Name: sample preparation for rapid lipid analysis in drosophila brain using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging
Uploaded: 2022-07-14T14:00:00
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Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy 및 Mayan Hein은 Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP)의 지원을 받습니다. Jun Yin은 National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137의 교내 연구 프로그램에 의해 지원됩니다. 이 프로젝트에 대한 지원은 PSC-CUNY Award를 통해 Ye He와 Rinat Abzalimov에게 제공되었으며, The Professional Staff Congress와 The City University of New York이 공동으로 자금을 지원했습니다.

1. 비행 머리 임베딩
참고 : 전체 절차는 ~ 45-60 분이 걸립니다.
<ol><li>평평한 표면을 가진 최적의 절삭 온도 화합물 (OCT 화합물) 단계를 준비하십시오.<ol><li>플라스틱 cryomold (15mm x 15mm x 5mm)에 OCT를 cryomold 깊이의 절반에 추가하고 거품 형성을 피하십시오. 곰팡이를 평평한 표면에 몇 분 동안 방치 한 다음 드라이 아이스로 옮깁니다.</li>
		<li>드라이 아이스에 cryomold?...

<ol>
	<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+lipids+and+their+derivatives+in+biomedical+applications.">Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).</li><li>Augustin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+for+the+medium-chain+triglyceride+ketogenic+diet+in+neurological+and+metabolic+disorders.">Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders.</a> Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).</li><li>Baldwin, K. T., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+astrocyte-induced+synaptogenesis.">Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).</li><li>Mauch, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cns+synaptogenesis+promoted+by+glia-derived+cholesterol.">Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol.</a> Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+using+lipopolysaccharide-stimulated+bone+marrow-derived+dendritic+cells+to+treat+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).</li><li>Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+lipid+analysis+towards+lipidomics,+a+new+challenge+for+the+analytical+chemistry+of+the+21st+century.+Part+I:+Modern+lipid+analysis.">From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).</li><li>Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+lipids+analysis+towards+lipidomics,+a+new+challenge+for+the+analytical+chemistry+of+the+21st+century.+Part+II:+Analytical+lipidomics.">From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).</li><li>Yang, K., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+Techniques,+applications,+and+outcomes+related+to+biomedical+sciences.">Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).</li><li>Norris, J. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+tissue+specimens+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+imaging+mass+spectrometry+in+biological+and+clinical+research.">Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research.</a> Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).</li><li>Veerasammy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+for+metabolic+profiling+using+MALDI+mass+spectrometry+imaging.">Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).</li><li>Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+lipid+metabolism:+Multiple+pathways+driving+functional+outcomes+in+health+and+disease.">Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).</li><li>Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+their+trafficking:+An+integral+part+of+cellular+organization.">Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization.</a> Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).</li><li>Wang, H., Eckel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+lipoproteins+doing+in+the+brain.">What are lipoproteins doing in the brain.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).</li><li>Palm, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+in+Drosophila+melanogaster-Assembly,+function,+and+influence+on+tissue+lipid+composition.">Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition.</a> PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).</li><li>Parra-Peralbo, E., Culi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+lipophorin+receptors+mediate+the+uptake+of+neutral+lipids+in+oocytes+and+imaginal+disc+cells+by+an+endocytosis-independent+mechanism.">Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism.</a> PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-specific+lipoprotein+receptors+interact+with+astrocyte+derived+apolipoprotein+and+mediate+neuron-glia+lipid+shuttling.">Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).</li><li>Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+analysis+of+lipid+species+in+Drosophila+during+overnutrition+by+UHPLC-MS/MS+and+MALDI-MSI.">Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI.</a> Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).</li><li>Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+chemical+imaging+of+a+single+brain+tissue+section+using+ToF-SIMS,+MALDI-ToF+and+immuno/histochemical+staining.">Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining.</a> Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).</li><li>Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+structural+effects+of+oral+administration+of+methylphenidate+in+Drosophila+brain+by+secondary+ion+mass+spectrometry+imaging.">Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).</li><li>Dienel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+and+imaging+mass+spectrometric+assays+of+labile+brain+metabolites:+Critical+importance+of+brain+harvest+procedures.">Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures.</a> Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).</li><li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry:+Practical+aspects+of+sample+preparation.">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation.</a> Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).</li><li>Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+imaging+of+Drosophila+brain+using+matrix+sublimation+versus+modification+with+nanoparticles.">Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).</li><li>Niehoff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Drosophila+lipids+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometric+imaging.">Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).</li><li>Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+imaging+of+GABA+in+the+Drosophila+melanogaster+adult+head.">Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head.</a> Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).</li><li>Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+fly+malpighian+tubule+lipidome+by+imaging+mass+spectrometry.">Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).</li><li>Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+mass+spectrometry+for+lipidomics.">Advances in mass spectrometry for lipidomics.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+for+studying+metabolism.">Lipidomics for studying metabolism.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+internal+standards+for+accurate+quantification+of+complex+lipid+species+in+biological+extracts+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry-What,+how+and+why.">Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why.</a> Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).</li></ol>

