2.0K Views
•
08:45 min
•
April 21st, 2022
DOI :
April 21st, 2022
•0:05
Introduction
1:01
Isolation of a Single Neuron
3:16
Cell Lysis and RNA Digestion for SNRMA-MS
4:29
Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
6:15
Results: Characterization of Numerous RNA Modifications in Single Neurons
8:08
Conclusion
Transcript
Med denne protokol introducerede vi den første metode, der er i stand til samtidig profilering af flere RNA-modifikationer i enkelte neuroner, hvilket åbner nye undersøgelsesområder, der involverer post-transkriptionel regulering i individuelle celler. Ved at udnytte optimerede prøveforberedelsesbetingelser og væskekromatografi tandemmassespektrometri kan over et dusin modificerede nukleosider detekteres og kvantificeres i en enkelt neuron pr. Eksperiment. Individuelle celler er forskellige med hensyn til deres funktioner, morfologi og deres kemiske profiler.
Det er vigtigt, at vi er i stand til at måle den komplette kemiske mosaik af disse celler, herunder deres RNA-profiler, for nok celler til at forstå deres forskelle, både i sundhed og i sygdom. Omfanget af ganglierforberedelse før enkelt neuronisolering afhænger af præferencerne hos den person, der udfører isolationen. Forsøg både længere og kortere proteasebehandlinger for at identificere egnede tilstande.
Til at begynde med skal du placere den bedøvede Aplysia californica ventrale side opad i en dissekeringsbakke. Begynd at dissekere det ved hjælp af kirurgisk saks med en stump spids placeret mod dyret og lav forsigtigt et langsgående snit gennem foden. Efter at have fastgjort de rostrale, kaudale og laterale sider af dyrekroppen for at udsætte de indre organer og centralnervesystemets ganglier i kropshulen, skal du isolere de store centralnervesystemganglier fra dyret ved kirurgisk at afskære nerver og nogle forbindelser, der stammer fra ganglierne.
Nedsænk ganglierne i 10 milligram pr. milliliter protease type XIV opløsning fra Streptomyces griseus og inkuberes i 30 minutter til en time ved 34 grader Celsius. Skyl derefter ganglierne seks gange med kunstig havvandsantibiotisk opløsning. Brug derefter en polypropylenoverførselspipette, der er skåret til en åbning på fem millimeter, overfør alle ganglier til en silikonepolymerbelagt skål fyldt med den kunstige havvandsantibiotiske opløsning.
Hold ganglierne altid nedsænket i kunstigt havvand. Dernæst for at fjerne ganglionskederne, skal du fastgøre ganglierne og bruge mikrosakser og fine tang. Med tilstrækkelig stærk enzymatisk behandling skal du bruge glas- eller metalnåle til unsheathing.
Visuelt identificere neuroner af interesse. Brug en poolet glaskapillær eller skarpe wolframnåle til forsigtigt at isolere den identificerede celle fra bulkganglion. Efter at have trukket ca. en mikroliter kunstigt havvand ind i en plastmikropipette, overføres den isolerede celle til et PCR-prøverør indeholdende fire mikroliter 0,365 molær ammoniumacetat.
Til blanke målinger opsamles fem mikroliter aliquoter af den kunstige havvandsantibiotiske opløsning fra skålen indeholdende ganglion og blandes med fordøjelsesbufferen. Lyse de isolerede neuroner ved gentagen aspiration og dispensere med en mikropipette i 0,365 molær ammoniumacetat. Nogle celler kan ikke straks briste.
For at lyse dem skal du lægge tryk over cellens diameter med en poolet glaskapillær. Derefter opvarmes prøven i en termisk cyklus, inden der tilsættes 3.375 mikroliter RNA-fordøjelsesbuffer til prøven. Bland denne opløsning ved hjælp af en mikropipette ved at trække og dispensere opløsningen flere gange.
Spin ned eventuelle flydende dråber, der klamrer sig til væggene i PCR-røret ved hjælp af en miniature bordplade centrifuge. Derefter inkuberes prøverne i den termiske cyklus ved 37 grader Celsius i tre timer efterfulgt af et hold ved 10 grader Celsius med det opvarmede låg indstillet til On.Når prøverne er afkølet, skal du straks overføre syv mikroliter af opløsningen til et autosampler hætteglas udstyret med en 250 mikroliterindsats uden bobledannelse i autosamplerrøret. For at forberede væskekromatografisystemet til adskillelse af de kanoniske og modificerede nukleosider skal der kalibreres en C18-søjle ved hjælp af 99% mobil fase A og 1% mobil fase B med en strømningshastighed på 0,2 ml pr. Minut i 12 minutter ved 36 grader Celsius.
Massespektrometriinstrumentet betjenes i positiv tilstand med omledningsventilen indstillet til at gå til spilde i de første to minutters analyse og til kilde i resten af kørslen. Saml derefter massespektre over et m / z-interval på 110 til 600. Vælg ioner til kollisionsinduceret dissociation ved 35 til 40 elektronvolt over en tre sekunders cyklustid ved hjælp af en foretrukken masseliste konstrueret fra databasen og et isolationsvindue på 0,5.
Brug aktiv udelukkelse til at udelukke ioner fra fragmentering efter tre spektre. Indstil dynamisk MS/MS-spektreopsamling for ioner med intensiteter over og under 50.000 tæller ved henholdsvis fire Hertz og en Hertz. Og en minimumstærskel for ionvalg ved 1.990 tæller.
Til kvantitativ enkeltneuron RNA-modifikationsanalyse ved massespektrometri konstrueres kalibreringskurver ved hjælp af et ekstraheret ionkromatogram peak-områder opnået for modificerede nukleosidstandarder ved mindst fem koncentrationer for at muliggøre interpolation af ukendte endogene analytkoncentrationer. Enkelt neuron RNA modifikation analyse ved massespektrometri involverer manuel isolering af identificerede neuroner i små prøvevolumener til lysis fordøjelse og LC-MS / MS analyse. Enkelt neuron RNA-modifikationsanalyse ved massespektrometri detekterede rutinemæssigt over et dusin RNA-modifikationer i enkelte neuroner fra centralnervesystemet i Aplysia californica, der repræsenterer dækning af næsten halvdelen af det kendte epitranscriptom af dette dyr i en enkelt celle.
Resultaterne afslørede for første gang, at RNA-modifikationsprofiler af enkeltceller kunne afvige fra bulkceller i samme væv. Yderligere understøttelse af unikke modificerede nukleosidmønstre blev opnået fra en separat kohorte af dyr, hvor parvise sammenligninger blev udført for 13 RNA-modifikationer, der almindeligvis blev påvist i både enkeltneuroner og bulkvæv. RNA-modifikationer i funktionelt forskellige celler dannede unikke klynger i scoreplottet, mens homologe R2 / LPl1-neuroner co-grupperede.
Belastningsdiagrammet viser, at forskellene primært skyldtes forekomsten af positionelle isomerer af methyladenosin, herunder 2'O-methyladenosin og N1-methyladenosin. Eksterne kalibreringskurver blev genereret for N1-methyladenosin, pseudouridin, 2'O-methylguanosin, 2'O-methyladenosin og N6-dimethyladenosin. Og mængden af hvert modificeret nukleosid i metacerebralcellerne og R2 / LPl1-celleparrene blev bestemt ved interpolation.
Sørg for, at et minimum af kunstigt havvand overføres til PCR-røret sammen med den enkelte isolerede neuron. Dette minimerer prøvefortynding, hvilket i sidste ende påvirker analytdetektion. Denne protokol kan bruges til at undersøge distributioner af RNA-modifikationer i subcellulære strukturer, som axoner og dendritter, for at forbedre forståelsen af mekanismerne for aktivitetsafhængig lokal translation.
Post-transkriptionelle modifikationer af RNA repræsenterer et understuderet lag af translationsregulering, der for nylig er blevet forbundet med centralnervesystemets plasticitet. Her beskrives prøveforberedelse og væskekromatografi-tandem massespektrometri tilgang til samtidig karakterisering af talrige RNA-modifikationer i enkelte neuroner.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved