Name: sample preparation for rapid lipid analysis in drosophila brain using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging
Uploaded: 2022-07-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging at JoVE.com

Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy en Maya Hein worden ondersteund door de Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP). Jun Yin wordt ondersteund door het intramurale onderzoeksprogramma van het National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137. Ondersteuning voor dit project werd geleverd door een PSC-CUNY Award aan Ye He en Rinat Abzalimov, gezamenlijk gefinancierd door The Professional Staff Congress en The City University of New York.

1. Inbedding van de vliegkop
OPMERKING: De hele procedure duurt ~ 45-60 min.
<ol><li>Bereid de optimale fase van de snijtemperatuurverbinding (OCT-compound) voor met een vlak oppervlak.<ol><li>Voeg OCT toe aan een plastic cryomold (15 mm x 15 mm x 5 mm) tot de helft van de diepte van de cryomold en voorkom bubbelvorming. Laat de mal enkele minuten op een plat oppervlak liggen en breng deze vervolgens over op droogijs.</li>
		<li>Houd de cryomold plat op het droogijs en laat ...

<ol>
	<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+lipids+and+their+derivatives+in+biomedical+applications.">Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).</li><li>Augustin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+for+the+medium-chain+triglyceride+ketogenic+diet+in+neurological+and+metabolic+disorders.">Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders.</a> Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).</li><li>Baldwin, K. T., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+astrocyte-induced+synaptogenesis.">Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).</li><li>Mauch, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cns+synaptogenesis+promoted+by+glia-derived+cholesterol.">Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol.</a> Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+using+lipopolysaccharide-stimulated+bone+marrow-derived+dendritic+cells+to+treat+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).</li><li>Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+lipid+analysis+towards+lipidomics,+a+new+challenge+for+the+analytical+chemistry+of+the+21st+century.+Part+I:+Modern+lipid+analysis.">From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).</li><li>Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+lipids+analysis+towards+lipidomics,+a+new+challenge+for+the+analytical+chemistry+of+the+21st+century.+Part+II:+Analytical+lipidomics.">From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).</li><li>Yang, K., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+Techniques,+applications,+and+outcomes+related+to+biomedical+sciences.">Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).</li><li>Norris, J. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+tissue+specimens+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+imaging+mass+spectrometry+in+biological+and+clinical+research.">Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research.</a> Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).</li><li>Veerasammy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+for+metabolic+profiling+using+MALDI+mass+spectrometry+imaging.">Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).</li><li>Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+lipid+metabolism:+Multiple+pathways+driving+functional+outcomes+in+health+and+disease.">Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).</li><li>Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+their+trafficking:+An+integral+part+of+cellular+organization.">Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization.</a> Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).</li><li>Wang, H., Eckel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+lipoproteins+doing+in+the+brain.">What are lipoproteins doing in the brain.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).</li><li>Palm, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+in+Drosophila+melanogaster-Assembly,+function,+and+influence+on+tissue+lipid+composition.">Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition.</a> PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).</li><li>Parra-Peralbo, E., Culi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+lipophorin+receptors+mediate+the+uptake+of+neutral+lipids+in+oocytes+and+imaginal+disc+cells+by+an+endocytosis-independent+mechanism.">Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism.</a> PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-specific+lipoprotein+receptors+interact+with+astrocyte+derived+apolipoprotein+and+mediate+neuron-glia+lipid+shuttling.">Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).</li><li>Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+analysis+of+lipid+species+in+Drosophila+during+overnutrition+by+UHPLC-MS/MS+and+MALDI-MSI.">Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI.</a> Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).</li><li>Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+chemical+imaging+of+a+single+brain+tissue+section+using+ToF-SIMS,+MALDI-ToF+and+immuno/histochemical+staining.">Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining.</a> Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).</li><li>Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+structural+effects+of+oral+administration+of+methylphenidate+in+Drosophila+brain+by+secondary+ion+mass+spectrometry+imaging.">Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).</li><li>Dienel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+and+imaging+mass+spectrometric+assays+of+labile+brain+metabolites:+Critical+importance+of+brain+harvest+procedures.">Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures.</a> Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).</li><li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry:+Practical+aspects+of+sample+preparation.">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation.</a> Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).</li><li>Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+imaging+of+Drosophila+brain+using+matrix+sublimation+versus+modification+with+nanoparticles.">Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).</li><li>Niehoff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Drosophila+lipids+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometric+imaging.">Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).</li><li>Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+imaging+of+GABA+in+the+Drosophila+melanogaster+adult+head.">Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head.</a> Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).</li><li>Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+fly+malpighian+tubule+lipidome+by+imaging+mass+spectrometry.">Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).</li><li>Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+mass+spectrometry+for+lipidomics.">Advances in mass spectrometry for lipidomics.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+for+studying+metabolism.">Lipidomics for studying metabolism.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+internal+standards+for+accurate+quantification+of+complex+lipid+species+in+biological+extracts+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry-What,+how+and+why.">Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why.</a> Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).</li></ol>