돌연변이 및 야생형 초파리 뇌에서 지질 조성의 변화에 관한 연구에서 입증된 바와 같이, MALDI MSI는 작은 곤충의 기관 내의 분자 분포 패턴의 현장 분석을 위한 귀중한 라벨이 없는 이미징 기술이 될 수 있다. 실제로, 지질은 초파리 머리의 뇌 조직과 지방체 모두에 분포하기 때문에, 액체 크로마토그래피 및 질량 분광법 (LC-MS)에 기초한 기존의 지질학 접근법은 전체 머리 추출?...

지질은 광범위한 생물학적 과정에 관여하며 구조적 다양성에 따라 크게 다섯 가지 범주로 분류 될 수 있습니다 : 지방산, 트리아실 글리세롤 (TAG), 인지질, 스테롤 지질 및 스핑고지질1. 지질의 기본 기능은 생물학적 과정 (즉, TAG)을위한 에너지 원을 제공하고 세포막 (즉, 인지질과 콜레스테롤)을 형성하는 것입니다. 그러나 지질의 추가 역할은 발달 및 질병에서 주목 받아 왔으며 생물 의학 분야에서 광범위하게 연구되어 왔습니다. 예를 들어, 다른 길이의 지방산이 독특한 치료 역할을 할 수 있다는 보고서가 있습니다. 짧은 지방산 사슬은 자가면역 질환에 대한 방어 기작에 관여할 수 있고, 중간 길이의 지방산 사슬은 발작을 완화시킬 수 있는 대사산물을 생성하며, 긴 지방산 사슬은 대사 장애를 치료하는데 사용될 수 있는 대사산물을 생성한다2. 신경계에서 글리아 유래 콜레스테롤과 인지질은 시냅토제네시스 생성에 필수적인 것으로 나타났습니다 3,4. 다른 유형의 지질은 약물 전달 시스템에 사용되는 스핑고지질과 면역계5,6을 지원하는 데 사용되는 사카롤리피드를 포함하여 의료 응용에서 약속을 나타냈다. 생물 의학 분야에서 지질의 수많은 역할과 잠재적 인 치료 응용 프로그램은 지질학 - 세포 지질의 경로와 상호 작용에 대한 연구 -를 중요하고 점점 더 중요한 분야로 만들었습니다.
지질학은 분석 화학을 사용하여 지질을 대규모로 연구합니다. 지질학에서 활용되는 주요 실험 방법은 다양한 크로마토그래피 및 이온 이동성 기술 7,8과 결합 된 질량 분광법 (MS)을 기반으로합니다. 이 영역에서 MS의 사용은 (1) 낮고 일시적인 수준에서도 발생하는 지질 및 지질 대사 산물을 검출하고, (2) 단일 실험에서 수백 개의 상이한 지질 화합물을 검출하고, (3) 이전에 알려지지 않은 지질을 확인하고, (4) 지질 이성질체를 구별하는 높은 특이성 및 민감도, 획득 속도 및 독특한 능력으로 인해 유리하다. 탈착 전기 분무 이온화 (DESI), MALDI 및 이차 이온 질량 분광법 (SIMS)을 포함한 MS의 개발 중 MALDI MSI는 조직 구획 내 지질의 공간 분포에 대한 고유 한 정보를 제공함으로써 기존의 MS 기반 접근법을 보완하는 강력한 이미징 기술로 부상했습니다 9,10.
지질학의 전형적인 워크플로우는 샘플 준비, 질량 분광법 기술을 이용한 데이터 수집, 및 데이터 분석(11)으로 구성된다. 샘플에서 지질 및 대사 산물에 대한 연구는 유기체의 대사 과정의 생리 학적 및 병리학 적 조건을 이해하는 기술의 출현으로 이어졌습니다. 생물학적 상호 작용을 이해하는 것이 중요하지만, 지질과 대사 산물의 민감성은 염료 나 다른 변형없이 이미지화하고 식별하기가 어렵습니다. 대사 산물 수준 또는 분포의 변화는 표현형 변화로 이어질 수 있습니다. 대사체 프로파일링에 사용되는 도구 중 하나는 수백 개의 분자를 동시에 검출할 수 있는 라벨이 없는 현장 이미징 기술인 MALDI MSI입니다. MALDI 이미징은 샘플에서 대사 산물과 지질을 시각화하는 동시에 무결성과 공간 분포를 보존합니다. 지질 프로파일 링을위한 이전 기술은 지질을 개별적으로 매핑하기 위해 방사성 화학 물질을 사용하는 것을 포함했지만 MALDI 이미징은이를 무시하고 다양한 지질을 동시에 탐지 할 수 있습니다.
지질 대사 및 항상성은 신경계의 유지 및 발달과 같은 세포 생리학에서 중요한 기능을 수행합니다. 신경계 지질 대사의 한 가지 필수적인 측면은 뉴런과 신경교 세포 사이의 지질 떨림이며, 이는 초저밀도 지단백질 (VLDL), 저밀도 지단백질 (LDL) 및 고밀도 지단백질 (HDL)12을 포함한 분자 운반체 지단백질에 의해 매개됩니다. 지단백질은 ApoB 및 ApoD와 같은 아포리포단백질(Apo)을 함유하고 있으며, 이는 지질화물의 구조적 블록과 지단백질 수용체의 리간드로 기능한다. 지질의 뉴런-글리아 크로스토크는 글리아-유래 ApoD, ApoE, 및 ApoJ, 및 그들의 뉴런 LDL 수용체(LDLRs)13,14와 같은 다수의 플레이어를 포함한다. 초파리에서, ApoB 패밀리의 구성원인 아포리포린은 주요 용혈림프 지질 담체(15)이다. 아포리포린은 포유동물 LDLR15,16의 상동체인 두 개의 밀접하게 관련된 리포포린 수용체(LpRs), LpR1 및 LpR2를 갖는다. 이전 연구에서, 성상세포 분비 리포칼린 글리알 라자릴로 (GLaz), 인간 ApoD의 초파리 상동체, 및 그의 뉴런 수용체 LpR1이 뉴런-글리아 지질 떨림을 협력적으로 매개하는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 수상 돌기 형태형성17을 조절한다. 따라서 LpR1의 손실은 초파리 뇌의 전반적인 지질 함량의 감소를 일으킬 것이라고 추측되었습니다. MALDI MSI는 본 연구에서 입증된 바와 같이 LpR1-/- 돌연변이체 및 야생형 초파리 뇌의 작은 조직에서 지질 내용물을 프로파일링하는 데 적합한 도구가 될 것이다.
MALDI MSI의 인기가 높아지고 있음에도 불구하고, 장비의 높은 비용과 실험적 복잡성은 종종 개별 실험실에서의 구현을 방해합니다. 따라서 대부분의 MALDI MSI 연구는 공유 핵심 시설을 사용하여 수행됩니다. MALDI MSI의 다른 적용과 마찬가지로, 지질학을 위한 신중한 샘플 준비 과정은 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 매우 중요합니다. 그러나, 샘플 슬라이드 준비는 일반적으로 개별 연구 실험실에서 수행되기 때문에, MALDI MSI 획득에 변동의 가능성이 있다. 이를 방지하기 위해, 본 논문은 실시예11,17로서 양성 이온 모드에서 성인 초파리 뇌의 큰 그룹의 지질 분석을 사용하여 MALDI MSI 측정 이전에 작은 생물학적 샘플의 샘플 제조를 위한 상세한 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 한다. 그러나, 일부 인지질 부류 및 대부분의 작은 대사산물은 이전에 기술된 음이온 모드에서 MALDI 영상화에 의해 유리하게 검출되고, 이는 앞서11에서 기술되었다. 따라서이 두 가지 예제 연구를 통해 우리는 독립형 대형 조직 대 임베디드 작은 조직, 해동 장착 대 웜 슬라이드 장착, 포지티브 이온 모드 대 음이온 모드 등 다양한 조합의 상세한 샘플 준비 프로토콜을 제공하기를 희망합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)</td>
			<td>Millipore Sigma Aldrich</td>
			<td>85707-1G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;CRYOMOLD 15X15X5</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9464347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-111-2302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoflex speed MALDI-TOF MS system</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>MALDI-TOF MS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Syringe with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics&#160;GLASS SLIDES MALDI IMAGNG</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0380464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td>AC219095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Perfection V600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;5-Place Slide Mailer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Digital Auto-Range Multimeter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-241-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging v3.0</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Bruker MS imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTX M5 Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Automatic heated matrix sprayer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC&#160;Ziploc Freezer Bag</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-111-3769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab (2015b)</td>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td></td>
			<td>Advanced MALDI MSI data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;CryoStar NX50 Cryostat</td>
			<td>Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>95-713-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for rapid lipid analysis in drosophila brain using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging

지질 프로파일 링 또는 지질학은 세포 또는 조직의 전체 지질 함량을 연구하는 데 사용되는 잘 정립 된 기술입니다. 지질학에서 얻은 정보는 발달, 질병 및 세포 대사와 관련된 경로를 연구하는 데 유용합니다. 많은 도구와 계측기가 지질학 프로젝트, 특히 질량 분광법과 액체 크로마토그래피 기술의 다양한 조합을 도왔습니다. 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광법 이미징(MALDI MSI)은 최근 기존의 접근 방식을 보완하는 강력한 이미징 기술로 부상했습니다. 이 새로운 기술은 조직 구획 내의 지질의 공간적 분포에 대한 독특한 정보를 제공하며, 이전에는 과도한 변형을 사용하지 않고는 달성 할 수 없었습니다. MALDI MSI 접근법의 샘플 준비는 매우 중요하며, 따라서 이 논문의 초점입니다. 이 논문은 MALDI MSI를 통한 지질 분석 또는 대사 산물 및 소분자 분석을위한 작은 조직의 제조를위한 상세한 프로토콜을 제공하기 위해 최적의 절단 온도 화합물 (OCT)에 내장 된 많은 수의 초파리 뇌의 신속한 지질 분석을 제시합니다.

인간 ApoD의 초파리 상동체인 성상세포 분비 리포칼린 글리알 라자릴로(GLaz)의 뉴런 수용체 LpR1의 손실은 초파리 뇌에서 전체 지질 함량의 감소를 야기할 수 있을 것으로 가정되었다. 이를 시험하기 위해, MALDI MSI는 LpR1-/- 돌연변이체 및 야생형 초파리 뇌에서 지질을 프로파일링하는데 사용되었으며, 이는 아래에 상세히 기술되어 있다.
실험은...

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Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

이 프로토콜의 목적은 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 (MALDI) 질량 분광법 이미징을 사용하여 초파리 뇌와 같은 작은 조직에서 지질 및 대사 산물 분석을위한 적절한 샘플 준비에 대한 자세한 지침을 제공하는 것입니다.

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광법 이미징 을 사용한 초파리 뇌의 신속한 지질 분석을 위한 샘플 준비

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired ...

