Name: lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)
Uploaded: 2022-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال المنح البحثية من جامعة الإمارات العربية المتحدة (UAEU) ، والمنحة رقم 31R170 (مركز زايد للعلوم الصحية) و # 12R010 (منحة جامعة الإمارات العربية المتحدة). نشكر البروفيسور راندال مورس (مركز وادزورث، ألباني، نيويورك) على مساعدتنا في تحرير المخطوطة من حيث الأسلوب والقواعد.
جميع البيانات متاحة عند الطلب.

1. نقل خلايا HEK293T باستخدام كاشف جزيرة الأمير إدوارد أو ليبوفيكتامين 3000
<ol><li>استزرع خلايا HEK293T في DMEM + 10٪ FBS + 1x البنسلين / الستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع جو من 5٪ CO 2 و 21٪ O2 حتى تصبح ملتقية بنسبة 90٪ قبل البذر للنقل. استخدم عددا منخفضا نسبيا من الخلايا لإنتاج ...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+Somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).</li><li>Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+and+gene+therapy.">Human embryonic stem cells and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).</li><li>Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+nonviral+gene+delivery+and+its+role+in+pluripotent+stem+cell+engineering.">Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).</li><li>Li, S. D., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+is+superior+to+viral+gene+delivery.">Nonviral is superior to viral gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).</li><li>Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery+systems:+From+simple+transfection+agents+to+artificial+viruses.">Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li><li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+human+embryonic+stem+cells:+Small+and+macromolecule+loading+and+DNA+transfection.">Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection.</a> Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).</li><li>Sukhorukov, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+high-intensity+field+pulses:+Strategies+for+improving+robustness+and+performance+of+electrotransfection+and+electrofusion.">Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion.</a> The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).</li><li>Floch, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+phosphonolipids+as+non+viral+vectors+for+DNA+transfection+in+hematopoietic+cell+lines+and+CD34++cells.">Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).</li><li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells.">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).</li><li>Siemen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).</li><li>Zhang, X., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+in+tissue+engineering.">Viral vectors for gene delivery in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).</li><li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors.">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li><li>Gropp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+genetic+modification+of+human+embryonic+stem+cells+by+lentiviral+vectors.">Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).</li><li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors.">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).</li><li>Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors.">Production of lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 3, 16017 (2016).</li><li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., G&#246;pferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+nonviral+gene+delivery+systems.">Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li><li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation+during+in-vitro+human+embryonic+cortical+neurogenesis.">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).</li><li>Weissinger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+in+purified+human+hematopoietic+peripheral-blood+stem+cells+by+means+of+electroporation+without+prestimulation.">Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+transgene+expression+to+antigen-presenting+cells+derived+from+lentivirus-transduced+engrafting+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Blood. 99 (2), 399-408 (2002).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells.">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).</li><li>Sweeney, N. P., Vink, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+lentiviral+vector+genome+size+and+producer+cell+genomic+to+gag-pol+mRNA+ratios+on+packaging+efficiency+and+titre.">The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 574-584 (2021).</li></ol>

القدرة على تعديل الخلايا الجذعية وراثيا لأغراض الدراسة أو السريرية محدودة من خلال التكنولوجيا والفهم الأساسي لبيولوجيا hESCs. التقنيات التي أظهرت إمكانات كبيرة في ESCs الفئران ، مثل lipofection و electroporation ، ليست فعالة للغاية بالنسبة ل hESCs ، والتي تشتهر بصعوبة توصيل الجينات بالطرق التقليدية<sup class="xr...

الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) المشتقة من كتلة الخلايا الداخلية للكيسة الأريمية متعددة القدرات ويمكن تمييزها إلى أنواع مختلفة من الخلايا اعتمادا على العوامل الخارجية في ظل ظروف المختبر 1,2. من أجل تسخير إمكانات hESCs بشكل كامل ، من الضروري أن يكون لديك طرق سريعة وموثوقة لتوصيل الجينات لهذه الخلايا. تقليديا ، يمكن تصنيف التقنيات المستخدمة على نطاق واسع إلى نوعين: أنظمة توصيل الجينات غير الفيروسية والفيروسية 3,4. أنظمة توصيل الجينات غير الفيروسية الأكثر استخداما هي lipofection و electroporation و nucleofection. تعد أنظمة التوصيل غير الفيروسية مفيدة بسبب عدد أقل من طفرات الإدخال وانخفاض إجمالي في المناعة 5,6. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق تؤدي إلى انخفاض كفاءة النقل ومدة قصيرة من التعبير الجيني العابر ، وهو قيد رئيسي لدراسات التمايز طويلة الأجل7. يؤدي النقل الكهربائي إلى تحسين كفاءة النقل مقارنة ب lipofection. ومع ذلك ، فإنه يؤدي إلى أكثر من 50 ٪ من موت الخلايا8،9،10. باستخدام nucleofection ، يمكن تحسين بقاء الخلية وكفاءة النقل من خلال الجمع بين lipofection و electroporation ، ولكن النهج يحتاج إلى مخازن مؤقتة خاصة بالخلايا ومعدات متخصصة ، وبالتالي ، يصبح مكلفا للغاية للتطبيقات الموسعة11,12.
وعلى النقيض من ذلك، أظهرت النواقل الفيروسية تحسنا في كفاءة نقل العدوى، فضلا عن انخفاض السمية الخلوية عموما، بعد النقل. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعبير عن الجينات التي يتم تسليمها بثبات ، وبالتالي ، تجعل هذه الطريقة مثالية للدراسات طويلة الأجل13. من بين النواقل الفيروسية الأكثر استخداما لتوصيل الجينات إلى hESCs هي ناقلات الفيروسات الليفية (LVS) ، والتي يمكن أن تعطي أكثر من 80٪ من كفاءة النقل باستخدام جزيئات فيروسية عالية العيار14,15. يعد Lipofection و CaPO4 هطول الأمطار من بين الطرق الأكثر استخداما لنقل خلايا HEK293T أو مشتقاتها بشكل عابر مع ناقلات نقل الجينات جنبا إلى جنب مع بلازميدات التعبئة والتغليف لإنتاج جزيئات فيروسية16. على الرغم من أن lipofection يؤدي إلى كفاءة نقل جيدة وسمية خلوية منخفضة ، إلا أن هذه التقنية تعوقها تكلفتها ، وسيكون التوسع للحصول على جزيئات عالية العيار lentiviral مكلفا للغاية. ينتج عن هطول الأمطار CaPO4 كفاءة نقل مماثلة نسبيا لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام lipofection. على الرغم من فعالية التكلفة ، إلا أن هطول الأمطار CaPO4 يؤدي إلى موت كبير للخلايا بعد عمليات النقل ، مما يجعل من الصعب توحيد وتجنب الاختلافات من دفعة إلى دفعة17. في هذا السيناريو ، يعد تطوير طريقة تعطي كفاءة نقل عالية ، وسمية خلوية منخفضة ، وفعالية من حيث التكلفة أمرا بالغ الأهمية لإنتاج جزيئات عالية التيتر lentiviral لاستخدامها في hESCs.
البولي إيثيلينيمين (PEI) هو بوليمر كاتيوني يمكنه نقل خلايا HEK293T بكفاءة عالية دون الكثير من السمية الخلوية وله تكلفة ضئيلة مقارنة بالطرق القائمة على lipofection18. في هذه الحالة ، يمكن استخدام جزيرة برنس إدوارد للتطبيقات الموسعة لإنتاج LVS عالي العيار من خلال تركيز جزيئات lentiviral من supernatants المستنبتة باستخدام تقنيات مختلفة. تصف المقالة المقدمة استخدام جزيرة برنس إدوارد لنقل خلايا HEK293T وتركيز ناقلات الفيروسات الوعائية باستخدام الطرد المركزي الفائق من خلال وسادة السكروز. باستخدام هذه الطريقة ، نحصل بانتظام على عيارات أعلى بكثير من 5 × 107 وحدة دولية / مل مع اختلافات منخفضة من دفعة إلى دفعة. هذه الطريقة بسيطة ومباشرة وفعالة من حيث التكلفة للتطبيقات الموسعة لتوصيل الجينات إلى hESCs والخلايا المشتقة من hESCs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C14292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF Recombinant human</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin FRAC V</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Nutrient mix F12&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o: Ca and Mg</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovie serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2118S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Glutamine, 100X&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2924190090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH Polyclonal antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>15707-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH shRNA</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td></td>
			<td>Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR1 complete media</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium 1X CTS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1371201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 2 Supplement 100x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 27 Supplement 50x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-07200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin SOL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLKO.1 TRC vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLL3.7 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene infection reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR1003- G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2.0</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4551/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 
			dihydrochloride&#160;</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin .05% EDTA&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV 939</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3748/10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)

