Name: sample preparation for rapid lipid analysis in drosophila brain using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging
Uploaded: 2022-07-14T14:00:00
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Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy y Mayan Hein cuentan con el apoyo del Programa de Investigación de Verano de CUNY (CSURP) de la Fundación Sloan. Jun Yin cuenta con el apoyo del programa de investigación intramuros del Proyecto de los Institutos Nacionales de Salud Número 1ZIANS003137. El apoyo para este proyecto fue proporcionado por un Premio PSC-CUNY a Ye He y Rinat Abzalimov, financiado conjuntamente por el Congreso de Personal Profesional y la Universidad de la Ciudad de Nueva York.

1. Incrustación de cabezal de mosca
NOTA: Todo el procedimiento toma ~ 45-60 min.
<ol><li>Prepare la etapa óptima del compuesto de temperatura de corte (compuesto OCT) con una superficie plana.<ol><li>Agregue OCT en un criomold de plástico (15 mm x 15 mm x 5 mm) a la mitad de la profundidad del criomold y evite la formación de burbujas. Deje el molde sobre una superficie plana durante varios minutos y luego transfiéralo a hielo seco.</li>
		<li>Mantenga el criomold plan...

<ol>
	<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+lipids+and+their+derivatives+in+biomedical+applications.">Bioactive lipids and their derivatives in biomedical applications.</a> Biomolecules &amp; Therapeutics. 29 (5), 465-482 (2021).</li><li>Augustin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+action+for+the+medium-chain+triglyceride+ketogenic+diet+in+neurological+and+metabolic+disorders.">Mechanisms of action for the medium-chain triglyceride ketogenic diet in neurological and metabolic disorders.</a> Lancet Neurology. 17 (1), 84-93 (2018).</li><li>Baldwin, K. T., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+astrocyte-induced+synaptogenesis.">Molecular mechanisms of astrocyte-induced synaptogenesis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 113-120 (2017).</li><li>Mauch, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cns+synaptogenesis+promoted+by+glia-derived+cholesterol.">Cns synaptogenesis promoted by glia-derived cholesterol.</a> Science. 294 (5545), 1354-1357 (2001).</li><li>Hannun, Y. A., Obeid, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sphingolipids+and+their+metabolism+in+physiology+and+disease.">Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).</li><li>Zhou, F., Ciric, B., Zhang, G. X., Rostami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunotherapy+using+lipopolysaccharide-stimulated+bone+marrow-derived+dendritic+cells+to+treat+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Immunotherapy using lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clinical and Experimental Immunology. 178 (3), 447-458 (2014).</li><li>Carrasco-Pancorbo, A., Navas-Iglesias, N., Cuadros-Rodriguez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+lipid+analysis+towards+lipidomics,+a+new+challenge+for+the+analytical+chemistry+of+the+21st+century.+Part+I:+Modern+lipid+analysis.">From lipid analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part I: Modern lipid analysis.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (3), 263-278 (2009).</li><li>Navas-Iglesias, N., Carrasco-Pancorbo, A., Cuadros-Rodriguez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+lipids+analysis+towards+lipidomics,+a+new+challenge+for+the+analytical+chemistry+of+the+21st+century.+Part+II:+Analytical+lipidomics.">From lipids analysis towards lipidomics, a new challenge for the analytical chemistry of the 21st century. Part II: Analytical lipidomics.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 28 (4), 393-403 (2009).</li><li>Yang, K., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics:+Techniques,+applications,+and+outcomes+related+to+biomedical+sciences.">Lipidomics: Techniques, applications, and outcomes related to biomedical sciences.</a> Trends in Biochemical Sciences. 41 (11), 954-969 (2016).</li><li>Norris, J. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+tissue+specimens+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+imaging+mass+spectrometry+in+biological+and+clinical+research.">Analysis of tissue specimens by matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry in biological and clinical research.</a> Chemical Reviews. 113 (4), 2309-2342 (2013).</li><li>Veerasammy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+for+metabolic+profiling+using+MALDI+mass+spectrometry+imaging.">Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (166), e62008 (2020).</li><li>Tracey, T. J., Steyn, F. J., Wolvetang, E. J., Ngo, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+lipid+metabolism:+Multiple+pathways+driving+functional+outcomes+in+health+and+disease.">Neuronal lipid metabolism: Multiple pathways driving functional outcomes in health and disease.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 10 (2018).</li><li>Jackson, C. L., Walch, L., Verbavatz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipids+and+their+trafficking:+An+integral+part+of+cellular+organization.">Lipids and their trafficking: An integral part of cellular organization.</a> Developmental Cell. 39 (2), 139-153 (2016).</li><li>Wang, H., Eckel, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+are+lipoproteins+doing+in+the+brain.">What are lipoproteins doing in the brain.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 25 (1), 8-14 (2014).</li><li>Palm, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+in+Drosophila+melanogaster-Assembly,+function,+and+influence+on+tissue+lipid+composition.">Lipoproteins in Drosophila melanogaster-Assembly, function, and influence on tissue lipid composition.</a> PLoS Genetics. 8 (7), 1002828 (2012).</li><li>Parra-Peralbo, E., Culi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+lipophorin+receptors+mediate+the+uptake+of+neutral+lipids+in+oocytes+and+imaginal+disc+cells+by+an+endocytosis-independent+mechanism.">Drosophila lipophorin receptors mediate the uptake of neutral lipids in oocytes and imaginal disc cells by an endocytosis-independent mechanism.</a> PLoS Genetics. 7 (2), 1001297 (2011).</li><li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-specific+lipoprotein+receptors+interact+with+astrocyte+derived+apolipoprotein+and+mediate+neuron-glia+lipid+shuttling.">Brain-specific lipoprotein receptors interact with astrocyte derived apolipoprotein and mediate neuron-glia lipid shuttling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2408 (2021).</li><li>Tuthill, B. F., Searcy, L. A., Yost, R. A., Musselman, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+analysis+of+lipid+species+in+Drosophila+during+overnutrition+by+UHPLC-MS/MS+and+MALDI-MSI.">Tissue-specific analysis of lipid species in Drosophila during overnutrition by UHPLC-MS/MS and MALDI-MSI.</a> Journal of Lipid Research. 61 (3), 275-290 (2020).</li><li>Kaya, I., Jennische, E., Lange, S., Malmberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+chemical+imaging+of+a+single+brain+tissue+section+using+ToF-SIMS,+MALDI-ToF+and+immuno/histochemical+staining.">Multimodal chemical imaging of a single brain tissue section using ToF-SIMS, MALDI-ToF and immuno/histochemical staining.</a> Analyst. 146 (4), 1169-1177 (2021).</li><li>Phan, N. T., Fletcher, J. S., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+structural+effects+of+oral+administration+of+methylphenidate+in+Drosophila+brain+by+secondary+ion+mass+spectrometry+imaging.">Lipid structural effects of oral administration of methylphenidate in Drosophila brain by secondary ion mass spectrometry imaging.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4063-4071 (2015).</li><li>Dienel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+and+imaging+mass+spectrometric+assays+of+labile+brain+metabolites:+Critical+importance+of+brain+harvest+procedures.">Metabolomic and imaging mass spectrometric assays of labile brain metabolites: Critical importance of brain harvest procedures.</a> Neurochemical Research. 45 (11), 2586-2606 (2020).</li><li>Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+tissue+analysis+using+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry:+Practical+aspects+of+sample+preparation.">Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: Practical aspects of sample preparation.</a> Journal of Mass Spectrometry. 38 (7), 699-708 (2003).</li><li>Phan, N. T., Mohammadi, A. S., Dowlatshahi Pour, M., Ewing, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+mass+spectrometry+imaging+of+Drosophila+brain+using+matrix+sublimation+versus+modification+with+nanoparticles.">Laser desorption ionization mass spectrometry imaging of Drosophila brain using matrix sublimation versus modification with nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 88 (3), 1734-1741 (2016).</li><li>Niehoff, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Drosophila+lipids+by+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometric+imaging.">Analysis of Drosophila lipids by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric imaging.</a> Analytical Chemistry. 86 (22), 11086-11092 (2014).