Name: sample preparation for rapid lipid analysis in drosophila brain using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging
Uploaded: 2022-07-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging at JoVE.com

Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy og Mayan Hein støttes av Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP). Jun Yin støttes av det intramurale forskningsprogrammet til National Institutes of Health Project Number 1ZIANS003137. Støtte til dette prosjektet ble gitt av en PSC-CUNY Award til Ye He og Rinat Abzalimov, finansiert av The Professional Staff Congress og The City University of New York.

1. Fly hodet embedding
MERK: Hele prosedyren tar ~ 45-60 min.
<ol><li>Forbered det optimale skjæretemperaturmiddelstadiet (OCT-forbindelse) med en flat overflate.<ol><li>Tilsett OCT i et plastkryommol (15 mm x 15 mm x 5 mm) til halvparten av kryommens dybde og unngå bobledannelse. La formen stå på en flat overflate i flere minutter, og overfør den deretter til tørris.</li>
		<li>Hold kryommet flatt på tørrisen og la OCT danne en flat og jevn overflate. Vent til OCT e...

<ol>
	<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+lipids+and+their+derivatives+in+biomedical+applications.">Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).</li><li>Augustin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+for+the+medium-chain+triglyceride+ketogenic+diet+in+neurological+and+metabolic+disorders.">Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders.</a> Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).</li><li>Baldwin, K. T., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+astrocyte-induced+synaptogenesis.">Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).</li><li>Mauch, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cns+synaptogenesis+promoted+by+glia-derived+cholesterol.">Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol.</a> Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+using+lipopolysaccharide-stimulated+bone+marrow-derived+dendritic+cells+to+treat+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).</li><li>Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+lipid+analysis+towards+lipidomics,+a+new+challenge+for+the+analytical+chemistry+of+the+21st+century.+Part+I:+Modern+lipid+analysis.">From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).</li><li>Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+lipids+analysis+towards+lipidomics,+a+new+challenge+for+the+analytical+chemistry+of+the+21st+century.+Part+II:+Analytical+lipidomics.">From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).</li><li>Yang, K., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+Techniques,+applications,+and+outcomes+related+to+biomedical+sciences.">Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).</li><li>Norris, J. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+tissue+specimens+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+imaging+mass+spectrometry+in+biological+and+clinical+research.">Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research.</a> Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).</li><li>Veerasammy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+for+metabolic+profiling+using+MALDI+mass+spectrometry+imaging.">Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).</li><li>Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+lipid+metabolism:+Multiple+pathways+driving+functional+outcomes+in+health+and+disease.">Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).</li><li>Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+their+trafficking:+An+integral+part+of+cellular+organization.">Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization.</a> Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).</li><li>Wang, H., Eckel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+lipoproteins+doing+in+the+brain.">What are lipoproteins doing in the brain.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).</li><li>Palm, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+in+Drosophila+melanogaster-Assembly,+function,+and+influence+on+tissue+lipid+composition.">Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition.</a> PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).</li><li>Parra-Peralbo, E., Culi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+lipophorin+receptors+mediate+the+uptake+of+neutral+lipids+in+oocytes+and+imaginal+disc+cells+by+an+endocytosis-independent+mechanism.">Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism.</a> PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-specific+lipoprotein+receptors+interact+with+astrocyte+derived+apolipoprotein+and+mediate+neuron-glia+lipid+shuttling.">Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).</li><li>Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+analysis+of+lipid+species+in+Drosophila+during+overnutrition+by+UHPLC-MS/MS+and+MALDI-MSI.">Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI.</a> Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).</li><li>Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+chemical+imaging+of+a+single+brain+tissue+section+using+ToF-SIMS,+MALDI-ToF+and+immuno/histochemical+staining.">Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining.</a> Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).</li><li>Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+structural+effects+of+oral+administration+of+methylphenidate+in+Drosophila+brain+by+secondary+ion+mass+spectrometry+imaging.">Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).</li><li>Dienel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+and+imaging+mass+spectrometric+assays+of+labile+brain+metabolites:+Critical+importance+of+brain+harvest+procedures.">Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures.</a> Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).</li><li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry:+Practical+aspects+of+sample+preparation.">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation.</a> Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).</li><li>Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+imaging+of+Drosophila+brain+using+matrix+sublimation+versus+modification+with+nanoparticles.">Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).</li><li>Niehoff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Drosophila+lipids+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometric+imaging.">Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).</li><li>Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+imaging+of+GABA+in+the+Drosophila+melanogaster+adult+head.">Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head.</a> Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).</li><li>Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+fly+malpighian+tubule+lipidome+by+imaging+mass+spectrometry.">Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).</li><li>Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+mass+spectrometry+for+lipidomics.">Advances in mass spectrometry for lipidomics.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+for+studying+metabolism.">Lipidomics for studying metabolism.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+internal+standards+for+accurate+quantification+of+complex+lipid+species+in+biological+extracts+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry-What,+how+and+why.">Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why.</a> Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).</li></ol>

Som vist i studien om variasjonene i lipidsammensetningen i mutante og villtype Drosophila-hjerner, kan MALDI MSI være en verdifull etikettfri avbildningsteknikk for in situ-analyse av molekylære distribusjonsmønstre i organer av små insekter. Faktisk, fordi lipider fordeles i både hjernevev og fettlegemer i Drosophila-hoder, kan konvensjonelle lipidomikktilnærminger basert på væskekromatografi og massespektrometri (LC-MS) bare oppdage kombinerte signaler fra begge regioner når helhode...

Lipider er involvert i et bredt spekter av biologiske prosesser og kan grovt klassifiseres i fem kategorier basert på deres strukturelle mangfold: fettsyrer, triacylglyceroler (TAGs), fosfolipider, sterollipider og sfingolipider1. De grunnleggende funksjonene til lipider er å gi energikilder for biologiske prosesser (dvs. TAGs) og danne cellulære membraner (dvs. fosfolipider og kolesterol). Imidlertid har flere roller av lipider blitt notert i utvikling og sykdommer, og har blitt grundig studert i det biomedisinske feltet. For eksempel har rapporter vist at fettsyrer av forskjellig lengde kan ha unike terapeutiske roller. Korte fettsyrekjeder kan være involvert i forsvarsmekanismer mot autoimmune sykdommer, mellomlange fettsyrekjeder produserer metabolitter som kan redusere anfall, og lange fettsyrekjeder genererer metabolitter som kan brukes til å behandle metabolske forstyrrelser2. I nervesystemet har glia-avledet kolesterol og fosfolipider vist seg å være avgjørende for synaptogenese 3,4. Andre typer lipider har vist løfte i medisinske applikasjoner, inkludert sfingolipider som brukes i legemiddelleveringssystemer og sakkarolipider som brukes til å støtte immunsystemet 5,6. De mange rollene og potensielle terapeutiske anvendelser av lipider i det biomedisinske feltet har gjort lipidomikk - studiet av veier og interaksjoner av cellulære lipider - et kritisk og stadig viktigere felt.
Lipidomics bruker analytisk kjemi for å studere lipidomet i stor skala. De viktigste eksperimentelle metodene som brukes i lipidomikk er basert på massespektrometri (MS) kombinert med ulike kromatografi- og ionmobilitetsteknikker 7,8. Bruken av MS i området er fordelaktig på grunn av sin høye spesifisitet og følsomhet, anskaffelseshastighet og unike evner til å (1) oppdage lipider og lipidmetabolitter som forekommer selv ved lave og forbigående nivåer, (2) oppdage hundrevis av forskjellige lipidforbindelser i et enkelt eksperiment, (3) identifisere tidligere ukjente lipider, og (4) skille mellom lipidisomerer. Blant utviklingen innen MS, inkludert desorpsjonselektrosprayionisering (DESI), MALDI og sekundær ionmassespektrometri (SIMS), MALDI MSI har dukket opp som en kraftig avbildningsteknikk som utfyller konvensjonelle MS-baserte tilnærminger ved å gi unik informasjon om romlig fordeling av lipider i vevsrom 9,10.
Den typiske arbeidsflyten for lipidomikk består av prøvepreparering, datainnsamling ved hjelp av massespektrometriteknologi og dataanalyse11. Studien av lipider og metabolitter i prøver har ført til fremveksten av teknikker for å forstå de fysiologiske og patologiske forholdene i metabolske prosesser i organismer. Selv om det er viktig å forstå biologiske interaksjoner, gjør følsomheten til lipider og metabolitter dem vanskelige å avbilde og identifisere uten fargestoffer eller annen modifikasjon. Endringer i metabolittnivåer eller distribusjon kan føre til fenotypiske endringer. Et verktøy som brukes til metabolomisk profilering er MALDI MSI, en etikettfri, in situ avbildningsteknikk som er i stand til å oppdage hundrevis av molekyler samtidig. MALDI-avbildning muliggjør visualisering av metabolitter og lipider i prøver samtidig som de opprettholder deres integritet og romlige fordeling. Tidligere teknologi for lipidprofilering involverte bruk av radioaktive kjemikalier for å kartlegge lipider individuelt, mens MALDI-avbildning gir avkall på dette og muliggjør påvisning av en rekke lipider samtidig.
