Name: lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)
Uploaded: 2022-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra De Forenede Arabiske Emiraters Universitet (UAEU), bevilling # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) og # 12R010 (UAEU-AUA-tilskud). Vi takker professor Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) for at hjælpe os med at redigere manuskriptet til stil og grammatik.
Alle data er tilgængelige efter anmodning.

1. Transfektion af HEK293T-celler ved hjælp af enten PEI- eller Lipofectamine 3000-reagens
<ol><li>Dyrkning HEK293T celler i DMEM + 10% FBS + 1x penicillin / streptomycin ved 37 ° C i en befugtet inkubator med en atmosfære på 5% CO2 og 21% O2 , indtil de er 90% sammenløb før såning til transfektion. Brug et relativt lavt antal celler til produktion af høj titervirus (ideelt set mindre end P30).</li>
	<li>Frø 4 x 106 celler i 10 ml komplet vækstmedium i en 100 ...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+Somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).</li><li>Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+and+gene+therapy.">Human embryonic stem cells and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).</li><li>Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+nonviral+gene+delivery+and+its+role+in+pluripotent+stem+cell+engineering.">Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).</li><li>Li, S. D., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+is+superior+to+viral+gene+delivery.">Nonviral is superior to viral gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).</li><li>Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery+systems:+From+simple+transfection+agents+to+artificial+viruses.">Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li><li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+human+embryonic+stem+cells:+Small+and+macromolecule+loading+and+DNA+transfection.">Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection.</a> Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).</li><li>Sukhorukov, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+high-intensity+field+pulses:+Strategies+for+improving+robustness+and+performance+of+electrotransfection+and+electrofusion.">Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion.</a> The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).</li><li>Floch, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+phosphonolipids+as+non+viral+vectors+for+DNA+transfection+in+hematopoietic+cell+lines+and+CD34++cells.">Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).</li><li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells.">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).</li><li>Siemen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).</li><li>Zhang, X., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+in+tissue+engineering.">Viral vectors for gene delivery in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).</li><li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors.">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li><li>Gropp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+genetic+modification+of+human+embryonic+stem+cells+by+lentiviral+vectors.">Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).</li><li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors.">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).</li><li>Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors.">Production of lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 3, 16017 (2016).</li><li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., G&#246;pferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+nonviral+gene+delivery+systems.">Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li><li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation+during+in-vitro+human+embryonic+cortical+neurogenesis.">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).</li><li>Weissinger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+in+purified+human+hematopoietic+peripheral-blood+stem+cells+by+means+of+electroporation+without+prestimulation.">Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+transgene+expression+to+antigen-presenting+cells+derived+from+lentivirus-transduced+engrafting+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Blood. 99 (2), 399-408 (2002).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells.">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).</li><li>Sweeney, N. P., Vink, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+lentiviral+vector+genome+size+and+producer+cell+genomic+to+gag-pol+mRNA+ratios+on+packaging+efficiency+and+titre.">The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 574-584 (2021).</li></ol>

Evnen til genetisk at modificere stamceller til undersøgelse eller kliniske formål er begrænset både af teknologi og den grundlæggende forståelse af hESC'ernes biologi. Teknikker, der har vist et betydeligt potentiale i mus-ESC'er, såsom fedtsugning og elektroporation, er ikke særlig effektive for hESC'er, som er notorisk vanskelige for genlevering ved konventionelle metoder20. Dette begreb har ikke kun ført til optimering af eksisterende teknikker, men også til udvikling af nye metoder ...

Humane embryonale stamceller (hESC'er) afledt af blastocystens indre cellemasse er pluripotente og kan differentieres i forskellige celletyper afhængigt af eksterne faktorer under in vitro-betingelser 1,2. For fuldt ud at udnytte potentialet i hESC'er er det bydende nødvendigt at have hurtige og pålidelige genleveringsmetoder til disse celler. Konventionelt kan de anvendte teknikker groft klassificeres i to typer: ikke-miljømæssige og virale genleveringssystemer 3,4. De mere hyppigt anvendte ikke-miljømæssige genleveringssystemer er fedtsugning, elektroporation og nukleofsektion. Ikke-miljømæssige leveringssystemer er fordelagtige på grund af færre indsættelsesmutationer og et generelt fald i immunogenicitet 5,6. Disse metoder resulterer imidlertid i lav transfektionseffektivitet og en kort varighed af forbigående genekspression, hvilket er en væsentlig begrænsning for langtidsdifferentieringsundersøgelser7. Elektroporation resulterer i bedre transfektionseffektivitet sammenlignet med fedtsugning; det resulterer dog i mere end 50% celledød 8,9,10. Ved hjælp af nukleofsektion kan celleoverlevelses- og transfektionseffektiviteten forbedres ved at kombinere fedtsugning og elektroporation, men tilgangen har brug for cellespecifikke buffere og specialudstyr og bliver således ret dyr for opskalerede applikationer11,12.
I modsætning hertil har virale vektorer vist forbedrede transfektionseffektiviteter såvel som generelt lav cytotoksicitet efter transduktion. Derudover udtrykkes de leverede gener stabilt og gør derfor denne metode ideel til langtidsstudier13. Blandt de mest almindeligt anvendte virale vektorer til genlevering til hESC'er er lentivirale vektorer (LVS), som kan give mere end 80% transduktionseffektivitet ved hjælp af virale partikler med høj titer14,15. Fedtsugning og CaPO 4-udfældning er blandt de mest almindeligt anvendte metoder til forbigående transfektion af HEK293T-celler eller dets derivater med genoverførselsvektorer sammen med emballageplasmider for at give lentivirale partikler16. Selvom fedtsugning resulterer i god transfektionseffektivitet og lav cytotoksicitet, hæmmes teknikken af dens omkostninger, og opskalering for at få høje titer lentivirale partikler ville være meget dyrt. CaPO 4-udfældning resulterer i relativt lignende transfektionseffektiviteter som dem, der opnås ved hjælp af fedtsugning. Selvom det er omkostningseffektivt, resulterer CaPO 4-udfældning i betydelig celledød efter transfektioner, hvilket gør det vanskeligt at standardisere og undgå batch-til-batch-variationer17. I dette scenarie er udvikling af en metode, der giver høj transfektionseffektivitet, lav cytotoksicitet og omkostningseffektivitet afgørende for produktionen af høje titer lentivirale partikler, der skal anvendes i hESC'er.
Polyethylenimin (PEI) er en kationisk polymer, der kan transfektere HEK293T-celler ved høj effektivitet uden meget cytotoksicitet og har en ubetydelig omkostning sammenlignet med fedtsugningsbaserede metoder18. I denne situation kan PEI anvendes til opskalerede anvendelser af høj titer LVS-produktion gennem koncentrationen af lentivirale partikler fra kultursupernatanter ved hjælp af forskellige teknikker. Den præsenterede artikel beskriver brugen af PEI til at transfektere HEK293T-celler og lentiviral vektorkoncentration ved anvendelse af ultracentrifugering gennem en saccharosepude. Ved hjælp af denne metode opnår vi regelmæssigt titere langt over 5 x 107 IE / ml med lave batch-til-batch-variationer. Metoden er enkel, ligetil og omkostningseffektiv til opskalerede applikationer til genlevering til hESC'er og hESC-afledte celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C14292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF Recombinant human</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin FRAC V</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Nutrient mix F12&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o: Ca and Mg</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovie serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2118S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Glutamine, 100X&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2924190090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH Polyclonal antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>15707-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH shRNA</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td></td>
			<td>Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR1 complete media</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium 1X CTS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1371201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 2 Supplement 100x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 27 Supplement 50x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-07200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin SOL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLKO.1 TRC vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLL3.7 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene infection reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR1003- G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2.0</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4551/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 
			dihydrochloride&#160;</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin .05% EDTA&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV 939</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3748/10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)