يصف البروتوكول الحالي استخدام الجسيمات الفيروسية اللينتيفيروسية لتوصيل الحمض النووي الريبي قصير الدبوس الشعري (shRNAs) إلى كل من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وكذلك الخلايا السلفية العصبية (NPCs) المشتقة من hESCs بكفاءة عالية. تم توليد جزيئات الفيروس العاصف عن طريق النقل المشترك لخلايا HEK293T باستخدام ناقلات الدخول (التي تحمل shRNAs) جنبا إلى جنب مع بلازميدات التعبئة والتغليف (pAX و pMD2.G) باستخدام بوليمر البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة بولي إيثيلينيمين (PEI). وتركزت الجسيمات الفيروسية باستخدام الطرد المركزي الفائق، مما أدى إلى متوسط عيارات أعلى من 5 × 107. يمكن أن تصاب كل من hESCs و NPCs بكفاءة عالية باستخدام هذه الجسيمات الفيروسية ، كما هو موضح في اختيار puromycin والتعبير المستقر في hESCs ، وكذلك تعبير GFP العابر في NPCs. علاوة على ذلك ، أظهر تحليل اللطخة الغربية انخفاضا كبيرا في التعبير عن الجينات التي تستهدفها shRNAs. بالإضافة إلى ذلك ، احتفظت الخلايا بتعدد قدراتها وكذلك إمكانات التمايز ، كما يتضح من تمايزها اللاحق إلى سلالات مختلفة من الجهاز العصبي المركزي. ويتناول البروتوكول الحالي تسليم الحمض النووي الريبوزي المرسال؛ ومع ذلك ، يمكن استخدام نفس النهج للتعبير خارج الرحم عن cDNAs لدراسات التعبير المفرط.

بعد نقل الجينات ، هناك حاجة حتمية إلى جدوى عالية من hESCs. على الرغم من الجهود المبذولة وتحسين البروتوكولات للحد من موت الخلايا بعد الكهربية من hESCs ، لا يزال أكثر من 50 ٪ من موت الخلايا يلاحظ بعد الكهربية لهذه الخلايا ، جنبا إلى جنب مع انخفاض كفاءة النقل20. لا يؤدي نقل الجينات بوساطة...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI at JoVE.com

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI

باستخدام البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة بولي إيثيلينيمين (PEI) ، أنتجنا جزيئات فيروسية لينتيفيروسية للتعبير المستقر عن shRNAs في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية H9 (hESCs) والخلايا السلفية العصبية المشتقة من H9 (NPCs) بكفاءة عالية.

تسليم الحمض النووي الريبوزي المرسال بوساطة فيروسية إلى hESCs و NPCs باستخدام بولي إيثيلينيمين البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة (PEI)

The current protocol describes the use of lentiviral particles for the delivery of short hairpin RNAs (shRNAs) to both human embryonic stem cells (hESCs) ...

يجب إجراء نقل الخلايا HEK293T عند التقاء 90٪. أيضا ، من الضروري استخدام مرشح ربط منخفض البروتين 0.45 ميكرون لترشيح ناقلات الفيروسات الخيطية واستخدام وسادة السكروز للطرد المركزي الفائق. ابدأ بزراعة خلايا HEK293T في وسط DMEM يحتوي على 10٪ FBS و 1X البنسلين الستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع جو من 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 21٪ من الأكسجين حتى تصل الخلايا إلى 90٪ من التقاء قبل البذر للنقل.البذور أربع مرات 10 إلى الخلايا الست في 10 ملليلتر من متوسط النمو الكامل في لوحة زراعة الأنسجة 100 ملم وتنمو بين عشية وضحاها في حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة مع جو من 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 21٪ من الأكسجين. لكل عملية نقل، قم بتخفيف ملليغرام واحد لكل ملليلتر من مخزون الحمض النووي البلازميدي في ملليلتر واحد من وسائط DMEM الخالية من المصل في أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 ملليلتر باتباع نسبة بلازميدات الدخول والتعبئة كما هو موضح في المخطوطة النصية. دوامة الأنبوب لمدة 10 ثوان وتدور في 10،000 مرات G لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لجمع.ثم ، أضف 70 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل محلول مخزون ملليلتر من بولي إيثيلين أمين البوليمر ، أو PEI ، إلى الأنبوب. مرة أخرى ، دوامة وتدور لفترة وجيزة الأنبوب. بالنسبة للنقل القائم على الليبوفيكتامين، قم بتخفيف المتجهات في 500 ميكرولتر من وسائط DMEM الخالية من المصل التي تحتوي على 45 ميكرولتر من الكاشف P المزود في المجموعة.ثم ، قم بتخفيف 70 ميكرولتر من الكاشف L باستخدام 500 ميكرولتر من نفس الوسط. احتضان كلا الأنبوبين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. ثم ، امزج محتويات كلا الأنبوبين واحتضنهما في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة للسماح بتكوين معقد.بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من الحمض النووي PEI أو مجمعات الحمض النووي lipofectamine إلى الصفيحة التي تحتوي على خلايا واحتضان لمدة ست ساعات عند 37 درجة مئوية مع جو من 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 21٪ من الأكسجين. بعد الحضانة ، استبدل الوسائط ب 10 ملليلتر من وسائط النمو الكاملة الجديدة وأعد اللوحة إلى الحاضنة. بعد يومين من النقل ، اجمع الوسائط المحتوية على الفيروس وتراكب الخلايا ب 10 ملليلتر من وسائط النمو الكاملة الطازجة.مرة أخرى ، بعد ثلاثة أيام من النقل ، قم بجمع الوسائط المحتوية على الفيروس ودمجها مع الوسائط التي تم جمعها في نقطة زمنية مدتها يومان. جهاز الطرد المركزي للغاز الخارق الفيروسي بسرعة 2000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لتكسير الحطام الخلوي. قم بتصفية المادة الفائقة باستخدام فلتر منخفض البروتين بحجم 0.45 ميكرون من حجم المسام وتخزينها عند أربع درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للطرد المركزي الفائق.قم بتعقيم أكواب أنابيب الطرد المركزي عن طريق الغسيل بنسبة 70٪ من الإيثانول لمدة 10 دقائق. تجف الأكواب في الهواء وتغلق وتوضع عند أربع درجات مئوية. أضف 36 ملليلتر في الوسائط المصفاة التي تحتوي على جزيئات فيروسية عدسية إلى أنبوب طرد مركزي فائق معقم.املأ خمسة ملليلترات من شريط معقم بأربعة ملليلترات من محلول السكروز المعقم بنسبة 20٪ المحضر في PBS وقم بتوزيعه على الجزء السفلي من الأنبوب الذي يحتوي على ناقلات فيروسية ، أو LVS. تأكد من عدم خلط محلول السكروز مع الوسائط ويجعل التدرج في الجزء السفلي من الأنبوب. قم بموازنة جميع أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفائقة باستخدام وسائط DMEM الخالية من المصل ، وضع الأنابيب في أكواب حمل أنبوب الطرد المركزي البارد ، وأغلق الأغطية.تدور الأنابيب عند 125،000 مرة G لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، تخلص بعناية من supernatant عن طريق عكس محتويات الأنبوب في حاوية تحتوي على التبييض دون إزعاج الكرية. ضع علامة على الكريات إذا كانت مرئية.ضع أنبوب الطرد المركزي الفائق في أنبوب معقم سعة 50 ملليلتر وأضف 200 ميكرولتر من DPBS المعقم في الجزء العلوي من الكرية. ضع الأنبوب عند أربع درجات مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، امزج بلطف محتوى الأنبوب عن طريق السحب لأعلى ولأسفل قبل الدوران بسرعة 13،000 مرة G في جهاز طرد مركزي على الطاولة لتكسير أي حطام.نقل supernatant إلى أنبوب جديد و aliquot إعداد الفيروس. أخيرا ، قم بتخزين الأنابيب عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر. بعد النقل ، لوحظ تعبير GFP وفير في خلايا HEK293T.أدى التعبير عن البروتينات الفيروسية إلى تكوين خلايا HEK293T حيث يتم دمج الخلايا المفردة. بعد الإصابة ، لوحظ أيضا تعبير ملحوظ عن GFP في الخلايا السلفية العصبية المصابة بالفيروسات. لم يظهر قياس عيار LVS بين كاشف PEI منخفض التكلفة وكاشف lipofectamine 3000 أي فرق كبير في العيار الفيروسي.يتم عرض العيار الفيروسي للناقلات القائمة على PLK 0.1 هنا. أظهرت الخلايا المنقولة بالفيروسية أكثر من 80٪ من صلاحية الخلايا مقارنة بالخلايا غير المحولة ، في حين لم تنجو أي خلايا من العلاج. أظهر تحليل اللطخة الغربية تعبيرا وفيرا عن نازعة هيدروجيناز L-2-hydroxyglutarate في الخلايا المنقولة بالعمود الفقري المتجه الفارغ.ومع ذلك ، لم يلاحظ أي تعبير في الخلايا المنقولة مع متجه يحمل الحمض النووي الريبي القصير دبوس الشعر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي استخدام البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة بولي إيثيلينيمين لإنتاج جزيئات lentiviral عن طريق المشاركة في نقل خلايا HEK293T باستخدام ناقلات الدخول والتعبئة.

Research

JoVE Journal

Biology

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI)

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

ووضع العلامات hESCs hMSCs مع أوكسيد الحديد النانوية لعدم الغازية في تعقب المجراة مع التصوير بالرنين المغناطيسي

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

من MEFs لMatrigel الأول : hESCs الركض في وجود MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

من MEFs إلى 2 Matrigel : hESCs من تقسيم MEFs على Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

من MEFs لMatrigel 3 : hESCs من الركض على Matrigel Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral بوساطة خلال ضربة قاضية السابقين فيفو تكون الكريات الحمر في الإنسان خلايا الجذعية المكونة للدم

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

جيل من صنع الإنسان من الخلايا الجذعية المحفزة الدموية المحيطية باستخدام Lentiviral STEMCCA المتجهات

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

إسكات طويلة الأجل من Intersectin-1S في الرئتين الماوس عن طريق المتكررة تسليم سيرنا محددة عبر الليبوزومات الموجبة. تقييم تأثيرات ضربة قاضية بواسطة المجهر الإلكتروني

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

باستخدام Coculture لكشف كيميائيا وساطة بين الأنواع التفاعلات

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

جيل من Myospheres من hESCs بواسطة إعادة برمجة جينية

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

تحليل Phosphopeptide من القوارض بربخي المني

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...