Lipidmetabolisme og homeostase spiller viktige funksjoner i cellefysiologi, for eksempel vedlikehold og utvikling av nervesystemet. Et viktig aspekt av nervesystemets lipidmetabolisme er lipidshuttlingen mellom nevroner og gliaceller, som er mediert av molekylære bærerlipoproteiner, inkludert svært lavt tetthet lipoprotein (VLDL), lavdensitetslipoproteiner (LDL) og høy tetthet lipoproteiner (HDL) 12. Lipoproteiner inneholder apolipoproteiner (Apo), som ApoB og ApoD, som fungerer som strukturelle blokker av lipidlast og som ligander for lipoproteinreseptorer. Neuron-glia crosstalk av lipider involverer flere spillere som glia-avledet ApoD, ApoE og ApoJ, og deres neuronale LDL-reseptorer (LDLR)13,14. I Drosophila er apolipophorin, medlem av ApoB-familien, en stor hemolymph lipidbærer15. Apolipophorin har to nært beslektede lipoforinreseptorer (LpRs), LpR1 og LpR2, som er homologer av pattedyr LDLR15,16. I tidligere studier ble det astrocyttutskilte lipocalin Glial Lazarillo (GLaz), en Drosophila-homolog av human ApoD, og dets nevronreseptor LpR1 oppdaget å kooperativt mediere neuron-glia lipid shuttling, og dermed regulere dendritmorfogenese17. Derfor ble det spekulert i at tapet av LpR1 ville føre til en reduksjon i det totale lipidinnholdet i Drosophila-hjernen. MALDI MSI vil være et egnet verktøy for å profilere lipidinnholdet i små vev av LpR1-/− mutante og villtype Drosophila-hjerner, som vist i denne studien.
Til tross for den økende populariteten til MALDI MSI, hindrer instrumentets høye kostnader og eksperimentelle kompleksitet ofte implementeringen i individuelle laboratorier. Dermed utføres de fleste MALDI MSI-studier ved hjelp av delte kjernefasiliteter. Som med andre anvendelser av MALDI MSI, er en forsiktig prøveprepareringsprosess for lipidomikk avgjørende for å oppnå pålitelige resultater. Men fordi prøvelysning vanligvis utføres i individuelle forskningslaboratorier, er det en mulighet for variasjon i MALDI MSI-oppkjøp. For å bekjempe dette, tar dette papiret sikte på å gi en detaljert protokoll for prøvepreparering av små biologiske prøver før MALDI MSI-måling ved hjelp av lipidanalyse av en stor gruppe voksne Drosophila-hjerner i positiv ionmodus som et eksempel11,17. Imidlertid er noen fosfolipidklasser og flertallet av små metabolitter gunstig detektert ved MALDI-avbildning i negativ ionmodus, som ble beskrevet tidligere11. Derfor, med disse to eksempelstudiene, håper vi å gi detaljerte prøveprepareringsprotokoller av forskjellige kombinasjoner: frittstående stort vev versus innebygd lite vev, tinemontering versus varmskyvmontering og positiv ionmodus versus negativ ionmodus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)</td>
			<td>Millipore Sigma Aldrich</td>
			<td>85707-1G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;CRYOMOLD 15X15X5</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9464347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-111-2302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoflex speed MALDI-TOF MS system</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>MALDI-TOF MS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Syringe with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics&#160;GLASS SLIDES MALDI IMAGNG</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0380464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td>AC219095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Perfection V600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;5-Place Slide Mailer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Digital Auto-Range Multimeter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-241-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging v3.0</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Bruker MS imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTX M5 Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Automatic heated matrix sprayer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC&#160;Ziploc Freezer Bag</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-111-3769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab (2015b)</td>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td></td>
			<td>Advanced MALDI MSI data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;CryoStar NX50 Cryostat</td>
			<td>Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>95-713-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for rapid lipid analysis in drosophila brain using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging

Lipidprofilering, eller lipidomikk, er en veletablert teknikk som brukes til å studere hele lipidinnholdet i en celle eller et vev. Informasjon ervervet fra lipidomikk er verdifull for å studere veiene som er involvert i utvikling, sykdom og cellulær metabolisme. Mange verktøy og instrumenteringer har hjulpet lipidomikkprosjekter, særlig ulike kombinasjoner av massespektrometri og væskekromatografiteknikker. Matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering massespektrometriavbildning (MALDI MSI) har nylig dukket opp som en kraftig bildebehandlingsteknikk som utfyller konvensjonelle tilnærminger. Denne nye teknikken gir unik informasjon om den romlige fordelingen av lipider i vevsrom, som tidligere var uoppnåelig uten bruk av overdreven modifikasjoner. Prøveprepareringen av MALDI MSI-tilnærmingen er kritisk og er derfor fokus for denne artikkelen. Dette papiret presenterer en rask lipidanalyse av et stort antall Drosophila-hjerner innebygd i optimal skjæretemperaturforbindelse (OCT) for å gi en detaljert protokoll for fremstilling av små vev for lipidanalyse eller metabolitt- og småmolekylanalyse gjennom MALDI MSI.

Tapet av nevronreseptoren LpR1 av det astrocyttutskilte lipocalin Glial Lazarillo (GLaz), en Drosophila-homolog av human ApoD, ble antatt å kunne forårsake en reduksjon i det totale lipidinnholdet i Drosophila-hjernen. For å teste dette ble MALDI MSI brukt til å profilere lipidene i LpR1−/− mutante og villtype Drosophila-hjerner, som er utdypet nedenfor.
Forsøket ble utført i henhold til arbeidsflyten vist i figur 1<...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging at JoVE.com

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Målet med denne protokollen er å gi detaljert veiledning om riktig prøvepreparering for lipid- og metabolittanalyse i små vev, slik som Drosophila-hjernen , ved bruk av matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering (MALDI) massespektrometriavbildning.

Prøvepreparering for rask lipidanalyse i Drosophila Brain ved bruk av matriseassistert laserdesorpsjon / ionisering massespektrometriavbildning

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired ...

