroner og gliaceller, som medieres af molekylære bærerlipoproteiner, herunder lipoproteiner med meget lav densitet (VLDL), lipoproteiner med lav densitet (LDL) og lipoproteiner med høj densitet (HDL)12. Lipoproteiner indeholder apolipoproteiner (Apo), såsom ApoB og ApoD, der fungerer som strukturelle blokke af lipidlast og som ligander til lipoproteinreceptorer. Neuron-glia crosstalk af lipider involverer flere spillere såsom glia-afledt ApoD, ApoE og ApoJ og deres neuronale LDL-receptorer (LDLR'er)13,14. I Drosophila er apolipophorin, et medlem af ApoB-familien, en stor hæmolymph lipidbærer15. Apolipophorin har to nært beslægtede lipophorinreceptorer (LpR'er), LpR1 og LpR2, som er homologer af pattedyr LDLR 15,16. I tidligere undersøgelser blev den astrocytudskilte lipocalin Glial Lazarillo (GLaz), en Drosophila-homolog af human ApoD, og dens neuronale receptor LpR1 opdaget til kooperativt at formidle neuron-glia lipid shuttling og dermed regulere dendritmorfogenese17. Derfor blev det spekuleret i, at tabet af LpR1 ville medføre et fald i det samlede lipidindhold i Drosophila-hjernen. MALDI MSI ville være et passende værktøj til profilering af lipidindholdet i små væv af LpR1-/- mutante og vildtype Drosophila-hjerner, som demonstreret i denne undersøgelse.
På trods af MALDI MSI's voksende popularitet hæmmer instrumentets høje omkostninger og eksperimentelle kompleksitet ofte dets implementering i individuelle laboratorier. Således udføres de fleste MALDI MSI-undersøgelser ved hjælp af delte kernefaciliteter. Som med andre anvendelser af MALDI MSI er en omhyggelig prøveforberedelsesproces for lipidomics afgørende for at opnå pålidelige resultater. Men fordi prøvediasforberedelse typisk udføres i individuelle forskningslaboratorier, er der mulighed for variation i MALDI MSI-erhvervelse. For at bekæmpe dette har dette papir til formål at give en detaljeret protokol til prøveforberedelse af små biologiske prøver forud for MALDI MSI-måling ved hjælp af lipidanalyse af en stor gruppe voksne Drosophila-hjerner i positiv iontilstand som et eksempel11,17. Imidlertid påvises nogle fosfolipidklasser og størstedelen af små metabolitter positivt ved MALDI-billeddannelse i negativ iontilstand, som tidligere er beskrevet11. Derfor håber vi med disse to eksempelstudier at give detaljerede prøveforberedelsesprotokoller for forskellige kombinationer: fritstående stort væv versus indlejret lille væv, optøningsmontering versus varmglasmontering og positiv iontilstand versus negativ iontilstand.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)</td>
			<td>Millipore Sigma Aldrich</td>
			<td>85707-1G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;CRYOMOLD 15X15X5</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9464347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-111-2302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoflex speed MALDI-TOF MS system</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>MALDI-TOF MS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Syringe with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics&#160;GLASS SLIDES MALDI IMAGNG</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0380464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td>AC219095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Perfection V600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;5-Place Slide Mailer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Digital Auto-Range Multimeter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-241-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging v3.0</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Bruker MS imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTX M5 Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Automatic heated matrix sprayer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC&#160;Ziploc Freezer Bag</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-111-3769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab (2015b)</td>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td></td>
			<td>Advanced MALDI MSI data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;CryoStar NX50 Cryostat</td>
			<td>Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>95-713-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for rapid lipid analysis in drosophila brain using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging

Lipidprofilering eller lipidomics er en veletableret teknik, der bruges til at studere hele lipidindholdet i en celle eller et væv. Oplysninger erhvervet fra lipidomics er værdifulde i studiet af de veje, der er involveret i udvikling, sygdom og cellulær metabolisme. Mange værktøjer og instrumenter har hjulpet lipidomics projekter, især forskellige kombinationer af massespektrometri og væskekromatografi teknikker. Matrixassisteret laserdesorption / ioniseringsmassespektrometribilleddannelse (MALDI MSI) er for nylig opstået som en kraftfuld billeddannelsesteknik, der supplerer konventionelle tilgange. Denne nye teknik giver unik information om den rumlige fordeling af lipider i vævsrum, som tidligere var uopnåelig uden brug af overdrevne modifikationer. Prøveforberedelsen af MALDI MSI-tilgangen er kritisk og er derfor fokus for dette papir. Dette papir præsenterer en hurtig lipidanalyse af et stort antal Drosophila-hjerner indlejret i optimal skæretemperaturforbindelse (OCT) for at give en detaljeret protokol til fremstilling af små væv til lipidanalyse eller metabolit og analyse af små molekyler gennem MALDI MSI.