Zoals aangetoond in de studie naar de variaties in lipidesamenstelling in mutante en wild-type Drosophila hersenen, kan MALDI MSI een waardevolle labelvrije beeldvormingstechniek zijn voor in situ analyse van moleculaire distributiepatronen in organen van kleine insecten. Inderdaad, omdat lipiden worden verdeeld in zowel het hersenweefsel als het vetlichaam van Drosophila-hoofden, kunnen conventionele lipidomics-benaderingen op basis van vloeistofchromatografie en massaspectrometrie (LC-MS) all...

Lipiden zijn betrokken bij een breed scala aan biologische processen en kunnen grofweg worden ingedeeld in vijf categorieën op basis van hun structurele diversiteit: vetzuren, triacylglycerolen (TAGs), fosfolipiden, sterollipiden en sfingolipiden1. De fundamentele functies van lipiden zijn het leveren van energiebronnen voor biologische processen (d.w.z. TAGs) en het vormen van cellulaire membranen (d.w.z. fosfolipiden en cholesterol). Er zijn echter aanvullende rollen van lipiden opgemerkt in ontwikkeling en ziekten en zijn uitgebreid bestudeerd op biomedisch gebied. Rapporten hebben bijvoorbeeld aangetoond dat vetzuren van verschillende lengtes unieke therapeutische rollen kunnen hebben. Korte vetzuurketens kunnen betrokken zijn bij verdedigingsmechanismen tegen auto-immuunziekten, middellange vetzuurketens produceren metabolieten die aanvallen kunnen verminderen en lange vetzuurketens genereren metabolieten die kunnen worden gebruikt om metabole stoornissen te behandelen2. In het zenuwstelsel is aangetoond dat van glia afgeleide cholesterol en fosfolipiden van vitaal belang zijn voor synaptogenese 3,4. Andere soorten lipiden zijn veelbelovend gebleken in medische toepassingen, waaronder sfingolipiden die worden gebruikt in medicijnafgiftesystemen en sacharines die worden gebruikt om het immuunsysteem te ondersteunen 5,6. De talrijke rollen en potentiële therapeutische toepassingen van lipiden op biomedisch gebied hebben lipidomics - de studie van de routes en interacties van cellulaire lipiden - tot een kritisch en steeds belangrijker veld gemaakt.
Lipidomics maakt gebruik van analytische chemie om het lipidoom op grote schaal te bestuderen. De belangrijkste experimentele methoden die in lipidomics worden gebruikt, zijn gebaseerd op massaspectrometrie (MS) in combinatie met verschillende chromatografie- en ionenmobiliteitstechnieken 7,8. Het gebruik van MS in het gebied is voordelig vanwege de hoge specificiteit en gevoeligheid, de snelheid van verwerving en de unieke mogelijkheden om (1) lipiden en lipidemetabolieten te detecteren die zelfs op lage en voorbijgaande niveaus voorkomen, (2) honderden verschillende lipideverbindingen in een enkel experiment te detecteren, (3) voorheen onbekende lipiden te identificeren en (4) onderscheid te maken tussen lipide-isomeren. Onder de ontwikkelingen in MS, waaronder desorptie-elektrospray-ionisatie (DESI), MALDI en secundaire ionenmassaspectrometrie (SIMS), is MALDI MSI naar voren gekomen als een krachtige beeldvormingstechniek die conventionele MS-gebaseerde benaderingen aanvult door unieke informatie te verstrekken over de ruimtelijke verdeling van lipiden binnen weefselcompartimenten 9,10.
De typische workflow van lipidomics bestaat uit monstervoorbereiding, data-acquisitie met behulp van massaspectrometrietechnologie en data-analyse11. De studie van lipiden en metabolieten in monsters heeft geleid tot de opkomst van technieken om de fysiologische en pathologische omstandigheden van metabole processen in organismen te begrijpen. Hoewel het begrijpen van biologische interacties belangrijk is, maakt de gevoeligheid van lipiden en metabolieten ze moeilijk in beeld te brengen en te identificeren zonder kleurstoffen of andere modificaties. Veranderingen in metabolietniveaus of distributie kunnen leiden tot fenotypische veranderingen. Een hulpmiddel dat wordt gebruikt voor metabolomische profilering is MALDI MSI, een labelvrije, in situ beeldvormingstechniek die in staat is om honderden moleculen tegelijkertijd te detecteren. MALDI-beeldvorming maakt de visualisatie van metabolieten en lipiden in monsters mogelijk met behoud van hun integriteit en ruimtelijke verdeling. Eerdere technologie voor lipidenprofilering omvatte het gebruik van radioactieve chemicaliën om lipiden individueel in kaart te brengen, terwijl MALDI-beeldvorming hiervan afziet en tegelijkertijd een reeks lipiden kan detecteren.