Maldi MS spektrometriavbildning er et etablert og nyttig verktøy for å identifisere og visualisere lipid overflod og distribusjon, uten overdreven prøvemodifisering. Den største fordelen med Maldi-avbildning er dens evne til å oppdage lipidene in situ uten merking, og analysere en stor populasjon av prøver samtidig. Øvelse gjør mester.Pass på at du øver godt før du behandler de virkelige eksperimentelle prøvene. Minimer prøveprepareringstiden og unngå forurensning gjennom hele prosedyren. For å begynne, legg til den optimale skjæretemperaturen, eller OCT i en plastkryoform til halvparten av dybden av kryoformen samtidig som du unngår bobledannelse.La formen stå på en flat overflate i flere minutter, og overfør den deretter til tørris. Hold kryommet flatt på tørrisen og la OCT danne en flat og jevn overflate. Vent til OCT er helt størknet i formen.Bruk de frosne OCT-trinnene umiddelbart, eller oppbevar dem ved minus 80 grader Celsius. Etter bedøvelse av de voksne fluene Bruk karbondioksid, lag en petriskål som inneholder et stykke laboratorieserviett. Bruk vann til å fukte en del av servietten for å redusere statisk elektrisitet.Hold våtservietten halvt våt og halvt tørr. Etter å ha kuttet fluehodet under et dissekeringsomfang, samle fire til fem hoder og legg dem på det tørre området av laboratorieservietten. Ta OCT-stadiet fra tørris til mikroskop to.Overfør hodene umiddelbart til OCT-stadiet og ordne dem raskt, noe som tar rundt 30 til 60 sekunder for å unngå OCT-smelting. La rundt en millimeter tomt mellomrom rundt hver fluehjerne for å sikre tilstrekkelig støtte fra OCT og fire til fem millimeter tomt mellomrom fra kanten av blokken for å gi tilstrekkelig plass til å håndtere seksjonen. Sett OCT-stadiet tilbake på tørrisen og la det stå på i rundt tre minutter for å sikre at OCT-stadiet forblir frosset og fast.Etter at alle fluehodene er justert, la OCT-scenen sitte på tørris i ytterligere fem til 10 minutter. Overfør OCT-trinnet fra tørrisen til en flat overflate og tilsett deretter raskt en stor mengde OCT-forbindelse for å dekke alle prøvene og fyll hele kryommet, som tar rundt tre sekunder. Overfør kryommet umiddelbart tilbake til tørris og frys hele OCT-blokken som inneholder det innebygde vevet.La OCT-stadiet sitte på tørrisen i ytterligere fem til 10 minutter. Merk prøvene på marginen av kryommen og oppbevar de frosne prøvene ved minus 80 grader Celsius til de er klare for seksjonering. Bekreft den ITO-kodede siden ved å teste ledningsevnen til ITO-lysbildene ved hjelp av en voltmåler satt til motstand.Merk siden med en motstandsmåling som den siden vevet skal festes til. Merk den og sett alltid en laboratorieserviett på bunnen av lysbildet for å unngå lysbildekontaminering. La deretter vevet balansere i kryostatkammeret i 30 til 45 minutter.Rengjør kryostat, helst med 70% etanol. Tørk av rulleplaten i trinn og fjern de brukte bladene. Bruk ekstra rene våtservietter for å sikre at etanolen har fordampet og at alle overflatene er tørre før seksjoneringen begynner.Deretter justerer du temperaturen på kryostatkammerets sandprøvehode i henhold til vevstypen. Monter vevet på prøveholderen ved hjelp av OCT. Vær forsiktig med å bruke nok OCT til å dekke bunnen av OCT-blokken og monter blokken så flatt som mulig.Plasser et rent blad på scenen og lås det. Plasser hodet på prøven mot trinnet etter behov for å oppnå ønsket skjærevinkel. Begynn deretter kuttingen i tykke seksjoner til interesseområdet er funnet.Børst hele tiden av de ekstra brikkene med en forhåndskjølt artistbørste for å holde scenen ren. Juster kammertemperaturen litt etter behov og endre tykkelsen på seksjonene til 10 til 12 mikrometer når ønsket region er nådd. Samle forsiktig den ønskede delen.Ta en romtemperatur ITO-lysbilde og plasser den over seksjonen. Tilnærm deg seksjonen forsiktig og fest den til lysbildet uten å etterlate spor på kryostatstadiet. Plasser lysbildet til side i et stativ, eller laboratorietørk utenfor kryostat mellom samlingene av flere seksjoner.Hvis sammenligning på tvers av forskjellige prøver av samme kohort er ønsket, plasser seksjonene fra flere prøver på et enkelt lysbilde slik at de kan analyseres samtidig for å minimere