Tabet af den neuronale receptor LpR1 af den astrocyt-udskillede lipocalin Glial Lazarillo (GLaz), en Drosophila homolog af human ApoD, blev antaget at kunne forårsage et fald i det samlede lipidindhold i Drosophila hjernen. For at teste dette blev MALDI MSI brugt til at profilere lipiderne i LpR1-/- mutante og vildtype Drosophila-hjerner , som uddybes nedenfor.
Eksperimentet blev udført i henhold til arbejdsgangen vist i fig...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging at JoVE.com

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Formålet med denne protokol er at give detaljeret vejledning om korrekt prøveforberedelse til lipid- og metabolitanalyse i små væv, såsom Drosophila-hjernen , ved hjælp af matrixassisteret laserdesorption / ionisering (MALDI) massespektrometribilleddannelse.

Prøveforberedelse til hurtig lipidanalyse i Drosophila-hjernen ved hjælp af matrixassisteret laserdesorption / ioniseringsmassespektrometribilleddannelse

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired ...

Maldi MS spektrometri billeddannelse er et etableret og nyttigt værktøj til at identificere og visualisere lipid overflod og distribution uden overdreven prøveændring. Den største fordel ved Maldi-billeddannelse er dens evne til at detektere lipiderne in situ uden mærkning og analysere en stor population af prøver samtidigt. Øvelse gør mester.Sørg for at øve dig godt, før du behandler de rigtige eksperimentelle prøver. Minimer prøveforberedelsestiden og undgå forurening under hele proceduren. Til at begynde med tilsættes den optimale skæretemperatur eller OCT i en plastisk cryomold til halvdelen af dybden af kryoformen, mens du undgår bobledannelse.Lad formen stå på en plan overflade i flere minutter, og overfør den derefter til tøris. Hold cryomolden flad på tørisen, og lad OCT danne en flad og jævn overflade. Vent, indtil OCT er fuldt størknet i formen.Brug de frosne OCT-stadier med det samme, eller opbevar dem ved minus 80 grader Celsius. Efter bedøvelse af de voksne fluer Brug kuldioxid til at forberede en petriskål, der indeholder et stykke laboratorieserviet. Brug vand til at fugte en del af kluden for at reducere den statiske elektricitet.Hold aftørringen halvt våd og halvt tør. Efter at have skåret fluehovedet under et dissekeringsomfang et, skal du samle fire til fem hoveder og lægge dem på det tørre område af laboratorieaftørringen. Tag OCT-stadiet fra tøris til mikroskop to.Overfør straks hovederne til OCT-scenen og arranger dem hurtigt, hvilket tager omkring 30 til 60 sekunder for at undgå OCT-smeltning. Efterlad omkring en millimeter tom plads omkring hver fluehjerne for at sikre tilstrækkelig støtte fra OCT og fire til fem millimeter tom plads fra kanten af blokken for at give tilstrækkelig plads til at håndtere sektionen. Sæt OCT-scenen tilbage på tørisen, og lad den forblive i omkring tre minutter for at sikre, at OLT-scenen forbliver frossen og fast.Når alle fluehovederne er justeret, lad OCT-scenen sidde på tøris i yderligere fem til 10 minutter. Overfør OCT-trinnet fra tørisen til en flad overflade, og tilsæt derefter hurtigt en stor mængde OCT-forbindelse for at dække alle prøverne og fylde hele cryomold, hvilket tager omkring tre sekunder. Overfør straks cryomolden tilbage til tøris og frys hele OCT-blokken, der indeholder det indlejrede væv.Lad OCT-scenen sidde på tørisen i yderligere fem til 10 minutter. Mærk prøverne på kanten af kryomidlet, og opbevar de frosne prøver ved minus 80 grader Celsius, indtil de er klar til sektionering. Bekræft den ITO-kodede side ved at teste ledningsevnen af ITO-dias ved hjælp af en voltmåler, der er indstillet til modstand.Marker siden med en modstandsmåling som den side, der skal klæbes vævet til. Mærk det, og sæt altid en laboratorieserviet på bunden af diaset for at undgå diasforurening. Lad derefter vævene balancere i kryostatkammeret i 30 til 45 minutter.Rengør kryostaten, helst med 70% ethanol. Tør rullepladen af i etapen, og fjern de brugte knive. Brug ekstra rene klude for at sikre, at ethanolen er fordampet, og at alle overflader er tørre, før sektionering begynder.Juster derefter temperaturen på kryostatkammerets sandprøvehoved i henhold til vævets type. Monter vævet på prøveholderen ved hjælp af OCT. Vær forsigtig med at bruge nok OCT til at dække bunden af OCT-blokken og monter blokken så fladt som muligt.Placer et rent blad på scenen og lås det. Placer prøvens hoved mod scenen efter behov for at opnå den ønskede skærevinkel. Begynd derefter skæringen i tykke sektioner, indtil interesseområdet er fundet.Børst konstant de ekstra stykker af med en forkølet kunstnerbørste for at holde scenen ren. Juster kammertemperaturen lidt efter behov, og skift tykkelsen