Name: lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)
Uploaded: 2022-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door onderzoeksbeurzen van de United Arab Emirates University (UAEU), grant # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) en # 12R010 (UAEU-AUA-beurs). We bedanken Prof Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) voor het helpen bewerken van het manuscript voor stijl en grammatica.
Alle gegevens zijn op aanvraag beschikbaar.

1. Transfectie van HEK293T-cellen met behulp van PEI- of Lipofectamine 3000-reagens
<ol><li>Kweek HEK293T cellen in DMEM + 10% FBS + 1x penicilline/streptomycine bij 37 °C in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% CO2 en 21% O2 totdat ze 90% confluent zijn voordat ze worden gezaaid voor transfectie. Gebruik een relatief laag aantal cellen voor de productie van een hoog titervirus (idealiter minder dan P30).</li>
	<li>Zaai 4 x 106 cellen in 10 ml volledig gr...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+Somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).</li><li>Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+and+gene+therapy.">Human embryonic stem cells and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).</li><li>Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+nonviral+gene+delivery+and+its+role+in+pluripotent+stem+cell+engineering.">Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).</li><li>Li, S. D., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+is+superior+to+viral+gene+delivery.">Nonviral is superior to viral gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).</li><li>Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery+systems:+From+simple+transfection+agents+to+artificial+viruses.">Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li><li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+human+embryonic+stem+cells:+Small+and+macromolecule+loading+and+DNA+transfection.">Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection.</a> Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).</li><li>Sukhorukov, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+high-intensity+field+pulses:+Strategies+for+improving+robustness+and+performance+of+electrotransfection+and+electrofusion.">Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion.</a> The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).</li><li>Floch, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+phosphonolipids+as+non+viral+vectors+for+DNA+transfection+in+hematopoietic+cell+lines+and+CD34++cells.">Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).</li><li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells.">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).</li><li>Siemen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).</li><li>Zhang, X., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+in+tissue+engineering.">Viral vectors for gene delivery in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).</li><li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors.">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li><li>Gropp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+genetic+modification+of+human+embryonic+stem+cells+by+lentiviral+vectors.">Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).</li><li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors.">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).</li><li>Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors.">Production of lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 3, 16017 (2016).</li><li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., G&#246;pferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+nonviral+gene+delivery+systems.">Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li><li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation+during+in-vitro+human+embryonic+cortical+neurogenesis.">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).</li><li>Weissinger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+in+purified+human+hematopoietic+peripheral-blood+stem+cells+by+means+of+electroporation+without+prestimulation.">Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+transgene+expression+to+antigen-presenting+cells+derived+from+lentivirus-transduced+engrafting+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Blood. 99 (2), 399-408 (2002).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells.">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).</li><li>Sweeney, N. P., Vink, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+lentiviral+vector+genome+size+and+producer+cell+genomic+to+gag-pol+mRNA+ratios+on+packaging+efficiency+and+titre.">The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 574-584 (2021).</li></ol>

Het vermogen om stamcellen genetisch te modificeren voor studie of klinische doeleinden wordt beperkt door zowel technologie als het basisbegrip van de biologie van hESCs. Technieken die een aanzienlijk potentieel hebben aangetoond in muis-SER's, zoals lipofectie en elektroporatie, zijn niet erg efficiënt voor hESCs, die notoir moeilijk zijn voor genafgifte met conventionele methoden20. Dit idee heeft niet alleen geleid tot de optimalisatie van bestaande technieken, maar ook tot de ontwikkeling v...

