Het protocol presenteert Drosophila-modellen waarbij de hartfunctie kan worden gekarakteriseerd en gecontroleerd met behulp van licht. Dit stelt onderzoekers in staat om menselijke hartziekten in Drosophila te bestuderen met behulp van intacte dieren. Deze methode kan op betrouwbare wijze niet-invasieve OCT-beeldvorming en optogenetische controle van de Drosophila-hartfunctie bereiken.
Het heeft een hoge efficiëntie en kwaliteit. Optogenetische pacing kan mogelijk een alternatief zijn voor elektrische pacing als therapie om aritmische aandoeningen te behandelen. OCT-beeldvorming en optogenetische pacing kunnen worden uitgebreid naar andere modelsystemen zoals hartorganoïden, zebravissen en embryonale keel en hart.
Om te beginnen, combineer vijf hand GAL4 over TM6 double-tubby virgin vrouw en twee tot drie mannelijke vliegen van UAS Ops en Stocks per flacon. Bereid de volgende dag semi-gedefinieerd voedsel volgens de instructies van het Bloomington Drosophila Stock Center door 5,14 gram per 100 milliliter sucrose toe te voegen aan een container op een hete plaat. Koel het vervolgens af tot 60 graden Celsius met constant roeren.
Bereid vervolgens smalle injectieflacons door 50 microliter 100 millimolaire all-trans retinale ethanoloplossing aan elke injectieflacon toe te voegen. Gebruik een serologische pipet om vijf milliliter vliegenvoer per smalle vlieg te verwijderen. Nadat u gedurende 10 seconden op maximale snelheid hebt gevortexeerd, sluit u deze injectieflacons aan en wikkelt u ze in de donkere stof om ze tegen licht te beschermen.
Breng de volgende dag de vliegen gestaag eieren over naar de injectieflacons met all-trans retinale ethanol die voedsel bevat. Bescherm de rekken met injectieflacons tegen licht. Na 24 tot 48 uur, afhankelijk van het aantal gelegde eieren, gooit u de ouders weg om overbevolking van de injectieflacon te voorkomen.
Verzamel vervolgens niet-tubby-nakomelingen voor beeldvorming van het hart. Kies UAS-optie hand GAL4-larve of pop uit de injectieflacon, leg deze op een tissue en veeg de media voorzichtig van het lichaamsoppervlak af met een verfkwast. Bereid de microscoopglaasje voor met een klein stukje dubbelzijdige tape in het midden.
Plaats vervolgens de larve of pop voorzichtig op het tapeoppervlak met de dorsale kant naar boven en loodrecht op de lange kant van de dia met behulp van een borstel of een fijn pincet. Oefen zachte druk uit om de larve of pop aan het oppervlak van de tape te bevestigen. Stel nu de dia in op het beeldvormingsstadium met de larve of pop naar beneden gericht en schakel de optische coherentietomografie of OCT-lichtbron in via laserbesturingssoftware.
Open de aangepaste spectrale domein OCT-besturingssoftware. Klik vervolgens op het voorbeeldvenster. Stel vervolgens de scanparameters in de OCT-software voor spectraal domein in.
Gebruik micromanipulatoren om de monsterfase te regelen om het vliegenhart in beeld te brengen. Pas de brandpuntspositie aan om de lichtreflectie van het oppervlak van de vliegenriem te minimaliseren. Overweeg ook om minerale olie op het larve- of popoppervlak aan te brengen om reflectie te minimaliseren.
Stel vervolgens de scanparameters in voor M-modus OCT-beeldacquisitie en verkrijg vijf sets besturingsgegevens zonder roodlichtstimulatiepulsen om de hartslag in rust te berekenen. Ontwerp de lichtpuls voor de pacingstimulatie in de aangepaste OCT-besturingssoftware. Klik hiervoor op de tabbladen instellingen en voeg de ontworpen lichtpulssequenties toe om de pulsfrequentie, pulsbreedte, stimulatieduur en wachttijd volgens verschillende stimulatieprotocollen te regelen.
Open vervolgens de lichtcontrollersoftware om roodlichtpulsen te genereren. Kies de pulsmodus in modusselectie. Dubbelklik op de afbeelding voor de instellingen van het pulsprofiel en kies de volgermodus.
Houd de uit-intensiteit op nul en stel het intensiteitspercentage in bij het berekenen van de werkelijke vermogensdichtheid. Verkrijg M-modus video's van het kloppende Drosophila hart met lichtstimulatie door te klikken op Verwerven in de OCT Control software. Registreer flitsen van rood licht langs het vlieghart tijdens beeldvormingsacquisitie.
Merk op dat verschillende pacing-instellingen vereist zijn om de vlieghartfunctie te regelen met rood verschoven channelrhodopsine en NPHR-vliegmodellen. Open de op maat ontwikkelde vlieghartsegmentatiesoftware en klik op selecteerbestand. Selecteer vervolgens het bestand dat moet worden geanalyseerd in de grafische gebruikersinterface.
Voer zowel de verticale als de horizontale grenzen van het hartgebied in pixels in de bovenste tekstvakken in. Klik op formaat wijzigen. Zorg er met behulp van de schuifregelaar aan de onderkant voor dat het hele hartgebied zichtbaar is en dat het de hele doos voor de hele verzameling vult.
Nadat u op het tabblad Voorspellen hebt geklikt, doorloopt het programma elk segment in de verzameling en selecteert het hartgebied in ongeveer drie minuten. Zodra de voorspelling is voltooid, klikt u op de HR-plot om een plot van het hartgebied in de loop van de tijd in een nieuw venster weer te geven. Selecteer de juiste piek- of dalgebieden, kies de puls en vervolgens hr-tabbladen om een definitief cijfer te genereren.
De functionele parameters worden tegelijkertijd opgeslagen in de CSV-bestanden. De weefselspecificiteit van de hand GAL4 driver werd geverifieerd door beeldvorming van groene fluorescerende eiwitexpressie. De typische OCT-beelden van larvale en poplichaamdoorsnede worden hier getoond.
Om verschillende hartaandoeningen na te bootsen, werden vier soorten lichtpulsen ontworpen. Een enkele puls die 10 seconden duurde na vijf seconden wachttijd, genereerde een herstelbare hartstilstand. Voor de hartslagpacing bij frequenties lager dan de rusthartslag werden twee lichtpulssequenties gebruikt met pacingfrequenties gelijk aan de helft van de rusthartslag en een vierde van de rusthartslag van acht seconden met een wachttijd van zes seconden ertussen.
Het stimulatiepatroon om de hartslag te verhogen als gevolg van rood verschoven channelrhodopsine-activering bestond uit drie reeksen lichtpulsen. De verminderde hartcontractiefrequentie na de lichtsignalen resulteerde in een langzamere hartslag die nabootst in larven en poppen. Een reeks van drie lichtpulstreinen met verschillende stimulatiefrequenties werd toegepast op larven en poppenharten vertoonden duidelijk een verhoogde hartslag na de lichtpulsen.
De voorbereiding van de juiste nakomelingen, de montage van het monster en de beeldvormingsprocedure zijn essentieel. We hopen de optogenetische pacingtechnologie over te brengen naar grotere diermodellen, hartziekten van zoogdieren te bestuderen en nieuwe therapeutische benaderingen voor de behandeling van aritmie te verkennen.
