2.0K Views
•
08:45 min
•
April 21st, 2022
DOI :
April 21st, 2022
•0:05
Introduction
1:01
Isolation of a Single Neuron
3:16
Cell Lysis and RNA Digestion for SNRMA-MS
4:29
Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
6:15
Results: Characterization of Numerous RNA Modifications in Single Neurons
8:08
Conclusion
Transcript
Med denne protokollen introduserte vi den første metoden som samtidig kunne profilere flere RNA-modifikasjoner i enkle nevroner, og åpnet nye undersøkelsesområder som involverer posttranskripsjonsregulering i individuelle celler. Ved å utnytte optimaliserte prøveprepareringsforhold og flytende kromatografi tandem massespektrometri, kan over et dusin modifiserte nukleosider oppdages og kvantifiseres i et enkelt nevron per eksperiment. Individuelle celler er forskjellige når det gjelder deres funksjoner, morfologi og deres kjemiske profiler.
Det er viktig at vi er i stand til å måle den komplette kjemiske mosaikken til disse cellene, inkludert deres RNA-profiler, for nok celler til å forstå deres forskjeller, både i helse og i sykdom. Omfanget av gangliapreparat før enkel nevronisolasjon avhenger av individets preferanser som utfører isolasjonen. Forsøk både lengre og kortere protease behandlinger for å identifisere egnede forhold.
Til å begynne med, plasser den bedøvede Aplysia californica ventrale siden opp i en dissekeringsbrett. Begynn å dissekere den ved hjelp av kirurgisk saks med en stump spiss plassert mot dyret og forsiktig lage et langsgående kutt gjennom foten. Etter å ha festet rostral-, kaudale og laterale sider av dyrekroppen for å eksponere de indre organene og sentralnervesystemet ganglia i kroppshulen, isolerer de store sentralnervesystemet ganglia fra dyret ved kirurgisk å kutte nerver og noen bindemidler som stammer fra ganglia.
Fordyp ganglia i 10 milligram per milliliter protease type XIV-løsning fra Streptomyces griseus og inkuber i 30 minutter til en time ved 34 grader Celsius. Skyll deretter ganglia seks ganger med kunstig sjøvannsantibiotisk løsning. Deretter bruker du en polypropylenoverføringspipette som er kuttet til en åpning på fem millimeter, overfør alle ganglia til en silikonpolymerbelagt tallerken fylt med den kunstige sjøvannsantibiotiske løsningen.
Hold ganglia alltid nedsenket i kunstig sjøvann. Deretter, for å fjerne ganglionhylsene, fest ganglia og bruk mikroscissorer og fine tang. Med tilstrekkelig sterk enzymatisk behandling, bruk glass- eller metallnåler for unsheathing.
Identifiser visuelt nevronene av interesse. Bruk en samlet glasskapillær eller skarpe wolframnåler, og isoler forsiktig den identifiserte cellen fra bulk ganglion. Etter å ha tegnet omtrent en mikroliter kunstig sjøvann inn i en mikropipette i plast, overfør den isolerte cellen til et PCR-prøverør som inneholder fire mikroliter 0,365 molar ammoniumacetat.
For blanke målinger, samle fem mikroliter aliquots av kunstig sjøvann antibiotika løsning fra parabolen som inneholder ganglion og bland med fordøyelsesbufferen. Lyse de isolerte nevronene ved gjentatt aspirasjon og dispensering med en mikropipette i 0,365 molar ammoniumacetat. Noen celler kan ikke umiddelbart briste.
For å lyse dem, bruk trykk over diameteren på cellen med en samlet glasskapillær. Deretter oppvarmer du prøven i en termisk syklus før du legger til 3,375 mikroliter RNA-fordøyelsesbuffer i prøven. Bland denne løsningen ved hjelp av en mikropipette ved å trekke ut og dispensere løsningen flere ganger.