variasjonen. Om nødvendig, skille til to lysbilder, da Maldi-målholderen har plass til to lysbilder i en enkelt kjøring. Transporter lysbildene i en vakuumboks til en tørkemiddel med tørkemiddel som bunnlag.Kjør lysbildene under et vakuum i 30 til 60 minutter, og fortsett deretter til matriseavsetningen. Bruk to fem dihydroksybenzosyre, eller DHB, i metanolvann som matrise. Plasser lysbildene i en lysbildetransportør og tett åpningen ordentlig med voksfilmen.Forsegl med glidelåsposen. Legg den i en annen glidelåspose som inneholder tørkemiddel. Merk utsiden og send prøven til Maldi kjerneanlegg med tilstrekkelige tørre øyne.For matriseavsetningen, bruk 40 milligram per milliliter DHB og metanolvann som matrise og spray det ved hjelp av en automatisk HTX M5 matrisesprøyte. Bruk nitrogengasstrykk på 10 PSI. Bruk en Maldi-flytid, MS-instrument og positiv ionmodus for å skaffe deg et massespektrum.Kalibrer instrumentet ved å oppdage 0,5 mikroliter rød fosforemulsjon i aceto Nitro på ITO-lysbildene. Bruk spektra til å kalibrere instrumentet i masseområdet 100 til 1000 MZ ved å bruke en kvadratisk kalibreringskurve. Sett laserpunktdiametrene til middels, da det er den modulerte stråleprofilen for 40 mikrometer rasterbredde, og samle bildedata ved å summere 500 skudd med en laserrepetisjonshastighet på 1000 hertz per arrayposisjon.Registrer deretter spektraldataene. Utfør bildedataanalysen ved hjelp av rotmiddelkvadratnormalisering for å generere ionebilder med en båndbredde på pluss minus 0,10 Dalton. Juster spektrene til både OCT og hjernevev fra samme eksperiment ved hjelp av programvaren for å evaluere de overlappende toppene i ionundertrykkelsesforstyrrelsen til OCT.Til slutt behandler du MALDI-lysbildene som inneholder vevsprøvene ved hematoksylin og eosin, eller H- og E-farging. Bilder fra Maldi MS-analyse viste en generell reduksjon i lipidinnholdet i LPR1 knockout mutant hjerne. De representative H- og E-fargede voksne fluehjerneseksjonene er vist her.Lipidartene, deres respektive MZ-verdier og skalaene til varmekartet er også angitt i dette bildet. Den gjennomsnittlige reduksjonen i LPR1 knockoutmutanten sammenlignet med kontrollene fra minst fire biologiske replikasjoner, vises som tall ved siden av pilene. Massespekteret til den valgte blanke OCT-regionen i hjernevevsområdet fra både kontroll- og mutantfluene er vist i området MZ1 til 1000 og MZ520 til 900.Forstyrrelsen av OCT er forbundet med både ionundertrykkelsesfenomener og overlappende signalproblemer. For å opprettholde troskapen til lipidomikkdata er passende prøvepreparering, disseksjon og kryoseksjonering avgjørende. Etter å ha utført Maldi-eksperimentet, kan identiteten til lipidene verifiseres gjennom LCMS, også kjent som væskekromatografi, massespektrometribasert lipodomi.Denne teknikken får molekylær innsikt i hjernens lipider homeostase ved å bruke det kraftige til myke modellsystemet som baner vei for å forstå menneskelige sykdomsrelaterte metabolske endringer i hjernen.

Research

JoVE Journal

Biology

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Profilering tiol Redox Proteome Bruke Isotope Tagging massespektrometri

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Dithranol som en matrise for Matrix Assisted Laser desorpsjon / Ionization Imaging på en Fourier Transform Ion syklotron Resonans Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Rapid Analyse og Utforskning av fluorescens mikros Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplett arbeidsflyt for analyse av Histone posttranslasjonelle modifikasjoner hjelp Bottom-up massespektrometri: Fra Histone Utvinning til dataanalyse

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Prøvepreparering for Mass Cytometry Analyse

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Eksempel forberedelse og bildebehandling for Exosomes av overføring elektronmikroskop

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Miniatyriserte eksempel forberedelse til overføring elektronmikroskop

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Måling av energi Metabolism i Explanted netthinnen vev ekstracellulære Flux analyse

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...