Maldi MS 분광법 이미징은 과도한 샘플 수정 없이 지질 존재비와 분포를 식별하고 시각화하는 확립되고 유용한 도구입니다. Maldi 이미징의 주요 장점은 라벨링 없이 현장에서 지질을 검출하고 대량의 샘플을 동시에 분석할 수 있다는 것입니다. 연습이 완벽을 만든다.실제 실험 샘플을 처리하기 전에 잘 연습하십시오. 샘플 준비 시간을 최소화하고 절차 전반에 걸쳐 오염을 방지합니다. 시작하려면 기포 형성을 피하면서 최적의 절단 온도 또는 OCT를 극저온 금형 깊이의 절반까지 플라스틱 극저온에 추가합니다.금형을 평평한 표면에 몇 분 동안 그대로 둔 다음 드라이 아이스로 옮깁니다. 드라이 아이스에 저온을 평평하게 유지하고 OCT가 평평하고 균일 한 표면을 형성하도록합니다. OCT가 금형에서 완전히 응고 될 때까지 기다리십시오.냉동 OCT 스테이지를 즉시 사용하거나 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 성인 파리를 마취 한 후 이산화탄소를 사용하여 실험실 닦은 조각이 들어있는 페트리 접시를 준비하십시오. 정전기를 줄이기 위해 물티슈의 일부를 적시는 데 물을 사용하십시오.물티슈를 반은 젖고 반은 건조하게 유지하십시오. 해부 스코프 1에서 플라이 헤드를 절단 한 후 4-5 개의 헤드를 모아 실험실 와이프의 건조한 영역에 놓습니다. 드라이 아이스에서 현미경 2로 OCT 단계를 수행하십시오.즉시 헤드를 OCT 단계로 옮기고 OCT 용융을 피하기 위해 약 30-60초가 걸리는 빠르게 배열하십시오. OCT에서 적절한 지지를 확보하기 위해 각 플라이 브레인 주위에 약 1mm의 빈 공간을 남겨두고 섹션을 처리할 수 있는 적절한 공간을 제공하기 위해 블록 가장자리에서 4-5mm의 빈 공간을 남겨 둡니다. OCT 스테이지를 드라이 아이스에 다시 놓고 약 3분 동안 그대로 두어 OCT 스테이지가 얼고 단단한 상태로 유지되도록 합니다.모든 플라이 헤드가 정렬된 후 OCT 스테이지를 드라이아이스 위에 5분에서 10분 더 둡니다. OCT 스테이지를 드라이 아이스에서 평평한 표면으로 옮긴 다음 다량의 OCT 화합물을 빠르게 추가하여 모든 샘플을 덮고 전체 저온 몰드를 채우는 데 약 3 초가 걸립니다. 즉시 냉동 생물을 드라이 아이스로 다시 옮기고 내장 된 조직이 포함 된 전체 OCT 블록을 동결시킵니다.OCT 스테이지를 드라이 아이스에 5-10 분 더 두십시오. 저온의 가장자리에 샘플을 라벨링하고 절단 준비가 될 때까지 냉동 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 저항으로 설정된 전압계를 사용하여 ITO 슬라이드의 전도도를 테스트하여 ITO 코딩면을 확인합니다.저항 측정이 있는 면을 조직을 부착할 면으로 표시합니다. 라벨을 붙이고 슬라이드 오염을 방지하기 위해 항상 슬라이드 바닥에 실험실 물티슈를 설정하십시오. 그런 다음 조직이 저온 유지 챔버에서 30-45분 동안 평형을 이루도록 합니다.저온 유지 장치를 가급적이면 70 % 에탄올로 청소하십시오. 스테이지에서 롤 플레이트를 닦고 사용한 블레이드를 제거합니다. 추가 깨끗한 물티슈를 사용하여 에탄올이 증발하고 절단이 시작되기 전에 모든 표면이 건조한지 확인하십시오.다음으로, 조직의 유형에 따라 저온 유지 챔버 모래 표본 헤드의 온도를 조정합니다. OCT를 사용하여 표본 홀더에 조직을 장착합니다. OCT 블록의 바닥을 덮을 만큼 충분한 OCT를 사용하고 블록을 가능한 한 평평하게 장착하도록 주의하십시오.무대에 깨끗한 칼날을 놓고 잠급니다. 원하는 절단 각도를 얻기 위해 필요에 따라 시편의 헤드를 스테이지 쪽으로 배치합니다. 그런 다음 관심 영역을 찾을 때까지 두꺼운 부분에서 절단을 시작하십시오.무대를 깨끗하게 유지하기 위해 미리 냉각된 아티스트 브러시로 여분의 조각을 지속적으로 털어냅니다. 필요에 따라 챔버 온도를 약간 조정하고 원하는 영역에 도달하면 단면의 두께를 10-12 마이크로 미터로 변경하십시오. 조심스럽게 원하는 섹션을 수집하십시오.실온 ITO 슬라이드를 가져와 섹션 위에 놓습니다. 섹션에 부드럽게 접근하고 저온 유지 장치 단계에 흔적을 남기지 않고 슬라이드에 부착하십시오. 슬라이드를 랙에 따로 놓거나 여러 섹션의 모음 사이에 있는 저온 유지 장치 외부의 실험실 닦으십시오.동일한 코호트의 서로 다른 샘플 간의 비교를 원하는 경우 여러 샘플의 섹션을 단일 슬라이드에 배치하여 동시에 분석하여 변동을 최소화할 수 있습니다. Maldi 대상 홀더는 한 번에 두 개의 슬라이드를 수용할 수 있으므로 필요한 경우 두 개의 슬라이드로 분리합니다. 진공 상자의 슬라이드를 건조제를 바닥 층으로 사용하여 건조제로 운반합니다.