Den nuværende protokol beskriver brugen af lentivirale partikler til levering af korte hårnåle RNA'er (shRNA'er) til både humane embryonale stamceller (hESC'er) såvel som neurale stamceller (NPC'er) afledt af hESC'er med høj effektivitet. Lentivirale partikler blev genereret ved co-transfektering af HEK293T-celler ved anvendelse af indgangsvektorer (bærende shRNA'er) sammen med emballageplasmider (pAX og pMD2.G) ved anvendelse af den billige kationiske polymerpolyhypetin (PEI). Virale partikler blev koncentreret ved hjælp af ultracentrifugering, hvilket resulterede i gennemsnitlige titere over 5 x 107. Både hESC'er og NPC'er kan inficeres ved høje effektivitetsgevinster ved anvendelse af disse lentivirale partikler, som det fremgår af puromycinudvælgelse og stabil ekspression i hESC'er samt forbigående GFP-ekspression i NPC'er. Desuden viste western blot-analyse en signifikant reduktion i ekspressionen af gener målrettet af shRNA'er. Derudover bevarede cellerne deres pluripotens såvel som differentieringspotentiale, som det fremgår af deres efterfølgende differentiering i forskellige slægter af CNS. Den nuværende protokol omhandler levering af shRNA'er; Den samme fremgangsmåde kan imidlertid anvendes til ektopisk ekspression af cDNA'er til overekspressionsundersøgelser.

Efter genoverførsel er det uundgåeligt nødvendigt med høj levedygtighed af hESC'er. På trods af indsatsen og optimeringen af protokoller for at reducere celledød efter elektroporation af hESC'er observeres der stadig mere end 50% celledød efter elektroporation af disse celler sammen med lav transfektionseffektivitet20. Lentiviral medieret genoverførsel resulterer ikke kun i høj effektivitet af genoverførsel, men viser også høje niveauer af cellelevedygtighed efter transduktion. Resulta...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI at JoVE.com

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI

Ved hjælp af den billige kationiske polymer polyethylenimin (PEI) producerede vi lentivirale partikler til stabil ekspression af shRNA'er i H9 humane embryonale stamceller (hESC'er) og forbigående transducerede H9-afledte neurale stamceller (NPC'er) ved høj effektivitet.

Lentiviral medieret levering af shRNA'er til hESC'er og NPC'er ved hjælp af billig kationisk polymer polyethylenimin (PEI)

The current protocol describes the use of lentiviral particles for the delivery of short hairpin RNAs (shRNAs) to both human embryonic stem cells (hESCs) ...