Lipidenmetabolisme en homeostase spelen belangrijke functies in de celfysiologie, zoals het onderhoud en de ontwikkeling van het zenuwstelsel. Een essentieel aspect van het lipidenmetabolisme van het zenuwstelsel is de lipide-shuttling tussen neuronen en gliacellen, die wordt gemedieerd door moleculaire dragerlipoproteïnen, waaronder lipoproteïne met zeer lage dichtheid (VLDL), lipoproteïnen met lage dichtheid (LDL) en lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL)12. Lipoproteïnen bevatten apolipoproteïnen (Apo), zoals ApoB en ApoD, die functioneren als structurele blokken lipidelading en als liganden voor lipoproteïnereceptoren. De neuron-glia kruisverwijzing van lipiden omvat meerdere spelers zoals glia-afgeleide ApoD, ApoE en ApoJ, en hun neuronale LDL-receptoren (LDLRs)13,14. In Drosophila is apolipophorine, een lid van de ApoB-familie, een belangrijke hemolymfe-lipidedrager15. Apolipophorine heeft twee nauw verwante lipoforinereceptoren (LpR's), LpR1 en LpR2, die homologen zijn van zoogdier LDLR15,16. In eerdere studies werden de astrocyten-uitgescheiden lipocaline Glial Lazarillo (GLaz), een Drosophila homoloog van menselijk ApoD, en zijn neuronale receptor LpR1 ontdekt om coöperatief neuron-glia lipide shuttling te bemiddelen, waardoor de dendrietmorfogenese wordt gereguleerd17. Daarom werd gespeculeerd dat het verlies van LpR1 een afname van het totale lipidengehalte in de Drosophila-hersenen zou veroorzaken. MALDI MSI zou een geschikt hulpmiddel zijn voor het profileren van de lipide-inhoud in kleine weefsels van LpR1−/− mutante en wild-type Drosophila-hersenen, zoals aangetoond in deze studie.
Ondanks de groeiende populariteit van MALDI MSI, belemmeren de hoge kosten en experimentele complexiteit van het instrument vaak de implementatie ervan in individuele laboratoria. De meeste MSI-onderzoeken van MALDI worden dus uitgevoerd met behulp van gedeelde kernfaciliteiten. Net als bij andere toepassingen van MALDI MSI is een zorgvuldig monstervoorbereidingsproces voor lipidomics van cruciaal belang om betrouwbare resultaten te bereiken. Omdat monsterdiapreparatie echter meestal wordt uitgevoerd in individuele onderzoekslaboratoria, is er een mogelijkheid van variatie in MALDI MSI-acquisitie. Om dit te bestrijden, beoogt dit artikel een gedetailleerd protocol te bieden voor de monstervoorbereiding van kleine biologische monsters voorafgaand aan MALDI MSI-meting met behulp van lipidenanalyse van een grote groep volwassen Drosophila-hersenen in positieve ionenmodus als voorbeeld11,17. Sommige fosfolipideklassen en de meerderheid van de kleine metabolieten worden echter gunstig gedetecteerd door MALDI-beeldvorming in negatieve ionenmodus, die eerder werd beschreven11. Daarom hopen we met deze twee voorbeeldstudies gedetailleerde monstervoorbereidingsprotocollen van verschillende combinaties te bieden: vrijstaand groot weefsel versus ingebed klein weefsel, dooimontage versus warmschuifmontage en positieve ionmodus versus negatieve ionmodus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)</td>
			<td>Millipore Sigma Aldrich</td>
			<td>85707-1G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;CRYOMOLD 15X15X5</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9464347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-111-2302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoflex speed MALDI-TOF MS system</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>MALDI-TOF MS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Syringe with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics&#160;GLASS SLIDES MALDI IMAGNG</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0380464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td>AC219095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Perfection V600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;5-Place Slide Mailer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Digital Auto-Range Multimeter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-241-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging v3.0</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Bruker MS imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTX M5 Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Automatic heated matrix sprayer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC&#160;Ziploc Freezer Bag</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-111-3769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab (2015b)</td>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td></td>
			<td>Advanced MALDI MSI data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;CryoStar NX50 Cryostat</td>
			<td>Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>95-713-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for rapid lipid analysis in drosophila brain using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging

Lipid profiling, of lipidomics, is een gevestigde techniek die wordt gebruikt om het volledige lipidegehalte van een cel of weefsel te bestuderen. Informatie verkregen uit lipidomics is waardevol bij het bestuderen van de paden die betrokken zijn bij ontwikkeling, ziekte en cellulair metabolisme. Veel gereedschappen en instrumentaties hebben lipidomics-projecten ondersteund, met name verschillende combinaties van massaspectrometrie en vloeistofchromatografietechnieken. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI) is onlangs naar voren gekomen als een krachtige beeldvormingstechniek die conventionele benaderingen aanvult. Deze nieuwe techniek biedt unieke informatie over de ruimtelijke verdeling van lipiden binnen weefselcompartimenten, die voorheen onbereikbaar was zonder het gebruik van overmatige modificaties. De voorbeeldvoorbereiding van de MSI-aanpak van MALDI is van cruciaal belang en is daarom de focus van dit artikel. Dit artikel presenteert een snelle lipidenanalyse van een groot aantal Drosophila-hersenen ingebed in optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) om een gedetailleerd protocol te bieden voor de voorbereiding van kleine weefsels voor lipidenanalyse of metaboliet- en kleine molecuulanalyse via MALDI MSI.

Het verlies van de neuronale receptor LpR1 van de astrocyten-uitgescheiden lipocaline Glial Lazarillo (GLaz), een Drosophila homoloog van menselijk ApoD, werd verondersteld een afname van het totale lipidegehalte in de Drosophila hersenen te kunnen veroorzaken. Om dit te testen, werd MALDI MSI gebruikt om de lipiden in LpR1−/− mutante en wild-type Drosophila hersenen te profileren, wat hieronder wordt uitgewerkt.
Het experiment werd uitgevoerd...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging at JoVE.com

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Het doel van dit protocol is om gedetailleerde richtlijnen te geven over de juiste monstervoorbereiding voor lipide- en metabolietanalyse in kleine weefsels, zoals de Drosophila-hersenen , met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) massaspectrometrie beeldvorming.

Monstervoorbereiding voor snelle lipidenanalyse in drosophila-hersenen met behulp van matrixondersteunde laserdesorptie / ionisatie massaspectrometrie beeldvorming

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired ...