</li><li>Enomoto, Y., Nt An, P., Yamaguchi, M., Fukusaki, E., Shimma, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+imaging+of+GABA+in+the+Drosophila+melanogaster+adult+head.">Mass spectrometric imaging of GABA in the Drosophila melanogaster adult head.</a> Analytical Sciences. 34 (9), 1055-1059 (2018).</li><li>Yang, E., Gamberi, C., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+fly+malpighian+tubule+lipidome+by+imaging+mass+spectrometry.">Mapping the fly malpighian tubule lipidome by imaging mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 54 (6), 557-566 (2019).</li><li>Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+mass+spectrometry+for+lipidomics.">Advances in mass spectrometry for lipidomics.</a> Annual Review of Analytical Chemistry. 3, 433-465 (2010).</li><li>Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidomics+for+studying+metabolism.">Lipidomics for studying metabolism.</a> Nature Reviews Endocrinology. 12 (11), 668-679 (2016).</li><li>Wang, M., Wang, C., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+internal+standards+for+accurate+quantification+of+complex+lipid+species+in+biological+extracts+by+electrospray+ionization+mass+spectrometry-What,+how+and+why.">Selection of internal standards for accurate quantification of complex lipid species in biological extracts by electrospray ionization mass spectrometry-What, how and why.</a> Mass Spectrometry Reviews. 36 (6), 693-714 (2017).</li></ol>

Como se demostró en el estudio sobre las variaciones en la composición de lípidos en cerebros mutantes y salvajes de Drosophila, MALDI MSI puede ser una valiosa técnica de imagen sin etiqueta para el análisis in situ de patrones de distribución molecular dentro de órganos de pequeños insectos. De hecho, debido a que los lípidos se distribuyen tanto en el tejido cerebral como en los cuerpos grasos de las cabezas de Drosophila, los enfoques lipidómicos convencionales basados en cromatog...

Los lípidos están involucrados en una amplia gama de procesos biológicos y pueden clasificarse ampliamente en cinco categorías basadas en su diversidad estructural: ácidos grasos, triacilgliceroles (TAG), fosfolípidos, lípidos de esteroles y esfingolípidos1. Las funciones fundamentales de los lípidos son proporcionar fuentes de energía para los procesos biológicos (es decir, TAG) y formar membranas celulares (es decir, fosfolípidos y colesterol). Sin embargo, se han observado funciones adicionales de los lípidos en el desarrollo y las enfermedades, y se han estudiado ampliamente en el campo biomédico. Por ejemplo, los informes han demostrado que los ácidos grasos de diferentes longitudes pueden tener funciones terapéuticas únicas. Las cadenas cortas de ácidos grasos pueden estar involucradas en los mecanismos de defensa contra enfermedades autoinmunes, las cadenas de ácidos grasos de longitud media producen metabolitos que pueden mitigar las convulsiones y las cadenas largas de ácidos grasos generan metabolitos que pueden usarse para tratar trastornos metabólicos2. En el sistema nervioso, el colesterol derivado de la glía y los fosfolípidos han demostrado ser vitales para la sinaptogénesis 3,4. Otros tipos de lípidos se han mostrado prometedores en aplicaciones médicas, incluyendo esfingolípidos utilizados en sistemas de administración de fármacos y sacarolípidos utilizados para apoyar el sistema inmunológico 5,6. Las numerosas funciones y posibles aplicaciones terapéuticas de los lípidos en el campo biomédico han hecho de la lipidómica, el estudio de las vías e interacciones de los lípidos celulares, un campo crítico y cada vez más importante.
La lipidómica hace uso de la química analítica para estudiar el lipidoma a gran escala. Los principales métodos experimentales utilizados en lipidómica se basan en espectrometría de masas (SM) junto con diversas técnicas de cromatografía y movilidad iónica 7,8. El uso de MS en el área es ventajoso debido a su alta especificidad y sensibilidad, velocidad de adquisición y capacidades únicas para (1) detectar lípidos y metabolitos de lípidos que ocurren incluso a niveles bajos y transitorios, (2) detectar cientos de compuestos lipídicos diferentes en un solo experimento, (3) identificar lípidos previamente desconocidos y (4) distinguir entre isómeros lipídicos. Entre los desarrollos en EM, incluyendo la ionización por electrospray de desorción (DESI), MALDI y la espectrometría de masas de iones secundarios (SIMS), MALDI MSI ha surgido como una poderosa técnica de imagen que complementa los enfoques convencionales basados en EM al proporcionar información única sobre la distribución espacial de los lípidos dentro de los compartimentos tisulares 9,10.