Transfektion af HEK293T-celler skal udføres ved 90% sammenløb. Anvendelsen af et 0,45 mikron lavt proteinbindingsfilter til lentiviral vektorfiltrering og brugen af en saccharosepude til ultracentrifugering er også afgørende. Begynd med at dyrke HEK293T-celler i DMEM-medium indeholdende 10% FBS og 1X penicillin streptomycin ved 37 grader Celsius i en befugtet inkubator med en atmosfære på 5% kuldioxid og 21% ilt, indtil cellerne når 90% sammenløb før såning til transfektion.Frø fire gange 10 til de seks celler i 10 ml komplet vækstmedium i en 100 millimeter vævskulturplade og vokse natten over i en befugtet vævskulturinkubator med en atmosfære på 5% kuldioxid og 21% ilt. For hver transfektion fortyndes et milligram pr. milliliter plasmid-DNA-lagre i en milliliter serumfrie DMEM-medier i 1,5 milliliter centrifugerør ved at følge forholdet mellem indgangs- og emballageplasmider som beskrevet i tekstmanuskriptet. Vortex røret i 10 sekunder og drej ved 10.000 gange G i 30 sekunder ved stuetemperatur for at samle.Derefter tilsættes 70 mikroliter af en milligram pr. Milliliter stamopløsning af polymerpolyethylenimin eller PEI til røret. Igen, hvirvel og drej kortvarigt røret. Til lipofectaminbaseret transsektion fortyndes vektorerne i 500 mikroliter serumfrie DMEM-medier indeholdende 45 mikroliter reagens P, der leveres i sættet.Derefter fortyndes 70 mikroliter reagens L ved hjælp af 500 mikroliter af samme medium. Inkuber begge rør ved stuetemperatur i fem minutter. Kombiner derefter indholdet af begge rør og inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter for at tillade kompleks dannelse.Derefter tilsættes dråbevis en milliliter DNA PEI- eller DNA-lipofectaminkomplekser til pladen indeholdende celler og inkuberes i seks timer ved 37 grader Celsius med en atmosfære på 5% kuldioxid og 21% ilt. Efter inkubation skal du udskifte mediet med 10 ml friske komplette vækstmedier og returnere pladen til inkubatoren. Efter to dages transfektion opsamles det virusholdige medie og overlejres cellerne med 10 ml friske komplette vækstmedier.Igen, efter tre dages transfektion, skal du indsamle de virusholdige medier og kombinere det med de medier, der er indsamlet på to-dages tidspunkt. Centrifuger den virale supernatant ved 2.000 gange G i 10 minutter ved fire grader Celsius for at pelletere cellulært affald. Supernatanten filtreres ved hjælp af et 0,45 mikron porestørrelse lavt proteinbindingsfilter og opbevares ved fire grader Celsius, indtil det er klar til ultracentrifugering.Steriliser de ultracentrifuge rørholdende kopper ved vask med 70% ethanol i 10 minutter. Lufttør, luk og placer kopperne ved fire grader Celsius. Tilsæt 36 ml ved filtreret medium indeholdende lentivirale partikler til et sterilt ultracentrifugerør.Fyld fem milliliter af en steril stripette med fire ml steril 20% saccharoseopløsning fremstillet i PBS og dispenser den til bunden af røret indeholdende lentivirale vektorer eller LVS. Sørg for, at saccharoseopløsningen ikke blandes med mediet og danner en gradient i bunden af røret. Balancer alle ultracentrifugerørene ved hjælp af serumfrie DMEM-medier, placer rørene i kolde ultracentrifugerørholderkopper, og luk lågene.Drej rørene ved 125.000 gange G i to timer ved fire grader Celsius. Efter spin kasseres supernatanten forsigtigt ved at invertere indholdet af røret i en beholder indeholdende blegemiddel uden at forstyrre pelleten. Marker pelleten, hvis den er synlig.Anbring ultracentrifugerøret i et 50 ml sterilt rør og tilsæt 200 mikroliter steril DPBS øverst på pelleten. Placer røret ved fire grader Celsius natten over. Den følgende dag blandes forsigtigt indholdet af et rør ved at pipettere op og ned, inden det spindes ved 13.000 gange G i en bordpladecentrifuge for at pelletere eventuelt affald.Overfør supernatanten til et nyt rør og aliquot viruspræparatet. Til sidst opbevares rørene ved minus 80 grader Celsius. Efter transfektion blev der observeret rigelig GFP-ekspression i HEK293T-celler.Ekspressionen af virale proteiner resulterede i syncytia-dannelse af HEK293T-celler, hvor enkeltceller smeltes sammen. Efter infektion blev der også observeret markant ekspression af GFP i virusinficerede neurale stamceller. LVS-titermåling mellem det billige PEI- og lipofectamin 3000-reagens viste ingen signifikant forskel i viral titer.De virale titere til PLK 0.1-baserede vektorer er vist her. Lentivirale transinficerede celler viste mere end 80% cellelevedygtighed sammenlignet med ikke-transducerede celler, mens ingen celler overlevede behandlingen. Western blot-analyse viste rigelig ekspression af L-2-hydroxyglutaratdehydrogenase i celler transduceret med en tom vektor rygrad.Imidlertid blev der ikke observeret nogen ekspression i celler transduceret med en vektor, der bærer korte hårnåle RNA'er. Den største fordel ved denne teknik er brugen af billig kationisk polymerpolyethylenimin til fremstilling af lentivirale partikler ved co-transfektering af HEK293T-celler ved anvendelse af indgangs- og emballagevektorer.

Research

JoVE Journal

Biology

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI)

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Generation of Human induceret pluripotente stamceller fra perifert blod Brug af STEMCCA lentivirusvektor

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Langsigtet undertrykkelse af Intersectin-1s i muselunger ved Gentagen leveringen af ​​en specifik siRNA via kationiske liposomer. Evaluering af Knockdown Effects ved elektronmikroskopi

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Brug cokultur Detect Kemisk medierede interspecies Interaktioner

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generering af Myospheres Fra hESCs ved Epigenetisk Omprogrammering

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Phosphopeptid Analyse af gnaver epididymale Spermatozoer

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...