슬라이드를 진공 상태에서 30-60 분 동안 구동 한 다음 매트릭스 증착을 진행합니다. 메탄올 물에 2 개의 5 개의 디 하이드 록시 벤조산 또는 DHB를 매트릭스로 사용하십시오. 슬라이드를 슬라이드 트랜스 포터에 넣고 왁스 필름으로 개구부를 단단히 밀봉하십시오.지퍼백으로 밀봉합니다. 건조제가 들어있는 다른 지퍼 백에 넣으십시오. 외부에 라벨을 붙이고 적절한 안구 건조증을 가진 Maldi 핵심 시설로 샘플을 배송하십시오.매트릭스 증착의 경우 DHB 밀리리터당 40밀리그램과 메탄올 물을 매트릭스로 사용하고 자동 HTX M5 매트릭스 분무기를 사용하여 스프레이합니다. 10PSI의 질소 가스 압력을 사용하십시오. Maldi 비행 시간, MS 기기 및 양이온 모드를 사용하여 질량 스펙트럼을 획득하십시오.아세토 니트로에서 0.5마이크로리터의 적린 에멀젼을 ITO 슬라이드에 발견하여 기기를 보정합니다. 이 스펙트럼을 사용하여 2차 교정 곡선을 적용하여 100 - 1000 MZ 질량 범위에서 기기를 교정하십시오. 레이저 스폿 직경을 40마이크로미터 래스터 너비에 대한 변조된 빔 프로파일이므로 중간으로 설정하고 어레이 위치당 1000헤르츠의 레이저 반복률로 500샷을 합산하여 이미징 데이터를 수집합니다.그런 다음 스펙트럼 데이터를 기록합니다. 제곱 평균 정규화를 사용하여 이미징 데이터 분석을 수행하여 플러스 마이너스 0.10 달톤의 대역폭에서 이온 이미지를 생성합니다. 소프트웨어를 사용하여 동일한 실험에서 OCT와 뇌 조직 모두의 스펙트럼을 정렬하여 OCT의 이온 억제 간섭에서 중첩 피크를 평가한다.마지막으로, 조직 샘플을 함유하는 MALDI 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신, 또는 H 및 E 염색에 의해 처리한다. Maldi MS 분석의 이미지는 LPR1 녹아웃 돌연변이 뇌에서 지질 함량의 전반적인 감소를 보여주었습니다. 대표적인 H 및 E 염색된 성체 파리 뇌 절편이 여기에 도시되어 있다.지질 종, 각각의 MZ 값 및 히트 맵의 척도도이 이미지에 표시됩니다. 적어도 4개의 생물학적 복제로부터의 대조군과 비교하여 LPR1 녹아웃 돌연변이체에서의 감소의 평균 배는 화살표 옆에 숫자로서 도시된다. 대조군 및 돌연변이 파리 둘 다로부터의 뇌 조직 영역에서 선택된 빈 OCT 영역의 질량 스펙트럼은 MZ1 내지 1000 및 MZ520 내지 900의 범위에서 나타내었다.OCT의 간섭은 이온 억제 현상 및 중첩 신호 문제와 관련이 있습니다. 지질체학 데이터의 충실도를 유지하려면 적절한 샘플 준비, 해부 및 극저온 절편이 중요합니다. Maldi 실험을 수행한 후 액체 크로마토그래피, 질량 분석법 기반 지방체학이라고도 하는 LCMS를 통해 지질의 정체를 확인할 수 있습니다.이 기술은 뇌의 인간 질병 관련 대사 변화를 이해하는 길을 열어주는 강력하고 부드러운 모델 시스템을 사용하여 뇌 지질 항상성에 대한 분자 통찰력을 얻습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

든 샘플 준비 : 울트라 씬 레이어 방법

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

연구

생물학

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

의 준비 Drosophila</em공중 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상을위한> 태아

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

동위 원소 태그 질량 분광법을 사용하여 Thiol 산화 환원 프로테옴 프로 파일링

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

푸리에에 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 이미징 매트릭스 디 트라 놀은 이온 사이클로트론 공명 질량 분석기를 변환

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

히스톤 추출에서 데이터 분석에 : 상향식 질량 분석 사용 히스톤 번역 후 변형 분석을위한 완벽한 워크 플로우

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

대량 세포 계측법 분석을위한 샘플 준비

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Explanted 망막 조직 세포 외 유출 분석을 사용 하 여 신진 대사 에너지의 측정

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...