El flujo de trabajo típico de la lipidómica consiste en la preparación de muestras, la adquisición de datos mediante tecnología de espectrometría de masas y el análisis de datos11. El estudio de lípidos y metabolitos en muestras ha llevado a la aparición de técnicas para comprender las condiciones fisiológicas y patológicas de los procesos metabólicos en los organismos. Si bien la comprensión de las interacciones biológicas es importante, la sensibilidad de los lípidos y metabolitos hace que sean difíciles de visualizar e identificar sin colorantes u otras modificaciones. Los cambios en los niveles o distribución de metabolitos pueden conducir a cambios fenotípicos. Una herramienta utilizada para el perfil metabolómico es MALDI MSI, una técnica de imagen in situ sin etiquetas capaz de detectar cientos de moléculas simultáneamente. Las imágenes MALDI permiten la visualización de metabolitos y lípidos en muestras al tiempo que preservan su integridad y distribución espacial. La tecnología anterior para el perfil de lípidos implicaba el uso de productos químicos radiactivos para mapear individualmente los lípidos, mientras que las imágenes MALDI renuncian a esto y permiten la detección de una variedad de lípidos simultáneamente.
El metabolismo de los lípidos y la homeostasis desempeñan funciones importantes en la fisiología celular, como el mantenimiento y desarrollo del sistema nervioso. Un aspecto esencial del metabolismo lipídico del sistema nervioso es el desplazamiento de lípidos entre las neuronas y las células gliales, que está mediado por lipoproteínas transportadoras moleculares, incluyendo lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL)12. Las lipoproteínas contienen apolipoproteínas (Apo), como ApoB y ApoD, que funcionan como bloques estructurales de carga lipídica y como ligandos para los receptores de lipoproteínas. La diafonía neurona-glía de lípidos involucra a múltiples jugadores como ApoD, ApoE y ApoJ derivados de la glía, y sus receptores neuronales de LDL (LDLR)13,14. En Drosophila, la apolipoforina, un miembro de la familia ApoB, es un importante portador de lípidos hemolinfáticos15. La apolipoforina tiene dos receptores de lipoforina estrechamente relacionados (LpRs), LpR1 y LpR2, que son homólogos de LDLR15,16 en mamíferos. En estudios previos, se descubrió que la lipocalina secretada por astrocitos Glial Lazarillo (GLaz), un homólogo de Drosophila de la ApoD humana, y su receptor neuronal LpR1 median cooperativamente el transporte de lípidos neurona-glia, regulando así la morfogénesis de las dendritas17. Por lo tanto, se especuló que la pérdida de LpR1 causaría una disminución en el contenido total de lípidos en el cerebro de Drosophila. MALDI MSI sería una herramienta adecuada para perfilar el contenido de lípidos en pequeños tejidos de cerebros mutantes y de Drosophila mutantes y salvajes de LpR1−/−, como se demuestra en este estudio.
