このプロトコルは、抗並列架橋剤MAP65を使用して微小管タクトイドの自発的な自己組織化を可能にする。このシステムは、微小管組織や有糸分裂紡錘体のような生物学的システムを理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、微小管の紡錘形のような形状を再現できる最小限のシステムであり、再現性が高く、多くのラボがアクセス可能であることです。
この方法は、セルラー系に適用できるだけでなく、メソスケールの液晶研究のモデルとしても機能します。チューブリンを調製するには、まずマイナス80°Cの冷凍庫から凍結乾燥チューブリン1ミリグラムを含む標識されていないチューブリンのアリコートを取り出し、氷上に保管する。次に、200マイクロリットルの冷たいPEM-80を加える。
すべての凍結乾燥剤を溶解するには、チューブを氷上に10分間保ちます。次に、マイナス80°Cの冷凍庫から凍結乾燥チューブリン粉末20マイクログラムを含むローダミン標識チューブリンのチューブを取り出し、氷上に保管する。次に、4マイクロリットルの冷たいPEM-80を加え、チューブを氷上に10分間保ち、すべての凍結乾燥物を溶解する。
凍結乾燥チューブリンが溶解したら、再懸濁された非標識チューブリン溶液を100マイクロリットルのローダミン標識チューブリン溶液に加える。次いで、溶液を6〜7回非常にゆっくりと配管して混合する。残りの100マイクロリットルの標識されていないチューブリン溶液を保存するには、まずチューブを液体窒素に挿入して溶液を凍結し、次にチューブをマイナス80°Cに保ちます。
次に、チューブリンミックスを7つの新しいチューブに分配し、それぞれに15マイクロリットルを加えます。前述のようにチューブを液体窒素で凍結し、将来の使用のためにマイナス80°Cで保管してください。実験を行うためのフローチャンバを組み立てるには、まずスライドガラスを二重蒸留水で洗浄し、糸くずのない実験室用ワイプで乾燥させます。
次に、最初にエタノールでスライドを洗浄し、続いて二重蒸留水で洗浄します。流路を作成するには、長さ40~50mmの両面テープを切り取ります。次に、それを間に分割して2つの薄いテープストリップを作成し、2つのストリップを5〜8ミリメートル離してスライドの上に置きます。
次に、シラン処理されたカバースリップを流路の上に置きます。次に、スライドとカバーを密封し、ペンの裏側でテープ領域を軽く押して両面テープストリップを滑らせます。シールがうまく作られていれば、テープは半透明から透明に変わるはずです。
端の余分なテープを取り外すには、フローチャンバの入り口からわずか1ミリメートルを残して、カミソリの刃でテープを切断します。次いで、タクトイド実験を行うための適切な実験パラメータでチャンバーにラベルを付け、まず、氷上で必要な試薬をすべて解凍し、作業中に氷上に保存する。次に、PEM-80に溶解した20マイクロリットルの5%非イオン性ブロックコポリマー界面活性剤でフローチャンバをコーティングし、チャンバの両端に小さな滴を塗布して、内部に気泡が形成されないようにします。
その後、フローチャンバをペトリ皿製の湿気の多いチャンバに入れ、濡れた糸くずのない実験室用ワイプで少なくとも5〜7分間保管します。次に、PEM-80、GMPPCPP、プルロニックF-127、ジチオスレイトール、グルコース、ポリエチレングリコール、先に作製したチューブリンミックス、及びMAP65とGFP MAP65をピペッティングして滅菌チューブ内で可視化のために5~6回混合し、チューブを氷上に保った。次いで、グルコースオキシダーゼとカタラーゼの予備混合溶液をチューブリン-MAP混合物のチューブに1マイクロリットル加え、配管を7〜8回ずつ再度混合する。
溶液の全体積を2つの部分に分割して、別々のチャンバーで使用します。一方、フローチャンバに以前に添加された液体は、チューブリン-MAPミックスをフローチャンバに添加するとともに、チャンバのもう一方の端にある糸くずのない実験室ワイプを使用して、毛細管現象によって除去されなければならない。サンプルがチャンバー内に完全に入ったら、5分間のエポキシを使用してチャンバーの両端を密閉し、37°Cで約30分間保持して微小管タクトイドを核形成および成長させます。
蛍光顕微鏡によるタクトイドのイメージングには、蛍光で十分な光を集めるために、60倍以上の倍率で1.2以上の開口数を持つ対物レンズを使用してください。無料の金属酸化物半導体または電荷結合デバイスカメラで画像を記録します。サンプルを維持するには、摂氏 37 度に設定した環境チャンバーに保管してください。
あるいは、熱風ステージヒーターおよび循環温水を有する客観的温度制御カラーを含む他のステージヒーターをこの目的のために使用することができる。ローダミンチューブリンの正しい蛍光を得るためには適切な励起源が不可欠であるため、サンプルに少なくとも1ミリワットの電力を持つ561ナノメートルレーザーを使用して、高品質の画像を提供します。ただし、GFP MAP65 の場合は、励起源を 488 ナノメートルのレーザーに変更します。
広視野落射蛍光顕微鏡を使用する場合は、励起が540 12.5ナノメートル、ダイクロイックが545ナノメートル、カットオフが52.5ナノメートル、およびロングパスが575ナノメートルの発光を持つローダミンフィルターキューブを使用します。GFP MAPの場合は、励起が480 15ナノメートル、ダイクロイックが505ナノメートル、15ナノメートルがカットオフされ、発光が515ナノメートルのロングパスのGFPフィルターキューブを使用します。照明パワーと露光時間がカメラの強度スケールが飽和しないようにした後、異なる領域の少なくとも10枚の画像を撮影して、赤と緑の両方のチャンネルで100タクトイド以上を画像化し、分析のために16ビットTIFF画像として保存します。
このプロトコルを使用して、形成が30分以内に完了する微小管タクトイドを顕微鏡下で直接可視化することができる。タクトイドは、チューブリンチャネルの561ナノメートルレーザーとMAP65チャンネルの488ナノメートルレーザーの両方で見えます。画像も互いに完全に重なり合っています。
この方法では、タクトイドの長さと幅も測定することができた。タクトイドの強度プロファイルは、その幅によって変化することが判明した。さらに、微小管タクトイドの不動性は、フォトブリーチング後の蛍光回収またはFRAP実験によって実証されたが、フォトブリーチング後の蛍光の回収は示されなかった。
一方、FRAP実験はMAP65の可動性を明らかにし、そのために光退色後に徐々に回復し、蛍光を観察することができた。MAP65によるこの蛍光回収は、回復の振幅および時間スケールを見つけるために、上昇する指数関数的減衰に適合させることができる。タクトイド実験の部分は、チューブリンが氷上ですぐに悪くなる可能性があり、タクトイドの核生成に有害である可能性があるため、10〜12分以内に完了する必要があります。
異なる微小管架橋タンパク質と架橋モータータンパク質(微小管を動かすことができる酵素)との将来の研究は、有糸分裂紡錘体の自己組織化に関する新しい情報を明らかにし続けるでしょう。