Menselijke embryonale stamcellen (hESCs) afgeleid van de blastocyst binnenste celmassa zijn pluripotent en kunnen worden gedifferentieerd in verschillende celtypen, afhankelijk van externe factoren onder in vitro omstandigheden 1,2. Om het potentieel van hESCs volledig te benutten, is het noodzakelijk om snelle en betrouwbare genafgiftemethoden voor deze cellen te hebben. Conventioneel kunnen de gebruikte technieken grofweg worden ingedeeld in twee typen: niet-virale en virale genafgiftesystemen 3,4. De meest gebruikte niet-virale genafgiftesystemen zijn lipofectie, elektroporatie en nucleofection. Niet-virale toedieningssystemen zijn voordelig vanwege minder insertiemutaties en een algehele afname van immunogeniciteit 5,6. Deze methoden resulteren echter in een lage transfectie-efficiëntie en een korte duur van voorbijgaande genexpressie, wat een belangrijke beperking is voor langetermijndifferentiatiestudies7. Elektroporatie resulteert in een betere transfectie-efficiëntie in vergelijking met lipofectie; het resulteert echter in meer dan 50% celdood 8,9,10. Met behulp van nucleofection kunnen de celoverleving en transfectie-efficiëntie worden verbeterd door lipofectie en elektroporatie te combineren, maar de aanpak heeft celspecifieke buffers en gespecialiseerde apparatuur nodig en wordt dus behoorlijk duur voor opgeschaalde toepassingen 11,12.
Daarentegen hebben virale vectoren verbeterde transfectie-efficiënties aangetoond, evenals een algehele lage cytotoxiciteit, na transductie. Bovendien zijn de geleverde genen stabiel tot expressie gebracht en maken deze methode dus ideaal voor langetermijnstudies13. Een van de meest gebruikte virale vectoren voor genafgifte in hESCs zijn lentivirale vectoren (LVS), die meer dan 80% transductie-efficiëntie kunnen geven met behulp van virale deeltjes met een hoge titer14,15. Lipofectie en CaPO 4-precipitatie behoren tot de meest gebruikte methoden om HEK293T-cellen of zijn derivaten tijdelijk te transfecteren met genoverdrachtsvectoren samen met verpakkingsplasmiden om lentivirale deeltjes16 te produceren. Hoewel lipofectie resulteert in een goede transfectie-efficiëntie en lage cytotoxiciteit, wordt de techniek belemmerd door de kosten, en opschalen om hoge titer lentivirale deeltjes te krijgen zou erg duur zijn. CaPO4-neerslag resulteert in relatief vergelijkbare transfectie-efficiënties als die verkregen met behulp van lipofectie. Hoewel kosteneffectief, resulteert CaPO4-neerslag in aanzienlijke celdood na transfecties, wat het moeilijk maakt om te standaardiseren en batch-to-batch variaties te vermijden17. In dit scenario is het ontwikkelen van een methode die een hoge transfectie-efficiëntie, lage cytotoxiciteit en kosteneffectiviteit geeft, cruciaal voor de productie van lentivirale deeltjes met een hoge titer die in hESCs worden gebruikt.
Polyethylenimine (PEI) is een kationisch polymeer dat HEK293T-cellen met een hoge efficiëntie kan transfecteren zonder veel cytotoxiciteit en heeft een verwaarloosbare kost in vergelijking met op lipofectie gebaseerde methoden18. In deze situatie kan PEI worden gebruikt voor opgeschaalde toepassingen van lvs-productie met een hoge titer door de concentratie van lentivirale deeltjes uit kweeksupernatanten met behulp van verschillende technieken. Het gepresenteerde artikel beschrijft het gebruik van PEI om HEK293T-cellen en lentivirale vectorconcentratie te transfecteren met behulp van ultracentrifugatie via een sucrosekussen. Met behulp van deze methode verkrijgen we regelmatig titers ruim boven 5 x 107 IE / ml met lage batch-to-batch variaties. De methode is eenvoudig, ongecompliceerd en kosteneffectief voor opgeschaalde toepassingen voor genafgifte aan hESCs en hESCs-afgeleide cellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C14292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF Recombinant human</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin FRAC V</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Nutrient mix F12&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o: Ca and Mg</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovie serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2118S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Glutamine, 100X&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2924190090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH Polyclonal antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>15707-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH shRNA</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td></td>
			<td>Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR1 complete media</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium 1X CTS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1371201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 2 Supplement 100x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 27 Supplement 50x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-07200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin SOL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLKO.1 TRC vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLL3.7 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene infection reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR1003- G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2.0</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4551/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 
			dihydrochloride&#160;</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin .05% EDTA&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV 939</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3748/10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)

Het huidige protocol beschrijft het gebruik van lentivirale deeltjes voor de levering van korte haarspeldrna's (shRNA's) aan zowel menselijke embryonale stamcellen (hESCs) als neurale voorlopercellen (NPC's) afgeleid van hESCs met een hoge efficiëntie. Lentivirale deeltjes werden gegenereerd door hek293T-cellen te co-transfecteren met behulp van entryvectoren (die shRNA's dragen) samen met verpakkingsplasmiden (pAX en pMD2.G) met behulp van het goedkope kationische polymeer polyethylenimine (PEI). Virale deeltjes werden geconcentreerd met behulp van ultracentrifugatie, wat resulteerde in gemiddelde titers boven 5 x 107. Zowel hESCs als NPC's kunnen met hoge efficiëntie worden geïnfecteerd met behulp van deze lentivirale deeltjes, zoals blijkt uit puromycineselectie en stabiele expressie in hESCs, evenals voorbijgaande GFP-expressie in NPC's. Bovendien toonde western blot-analyse een significante vermindering van de expressie van genen gericht op shRNA's. Bovendien behielden de cellen hun pluripotentie en differentiatiepotentieel, zoals blijkt uit hun daaropvolgende differentiatie in verschillende afstammingslijnen van het CZS. Het huidige protocol gaat over de levering van shRNA's; dezelfde benadering kan echter worden gebruikt voor de ectopische expressie van cDA's voor overexpressiestudies.

Na genoverdracht is onvermijdelijk een hoge levensvatbaarheid van hESCs vereist. Ondanks de inspanningen en optimalisatie van protocollen om celdood na elektroporatie van hESCs te verminderen, wordt nog steeds meer dan 50% celdood waargenomen na elektroporatie van deze cellen, samen met een lage transfectie-efficiëntie20. Lentivirale gemedieerde genoverdracht resulteert niet alleen in een hoge efficiëntie van genoverdracht, maar toont ook hoge niveaus van cel levensvatbaarheid na transductie. De...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI at JoVE.com

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI

Met behulp van het goedkope kationische polymeer polyethylenimine (PEI) produceerden we lentivirale deeltjes voor stabiele expressie van shRNA's in H9 menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en transiënt getransduceerde H9-afgeleide neurale voorlopercellen (NPC's) met een hoge efficiëntie.

Lentivirale gemedieerde levering van shRNA's aan hESCs en NPC's met behulp van goedkope kationische polymeerpolyethylenimine (PEI)

The current protocol describes the use of lentiviral particles for the delivery of short hairpin RNAs (shRNAs) to both human embryonic stem cells (hESCs) ...