af sektionerne til 10 til 12 mikrometer, når det ønskede område er nået. Saml omhyggeligt det ønskede afsnit.Tag et ITO-dias ved stuetemperatur, og placer det over sektionen. Gå forsigtigt til sektionen, og fastgør den til diaset uden at efterlade spor på kryostatstadiet. Placer diaset til side i et stativ, eller aftørring uden for kryostaten mellem samlingerne af flere sektioner.Hvis der ønskes sammenligning på tværs af forskellige prøver af samme kohorte, skal sektionerne fra flere prøver placeres på et enkelt dias, så de kan analyseres samtidigt for at minimere variationen. Adskil om nødvendigt to dias, da Maldi-målholderen kan rumme to dias i en enkelt kørsel. Transporter diasene i en vakuumboks til en udtørring med udtørring som bundlag.Kør diasene under et vakuum i 30 til 60 minutter, og fortsæt derefter til matrixaflejringen. Brug to fem dihydroxybenzoesyre eller DHB i methanolvand som matrix. Placer diasene i en glidetransportør, og forsegl åbningen sikkert med voksfilmen.Forsegl med lynlåsposen. Læg den i en anden lynlåspose indeholdende tørremiddel. Mærk ydersiden og send prøven til Maldi-kernefaciliteter med tilstrækkelige tørre øjne.Til matrixaflejringen skal du bruge 40 milligram pr. milliliter DHB og methanolvand som matrix og sprøjte det ved hjælp af en automatisk HTX M5 matrixsprøjte. Brug nitrogengastryk på 10 PSI. Brug en Maldi-flyvetid, MS-instrument og positiv iontilstand til at erhverve et massespektrum.Kalibrer instrumentet ved at spotte 0,5 mikroliter rød fosforemulsion i aceto Nitro på ITO-diasene. Brug det spektre til at kalibrere instrumentet i masseområdet 100 til 1000 MZ ved at anvende en kvadratisk kalibreringskurve. Indstil laserpletdiametrene til medium, da det er den modulerede stråleprofil til 40 mikrometer rasterbredde, og indsaml billeddata ved at opsummere 500 skud med en lasergentagelseshastighed på 1000 hertz pr. Array-position.Optag derefter spektraldataene. Udfør billeddataanalysen ved hjælp af root mean square normalisering for at generere ionbilleder med en båndbredde på plus minus 0,10 Dalton. Juster spektrene for både OCT og hjernevæv fra det samme eksperiment ved hjælp af softwaren til at evaluere de overlappende toppe i OCT's ionundertrykkelsesinterferens.Endelig behandles MALDI-diasene, der indeholder vævsprøverne, ved hæmatoxylin og eosin eller H- og E-farvning. Billeder fra Maldi MS-analyse afslørede et generelt fald i lipidindholdet i LPR1 knockout-mutanthjernen. De repræsentative H- og E-farvede voksne fluehjerneafsnit er vist her.Lipidarterne, deres respektive MZ-værdier og skalaerne på varmekortet er også angivet på dette billede. Den gennemsnitlige reduktion i LPR1-knockoutmutanten sammenlignet med kontrollerne fra mindst fire biologiske replikater vises som tal ved siden af pilene. Massespektret af det valgte blanke OCT-område i hjernevævsområdet fra både kontrol- og mutantfluer er vist i området MZ1 til 1000 og MZ520 til 900.OCT's interferens er forbundet med både ionundertrykkelsesfænomener og overlappende signalproblemer. For at opretholde troskaben af lipidomics-data er passende prøveforberedelse, dissektion og cryo-sektionering afgørende. Efter udførelse af Maldi-eksperimentet kan lipidernes identitet verificeres gennem LCMS, også kendt som væskekromatografi, massespektrometribaseret lipodomics.Denne teknik får molekylær indsigt i hjernens lipidhomeostase ved at bruge det kraftfulde til bløde modelsystem, der baner vejen for at forstå menneskelige sygdomsrelaterede metaboliske ændringer i hjernen.

Research

JoVE Journal

Biology

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Profilering Thiol Redox Proteome Brug Isotope Tagging massespektrometri

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Dithranol som en matrix til Matrix Assisted Laser Desorption / Ionisering Imaging på en Fourier Transform-cyklotron resonans Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Hurtig analyse og udforskningen af ​​fluorescensmikroskopi Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplet Workflow for Analyse af Histon post-translationelle modifikationer Brug Bottom-up-massespektrometri: Fra Histon Extraction til dataanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Prøvefremstilling til Mass cytometrianalyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Forberedelse af prøver og billeddannelse af Exosomes af transmissions Elektron Mikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Miniaturiserede prøveforberedelse til transmissions Elektron Mikroskopi

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Måling af energimetabolisme i eksplanterede retinale væv ved hjælp af ekstracellulære Flux analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...