Maldi MS-spectrometrie beeldvorming is een gevestigd en nuttig hulpmiddel om lipidenrijkdom en -distributie te identificeren en te visualiseren, zonder overmatige monstermodificatie. Het belangrijkste voordeel van Maldi-beeldvorming is het vermogen om de lipiden in situ te detecteren zonder etikettering en tegelijkertijd grote populatie monsters te analyseren. Oefening baart kunst.Zorg ervoor dat je goed oefent voordat je de echte experimentele monsters verwerkt. Minimaliseer de voorbereidingstijd van het monster en vermijd besmetting tijdens de hele procedure. Voeg om te beginnen de optimale snijtemperatuur of OCT toe aan een plastic cryomold tot de helft van de diepte van de cryovorm terwijl u bubbelvorming voorkomt.Laat de mal enkele minuten op een vlak oppervlak liggen en breng deze vervolgens over op droogijs. Houd de cryomold plat op het droogijs en laat de OCT een vlak en egaal oppervlak vormen. Wacht tot de OCT volledig is gestold in de mal.Gebruik de bevroren OCT-stadia onmiddellijk, of bewaar ze bij min 80 graden Celsius. Na het verdoven van de volwassen vliegen Met behulp van koolstofdioxide, bereid een petrischaal met een stuk laboratoriumdoekje. Gebruik water om een deel van het doekje te bevochtigen om de statische elektriciteit te verminderen.Houd het doekje half nat en half droog. Nadat u de vliegenkop onder een ontleedbare scope één hebt gesneden, verzamelt u vier tot vijf koppen en plaatst u ze op het droge gedeelte van het laboratoriumdoekje. Neem het OCT-podium van droogijs naar microscoop twee.Breng de koppen onmiddellijk over naar de OCT-fase en rangschik ze snel, wat ongeveer 30 tot 60 seconden duurt om oct-smelten te voorkomen. Laat ongeveer een millimeter lege ruimte rond elk vliegenbrein om voldoende ondersteuning van de OCT en vier tot vijf millimeter lege ruimte vanaf de rand van het blok te garanderen om voldoende ruimte te bieden om de sectie te verwerken. Leg het OCT-podium terug op het droogijs en laat het ongeveer drie minuten aanblijven om ervoor te zorgen dat het OCT-podium bevroren en stevig blijft.Nadat alle vliegenkoppen zijn uitgelijnd, laat je het OCT-podium nog vijf tot 10 minuten op droogijs zitten. Breng het OCT-stadium over van het droogijs naar een plat oppervlak en voeg vervolgens snel een grote hoeveelheid OCT-verbinding toe om alle monsters te bedekken en vul de hele cryomold, wat ongeveer drie seconden duurt. Breng de cryomold onmiddellijk terug naar droogijs en vries het hele OCT-blok met de ingebedde weefsels in.Laat het OCT-podium nog vijf tot 10 minuten op het droogijs zitten. Label de monsters op de rand van de cryomold en bewaar de bevroren monsters bij min 80 graden Celsius totdat ze klaar zijn voor sectie. Bevestig de ITO-gecodeerde zijde door de geleidbaarheid van de ITO-dia's te testen met behulp van een voltmeter die is ingesteld op weerstand.Markeer de zijkant met een weerstandsmeting als de kant om het weefsel aan te hechten. Label het en plaats altijd een laboratoriumdoekje op de bodem van de dia om diabesmetting te voorkomen. Laat de weefsels vervolgens gedurende 30 tot 45 minuten in evenwicht zijn in de cryostaatkamer.Reinig de cryostaat, bij voorkeur met 70% ethanol. Veeg de rolplaat in fase af en verwijder de gebruikte messen. Gebruik extra schone doekjes om ervoor te zorgen dat de ethanol is verdampt en dat alle oppervlakken droog zijn voordat het snijden begint.Pas vervolgens de temperatuur van de kop van het cryostatkamerzandmonster aan op basis van het type weefsel. Monteer het weefsel op de monsterhouder met OCT. Zorg ervoor dat u voldoende OCT gebruikt om de basis van het OCT-blok te bedekken en monteer het blok zo plat mogelijk.Plaats een schoon mes op het podium en vergrendel het. Plaats de kop van het monster naar behoefte in de richting van het podium om de gewenste snijhoek te bereiken. Begin vervolgens met het snijden in dikke delen totdat het interessante gebied is gevonden.Borstel de extra stukken voortdurend af met een voorgekoelde artiestenborstel om het podium schoon te houden. Pas de kamertemperatuur indien nodig enigszins aan en verander de dikte van de secties in 10 tot 12 micrometer zodra het gewenste gebied is bereikt. Verzamel zorgvuldig de gewenste sectie.Neem een ITO-dia op kamertemperatuur en plaats deze over het gedeelte. Benader het gedeelte voorzichtig en plak het op de dia zonder sporen achter te laten op het cryostaatstadium. Plaats de schuif opzij in een rek of laboratoriumdoekje buiten de cryostaat tussen