A pesar de la creciente popularidad de MALDI MSI, el alto costo del instrumento y la complejidad experimental a menudo impiden su implementación en laboratorios individuales. Por lo tanto, la mayoría de los estudios MALDI MSI se realizan utilizando instalaciones centrales compartidas. Al igual que con otras aplicaciones de MALDI MSI, un proceso cuidadoso de preparación de muestras para lipidómica es fundamental para lograr resultados confiables. Sin embargo, debido a que la preparación de la muestra de portaobjetos se realiza típicamente en laboratorios de investigación individuales, existe la posibilidad de variación en la adquisición de MALDI MSI. Para combatir esto, este artículo tiene como objetivo proporcionar un protocolo detallado para la preparación de muestras biológicas pequeñas antes de la medición de MALDI MSI utilizando el análisis lipídico de un gran grupo de cerebros adultos de Drosophila en modo de iones positivos como ejemplo11,17. Sin embargo, algunas clases de fosfolípidos y la mayoría de los metabolitos pequeños se detectan favorablemente mediante imágenes MALDI en modo de iones negativos, que se describió anteriormente11. Por lo tanto, con estos dos estudios de ejemplo, esperamos proporcionar protocolos detallados de preparación de muestras de varias combinaciones: tejido grande independiente versus tejido pequeño incrustado, montaje de descongelación versus montaje de diapositiva caliente y modo de iones positivos versus modo de iones negativos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB)</td>
			<td>Millipore Sigma Aldrich</td>
			<td>85707-1G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;CRYOMOLD 15X15X5</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9464347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Andwin Scientific&#160;Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artist brush MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-111-2302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoflex speed MALDI-TOF MS system</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>MALDI-TOF MS instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Syringe with Luer-Lok Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-823-16E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Vacutainer General Use Syringe Needles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-021-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bruker Daltonics&#160;GLASS SLIDES MALDI IMAGNG</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0380464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drierite, with indicator, 8 mesh, ACROS Organics</td>
			<td></td>
			<td>AC219095000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>Perfection V600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;5-Place Slide Mailer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>HS15986</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Digital Auto-Range Multimeter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-241-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexImaging v3.0</td>
			<td>Bruker Daltonics Inc</td>
			<td></td>
			<td>Bruker MS imaging analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MMX04751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W5-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTX M5 Sprayer</td>
			<td>HTX Technologies, LLC</td>
			<td></td>
			<td>Automatic heated matrix sprayer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimberly-Clark Professional&#160;Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC&#160;Ziploc Freezer Bag</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-111-3769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCiLS Lab (2015b)</td>
			<td>SCiLS Lab</td>
			<td></td>
			<td>Advanced MALDI MSI data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;CryoStar NX50 Cryostat</td>
			<td>Fisher Thermo Scientific</td>
			<td>95-713-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific&#160;Nalgene Transparent Polycarbonate Classic Design Desiccator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-642-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for rapid lipid analysis in drosophila brain using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging

El perfil lipídico, o lipidómica, es una técnica bien establecida utilizada para estudiar todo el contenido de lípidos de una célula o tejido. La información adquirida de la lipidómica es valiosa para estudiar las vías involucradas en el desarrollo, la enfermedad y el metabolismo celular. Muchas herramientas e instrumentaciones han ayudado a proyectos de lipidómica, especialmente varias combinaciones de técnicas de espectrometría de masas y cromatografía líquida. La espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI MSI) ha surgido recientemente como una poderosa técnica de imagen que complementa los enfoques convencionales. Esta novedosa técnica proporciona información única sobre la distribución espacial de los lípidos dentro de los compartimentos tisulares, que antes era inalcanzable sin el uso de modificaciones excesivas. La preparación de muestras del enfoque MALDI MSI es fundamental y, por lo tanto, es el foco de este documento. Este artículo presenta un análisis rápido de lípidos de un gran número de cerebros de Drosophila incrustados en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) para proporcionar un protocolo detallado para la preparación de tejidos pequeños para el análisis de lípidos o análisis de metabolitos y moléculas pequeñas a través de MALDI MSI.

Se planteó la hipótesis de que la pérdida del receptor neuronal LpR1 de la lipocalina secretada por astrocitos Glial Lazarillo (GLaz), un homólogo de Drosophila de la ApoD humana, podía causar una disminución en el contenido general de lípidos en el cerebro de Drosophila. Para probar esto, se utilizó MALDI MSI para perfilar los lípidos en cerebros mutantes y de Drosophila mutantes y de tipo salvaje LpR1−/−, que se explica a continuación.
<p class="jove_cont...

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Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada sobre la preparación adecuada de la muestra para el análisis de lípidos y metabolitos en tejidos pequeños, como el cerebro de Drosophila , utilizando imágenes de espectrometría de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI).

Preparación de muestras para el análisis rápido de lípidos en el cerebro de Drosophila utilizando imágenes de espectrometría de masas de desorción / ionización láser asistidas por matriz

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired ...

Las imágenes de espectrometría Maldi MS son una herramienta establecida y útil para identificar y visualizar la abundancia y distribución de lípidos, sin una modificación excesiva de la muestra. La principal ventaja de las imágenes Maldi es su capacidad para detectar los lípidos in situ sin etiquetar, y analizar una gran población de muestras simultáneamente. La práctica hace al maestro.Asegúrese de practicar bien antes de procesar las muestras experimentales reales. Minimice el tiempo de preparación de la muestra y evite la contaminación durante todo el procedimiento. Para comenzar, agregue la temperatura de corte óptima, u OCT en un criomold de plástico a la mitad de la profundidad del molde criogénico mientras evita la formación de burbujas.Deje el molde sobre una superficie plana durante varios minutos y luego transfiéralo a hielo seco. Mantenga el criomold plano sobre el hielo seco y permita que la OCT forme una superficie plana y uniforme. Espere hasta que la OCT esté completamente solidificada en el molde.Use las etapas OCT congeladas inmediatamente o guárdelas a menos 80 grados centígrados. Después de anestesiar a las moscas adultas Usando dióxido de carbono, prepare una placa de Petri que contenga un trozo de toallita de laboratorio. Use agua para humedecer parte de la toallita para reducir la electricidad estática.Mantenga la toallita medio húmeda y la mitad seca. Después de cortar la cabeza de la mosca bajo un endoscopio de disección uno, recoja de cuatro a cinco cabezas y colóquelas en el área seca de la toallita de laboratorio. Tome la etapa OCT de hielo seco al microscopio dos.Transfiera inmediatamente los cabezales a la etapa OCT y colóquelos rápidamente, lo que tarda entre 30 y 60 segundos en evitar que OCT se derrita. Deje alrededor de un milímetro de espacio en blanco alrededor de cada cerebro de mosca para garantizar un soporte adecuado de la OCT y de cuatro a cinco milímetros de espacio en blanco desde el borde del bloque para proporcionar un espacio adecuado para manejar la sección. Vuelva a colocar la etapa OCT en hielo seco y déjela actuar durante unos tres minutos para asegurarse de que la etapa OCT permanezca congelada y sólida.Después de que todas las cabezas de mosca estén alineadas, deje que la etapa OCT se asiente sobre hielo seco durante otros cinco a 10 minutos. Transfiera la etapa OCT del hielo seco a una superficie plana y luego agregue rápidamente una gran cantidad de compuesto OCT para cubrir todas las muestras y llenar todo el criomolde, lo que lleva alrededor de tres segundos. Transfiera inmediatamente el criomold de nuevo al hielo seco y congele todo el bloque OCT que contiene los tejidos incrustados.Deje que la etapa OCT repose en el hielo seco durante otros cinco a 10 minutos. Etiquete las muestras en el margen del criomold y guarde las muestras congeladas a menos 80 grados centígrados hasta que estén listas para la seccionación. Confirme el lado codificado ITO probando la conductividad de las guías ITO usando un voltímetro ajustado a resistencia.Marque el lado con una medida de resistencia como el lado al que adherir el tejido. Etiquételo y siempre coloque una toallita de laboratorio en la parte inferior del portaobjetos para evitar la contaminación del portaobjetos. Luego, permita que los tejidos se equilibren en la cámara de criostato durante 30 a 45 minutos.Limpie el criostato, preferiblemente con etanol al 70%. Limpie la placa antivuelco en el escenario y retire las cuchillas usadas. Use toallitas limpias adicionales para asegurarse de que el etanol se haya evaporado y que todas las superficies estén secas antes de comenzar la sección.A continuación, ajuste la temperatura de la cabeza de la muestra de arena de la cámara de criostato de acuerdo con el tipo de tejido. Monte el tejido en el portamuestras usando OCT. Tenga cuidado de usar suficiente OCT para cubrir la base del bloque OCT y monte el bloque lo más plano posible.Coloque una cuchilla limpia en el escenario y bloquéela. Coloque la cabeza de la muestra hacia la etapa según sea necesario para lograr el ángulo de corte deseado. Luego comience el corte en secciones gruesas hasta encontrar la región de interés.Cepilla constantemente las piezas adicionales con un pincel de artista preenfriado para mantener el escenario limpio. Ajuste