Transfectie van HEK293T-cellen moet worden uitgevoerd bij 90% confluency. Ook het gebruik van een 0,45 micron laag eiwitbindend filter voor lentivirale vectorfiltratie en het gebruik van een sucrosekussen voor ultracentrifugatie zijn essentieel. Begin met het kweken van HEK293T-cellen in DMEM-medium met 10% FBS en 1X penicilline streptomycine bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator met een atmosfeer van 5% koolstofdioxide en 21% zuurstof totdat cellen 90% samenvloeiing bereiken voordat ze worden gezaaid voor transfectie.Zaai vier keer 10 naar de zes cellen in 10 milliliter volledig groeimedium in een weefselkweekplaat van 100 millimeter en groei 's nachts in een bevochtigde weefselkweekincubator met een atmosfeer van 5% koolstofdioxide en 21% zuurstof. Verdun voor elke transfectie één milligram per milliliter plasmide-DNA-voorraden in één milliliter serumvrije DMEM-media in centrifugebuizen van 1,5 milliliter door de verhouding van invoer- en verpakkingsplasmiden te volgen zoals beschreven in het tekstmanuscript. Vortex de buis gedurende 10 seconden en draai op 10, 000 keer G gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur om te verzamelen.Voeg vervolgens 70 microliter van één milligram per milliliter voorraadoplossing polymeerpolyethyleimine of PEI toe aan de buis. Nogmaals, vortex en kort spin de buis. Verdun voor transsectie op basis van lipofectamine de vectoren in 500 microliter serumvrije DMEM-media met 45 microliter reagens P in de kit.Verdun vervolgens 70 microliter reagens L met behulp van 500 microliter van hetzelfde medium. Incubeer beide buizen bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Combineer vervolgens de inhoud van beide buizen en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om complexe vorming mogelijk te maken.Voeg vervolgens druppelgewijs een milliliter DNA PEI- of DNA-lipofectaminecomplexen toe aan de plaat met cellen en incubeer gedurende zes uur bij 37 graden Celsius met een atmosfeer van 5% koolstofdioxide en 21% zuurstof. Vervang na incubatie de media door 10 milliliter verse complete groeimedia en breng de plaat terug naar de incubator. Verzamel na twee dagen transfectie de virusbevattende media en leg de cellen met 10 milliliter verse volledige groeimedia.Nogmaals, na drie dagen transfectie, verzamel de virusbevattende media en combineer deze met de media die op het tijdstip van twee dagen zijn verzameld. Centrifugeer het virale supernatant op 2.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius tot pelletcellulair afval. Filter het supernatant met behulp van een poriegrootte van 0,45 micron laag eiwitbindend filter en bewaar het bij vier graden Celsius totdat het klaar is voor ultracentrifugatie.Steriliseer de bekers van de ultracentrifugebuizen door ze gedurende 10 minuten te wassen met 70% ethanol. Aan de lucht drogen, sluiten en plaatsen de cups op vier graden Celsius. Voeg 36 milliliter aan gefilterde media met lentivirale deeltjes toe aan een steriele ultracentrifugebuis.Vul vijf milliliter van een steriele stripette met vier milliliter steriele 20% sucrose-oplossing bereid in PBS en doseer deze op de bodem van de buis die lentivirale vectoren of LVS bevat. Zorg ervoor dat de sucrose-oplossing niet met de media wordt gemengd en een gradiënt maakt aan de onderkant van de buis. Balanceer alle ultracentrifugebuizen met serumvrije DMEM-media, plaats de buizen in koude ultracentrifugebuizen met bekers en sluit de deksels.Draai de buizen op 125.000 keer G gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Gooi na de spin het supernatant voorzichtig weg door de inhoud van de buis in een container met bleekmiddel om te keren zonder de pellet te verstoren. Markeer de pellet indien zichtbaar.Plaats de ultracentrifugebuis in een steriele buis van 50 milliliter en voeg 200 microliter steriele DPBS toe aan de bovenkant van de pellet. Plaats de buis 's nachts op vier graden Celsius. Meng de volgende dag voorzichtig de inhoud van een buis door op en neer te pipetteren voordat u op 13.000 keer G in een tafelcentrifuge draait om vuil te pelleteren.Breng het supernatant over in een nieuwe buis en aliquot het viruspreparaat. Bewaar de buisjes tot slot bij min 80 graden Celsius. Na transfectie werd overvloedige GFP-expressie waargenomen in HEK293T-cellen.De expressie van virale eiwitten resulteerde in syncytiavorming van HEK293T-cellen waarbij afzonderlijke cellen worden gefuseerd. Na infectie werd ook een duidelijke expressie van GFP waargenomen in viraal geïnfecteerde neurale voorlopercellen. LVS-titermeting tussen het goedkope PEI- en lipofectamine 3000-reagens toonde geen significant verschil in virale titer.De virale titers voor PLK 0.1-gebaseerde vectoren worden hier weergegeven. Lentivirale getransfecteerde cellen vertoonden meer dan 80% cel levensvatbaarheid in vergelijking met niet-getransduceerde cellen, terwijl geen cellen de behandeling overleefden. Western blot-analyse toonde overvloedige expressie van L-2-hydroxyglutaraatdehydrogenase in cellen getransduceerd met een lege vectorbackbone.Er werd echter geen expressie waargenomen in cellen die werden getransduceerd met een vector die korte haarspeld-RNA's droeg. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van goedkope kationische polymeerpolylyethyleen om lentivirale deeltjes te produceren door HEK293T-cellen te co-transfecteren met behulp van invoer- en verpakkingsvectoren.

Research

JoVE Journal

Biology

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI)

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Etikettering hESC &#39;s en hMSCs met ijzeroxide nanodeeltjes voor niet-invasieve in vivo Tracking met MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

Van MEF op I Matrigel: passage hESC &#39;s in de aanwezigheid van MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

Van MEF tot Matrigel 2: Splitsen van hESC &#39;s van MEFs op Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Van MEF tot Matrigel 3: passage uit hESC &#39;s Matrigel op Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentivirale-gemedieerde Knockdown Tijdens het Ex Vivo Erytropoëse van humane hematopoietische stamcellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Langdurige zwijgen van Intersectin-1s in Muis Longen door Herhaalde levering van een specifiek siRNA via kationische liposomen. Evaluatie van Knockdown Effects van Electron Microscopy

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Met behulp Coculture te sporen Chemisch Mediated Interspecies Interacties

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generatie Myospheres Van hESCs door Epigenetische herprogrammeren

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Fosfopeptide Analyse van knaagdieren Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...