de verzamelingen van meerdere secties.Als vergelijking tussen verschillende monsters van hetzelfde cohort gewenst is, plaatst u de secties van meerdere monsters op één dia, zodat ze tegelijkertijd kunnen worden geanalyseerd om variatie te minimaliseren. Indien nodig gescheiden van twee dia's, omdat de Maldi-doelhouder plaats biedt aan twee dia's in één keer. Transporteer de dia's in een vacuümbox naar een droogmiddel met uitdroging als onderste laag.Drijf de dia's gedurende 30 tot 60 minuten onder een vacuüm en ga dan verder met de matrixafzetting. Gebruik twee vijf dihydroxybenzoëzuur, of DHB, in methanolwater als matrix. Plaats de glijbanen in een schuiftransporter en sluit de opening goed af met de wasfolie.Verzegel met de ritszak. Doe het in een andere ritszak met droogmiddel. Label de buitenkant en verzend het monster met voldoende droge ogen naar de kernfaciliteiten van Maldi.Gebruik voor de matrixafzetting 40 milligram per milliliter DHB en methanolwater als matrix en spuit het met behulp van een automatische HTX M5 matrixspuit. Gebruik een stikstofgasdruk van 10 PSI. Gebruik een Maldi-vluchttijd, MS-instrument en positieve ionmodus om een massaspectrum te verkrijgen.Kalibreer het instrument door 0,5 microliter rode fosforemulsie in aceto Nitro op de ITO-dia's te plaatsen. Gebruik het spectra om het instrument te kalibreren in het massabereik van 100 tot 1000 MZ door een kwadratische kalibratiecurve toe te passen. Stel de laserspotdiameters in op medium, omdat dit het gemoduleerde straalprofiel is voor een rasterbreedte van 40 micrometer en verzamel beeldgegevens door 500 opnamen op te tellen met een laserherhalingssnelheid van 1000 hertz per arraypositie.Noteer vervolgens de spectrale gegevens. Voer de analyse van de beeldgegevens uit met behulp van root mean square normalisatie om ionenbeelden te genereren met een bandbreedte van plus minus 0,10 Dalton. Lijn de spectra van zowel het OCT als het hersenweefsel uit hetzelfde experiment uit met behulp van de software om de overlappende pieken in de ionpressie-interferentie van de OCT te evalueren.Verwerk ten slotte de MALDI-dia's met de weefselmonsters door hematoxyline en eosine, of H- en E-kleuring. Beelden van Maldi MS-analyse onthulden een algemene afname van het lipidegehalte in de LPR1 knock-out mutant hersenen. De representatieve H- en E-gekleurde volwassen vliegenhersenensecties worden hier weergegeven.De lipidensoorten, hun respectievelijke MZ-waarden en de schalen van de heatmap worden ook aangegeven in deze afbeelding. De gemiddelde reductieplooi van de LPR1 knock-out mutant in vergelijking met de controles van ten minste vier biologische replicaties, worden weergegeven als nummers naast de pijlen. Het massaspectrum van het geselecteerde blanco OCT-gebied in het hersenweefselgebied van zowel de controle- als de mutante vliegen wordt weergegeven in het bereik van MZ1 tot 1000 en MZ520 tot 900.De interferentie van OCT wordt geassocieerd met zowel ionenonderdrukkingsverschijnselen als overlappende signaalproblemen. Om de betrouwbaarheid van lipidomics-gegevens te behouden, zijn geschikte monstervoorbereiding, dissectie en cryo-sectie cruciaal. Na het uitvoeren van het Maldi-experiment kunnen de identiteiten van de lipiden worden geverifieerd via LCMS, ook bekend als vloeistofchromatografie, op massaspectrometrie gebaseerde lipodomica.Deze techniek krijgt moleculaire inzichten in de homeostase van hersenlipiden door gebruik te maken van het krachtige tot zachte modelsysteem dat de weg vrijmaakt om menselijke ziektegerelateerde metabole veranderingen in de hersenen te begrijpen.

Research

JoVE Journal

Biology

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

De voorbereiding van Drosophila Embryo&#39;s voor Live-Imaging Met behulp van de Opknoping Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Profilering Thiol Redox Proteome Met behulp van Isotope Tagging massaspectrometrie

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Dithranol als een matrix voor Matrix Assisted Laser desorptie / ionisatie Imaging op een Fourier transform ion cyclotron resonantie spectrometrie

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Compleet Workflow voor Analyse van histon post-translationele modificaties Met behulp van Bottom-up Massaspectrometrie: Van Histon Extraction om Data Analysis

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Monstervoorbereiding Mass Cytometry Analysis

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...