ligeramente la temperatura de la cámara según sea necesario y cambie el grosor de las secciones a 10 a 12 micrómetros una vez que se alcance la región deseada. Recoja cuidadosamente la sección deseada.Tome un portaobjetos ITO a temperatura ambiente y colóquelo sobre la sección. Acérquese suavemente a la sección y adhiérala al portaobjetos sin dejar rastros en la etapa de criostato. Coloque el portaobjetos a un lado en una rejilla o limpie el laboratorio fuera del criostato entre las colecciones de varias secciones.Si se desea comparar entre diferentes muestras de la misma cohorte, coloque las secciones de varias muestras en una sola diapositiva para que puedan analizarse simultáneamente para minimizar la variación. Si es necesario, sepáralos en dos diapositivas, ya que el portaobjetos Maldi puede acomodar dos diapositivas en una sola ejecución. Transporta las diapositivas en una caja de vacío a un desecado con desecado como capa inferior.Conduzca las diapositivas bajo vacío durante 30 a 60 minutos, luego proceda a la deposición de la matriz. Use dos cinco dihidroxi ácido benzoico, o DHB, en agua de metanol como matriz. Coloque los portaobjetos en un transportador de diapositivas y selle firmemente la abertura con la película de cera.Selle con la bolsa con cremallera. Colóquelo en otra bolsa con cremallera que contenga desecante. Etiquete el exterior y envíe la muestra a las instalaciones centrales de Maldi con los ojos secos adecuados.Para la deposición de la matriz, use 40 miligramos por mililitro de DHB y agua de metanol como matriz y rocíela con un pulverizador automático de matriz HTX M5. Utilice una presión de gas nitrógeno de 10 PSI. Utilice un tiempo de vuelo Maldi, un instrumento MS y un modo de iones positivos para adquirir un espectro de masas.Calibre el instrumento detectando 0,5 microlitros de emulsión de fósforo rojo en aceto Nitro en los portaobjetos ITO. Utilícelo espectros para calibrar el instrumento en el rango de masa de 100 a 1000 MZ aplicando una curva de calibración cuadrática. Establezca los diámetros de punto láser en medio, ya que es el perfil de haz modulado para un ancho ráster de 40 micrómetros, y recopile datos de imágenes sumando 500 disparos a una tasa de repetición láser de 1000 hercios por posición de matriz.Luego registre los datos espectrales. Realice el análisis de datos de imágenes utilizando la normalización cuadrática media de raíz para generar imágenes de iones a un ancho de banda de más menos 0,10 Dalton. Alinear los espectros de la OCT y el tejido cerebral del mismo experimento utilizando el software para evaluar los picos superpuestos en la interferencia de supresión de iones de la OCT.Finalmente, procese los portaobjetos MALDI que contienen las muestras de tejido mediante hematoxilina y eosina, o tinción H y E. Las imágenes del análisis de Maldi MS revelaron una disminución general en el contenido de lípidos en el cerebro mutante knockout LPR1. Las secciones representativas del cerebro de mosca adulta teñidas de H y E se muestran aquí.Las especies lipídicas, sus respectivos valores MZ y las escalas del mapa de calor también se indican en esta imagen. El pliegue promedio de reducción en el mutante knockout LPR1 en comparación con los controles de al menos cuatro réplicas biológicas, se muestran como números junto a las flechas. El espectro de masas de la región OCT en blanco seleccionada en la región del tejido cerebral tanto de las moscas de control como de las moscas mutantes se muestra en el rango de MZ1 a 1000 y MZ520 a 900.La interferencia de OCT está asociada tanto con fenómenos de supresión de iones como con problemas de señal superpuestos. Para mantener la fidelidad de los datos lipidómicos, la preparación adecuada de la muestra, la disección y la criosección son cruciales. Después de realizar el experimento Maldi, las identidades de los lípidos se pueden verificar a través de LCMS, también conocido como cromatografía líquida, espectrometría de masas basada en lipodómica.Esta técnica obtiene información molecular sobre la homeostasis de los lípidos cerebrales mediante el uso del poderoso sistema de modelo suave que allana el camino para comprender los cambios metabólicos relacionados con las enfermedades humanas en el cerebro.

Research

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