Spinn ned eventuelle flytende dråper som klamrer seg til veggene i PCR-røret ved hjelp av en miniatyr benk topp sentrifuge. Inkuber deretter prøvene i termisk syklus ved 37 grader Celsius i tre timer, etterfulgt av et hold på 10 grader Celsius med det oppvarmede lokket satt til På.Når prøvene er avkjølt, overfør umiddelbart syv mikroliter av løsningen til et autosampler hetteglass utstyrt med en 250 mikroliterinnsats uten bobledannelse i autosamplerrøret. For å forberede væskekromatografisystemet for separasjon av de kanoniske og modifiserte nukleosidene, likevekt en C18-kolonne ved hjelp av 99% mobil fase A og 1% mobil fase B med en strømningshastighet på 0,2 milliliter per minutt i 12 minutter ved 36 grader Celsius.
Bruk massespektrometriinstrumentet i positiv modus med avlederventilen satt til avfall de to første minuttene av analysen og til kilde for resten av løpet. Samle deretter massespektra over et m / z-område på 110 til 600. Velg ioner for kollisjonsindusert dissosiasjon ved 35 til 40 elektronvolt over en tre sekunders syklustid ved hjelp av en foretrukket masseliste konstruert fra databasen og et isolasjonsvindu på 0,5.
Bruk aktiv ekskludering for å utelukke ioner fra fragmentering etter tre spektra. Sett dynamisk MS/MS spektra oppkjøp for ioner med intensiteter over og under 50,000 teller på fire Hertz og en Hertz, henholdsvis. Og en minimumsterskel for ionvalg ved 1990 teller.
For kvantitativ enkelt neuron RNA modifikasjon analyse av masse spektrometri, konstruere kalibrering kurver ved hjelp av en ekstrahert ion kromatogram topp områder oppnådd for modifiserte nukleoside standarder på minst fem konsentrasjoner for å tillate interpolering av ukjente endogene analytt konsentrasjoner. Enkel neuron RNA modifikasjon analyse ved masse spektrometri innebærer manuell isolering av identifiserte nevroner i små prøvevolumer for lysis fordøyelse og LC-MS / MS analyse. Enkel neuron RNA modifikasjon analyse av massespektrometri rutinemessig oppdaget over et dusin RNA modifikasjoner i enkelt nevroner fra sentralnervesystemet aplysia californica representerer dekning av nesten halvparten av den kjente epitranscriptom av dette dyret i en enkelt celle.
Resultatene viste for første gang at RNA-modifikasjonsprofiler av enkeltceller kunne avvike fra bulkceller i samme vev. Ytterligere støtte for unike modifiserte nukleoside mønstre ble hentet fra en egen kohort av dyr der parvis sammenligninger ble utført for 13 RNA modifikasjoner, ofte oppdaget i både enkelt nevroner og bulk vev. RNA modifikasjoner i funksjonelt forskjellige celler dannet unike klynger i score plott mens homologe R2 / LPl1 nevroner co-clustered.
Lasteplottet viser at forskjellene først og fremst var drevet av overflod av posisjons isomerer av metyladenosin, inkludert 2'O-metyladenosinog og N1-metyladenosin. Eksterne kalibreringskurver ble generert for N1-metyladenosin, pseudouridin, 2'O-metylguanosin, 2'O-metyladenosin og N6-dimetyladenosin. Og mengden av hver modifisert kjerneside i metacerebralcellene og R2 / LPl1 cellepar ble bestemt av interpolering.
Sørg for at et minimumsvolum av kunstig sjøvann overføres til PCR-røret sammen med den enkle isolerte nevronen. Dette minimerer prøvefortynning, noe som til slutt påvirker analyttdeteksjon. Denne protokollen kan brukes til å undersøke distribusjoner av RNA-modifikasjoner i subcellulære strukturer, som axoner og dendritter, for å forbedre forståelsen av mekanismene for aktivitetsavhengig lokal oversettelse.
Posttranskripsjonelle modifikasjoner av RNA representerer et undervurdert lag av oversettelsesregulering som nylig har vært knyttet til plastisitet i sentralnervesystemet. Her er prøvepreparering og flytende kromatografi-tandem massespektrometri tilnærming beskrevet for samtidig karakterisering av mange RNA-modifikasjoner i enkelte nevroner.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved