Name: lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)
Uploaded: 2022-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da borse di ricerca della United Arab Emirates University (UAEU), grant # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) e # 12R010 (UAEU-AUA grant). Ringraziamo il Prof Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) per averci aiutato a modificare il manoscritto per stile e grammatica.
Tutti i dati sono disponibili su richiesta.

1. Trasfezione di cellule HEK293T utilizzando PEI o lipofectamine 3000 reagente
<ol><li>Coltiva cellule HEK293T in DMEM + 10% FBS + 1x penicillina/streptomicina a 37 °C in un incubatore umidificato con un'atmosfera del 5% CO2 e 21% O2 fino a quando non sono confluenti al 90% prima della semina per la trasfezione. Utilizzare un numero di cellule di passaggio relativamente basso per un'elevata produzione di virus del titolo (idealmente inferiore a P30).</li>
	<li>Semina 4 x 10...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+Somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).</li><li>Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+and+gene+therapy.">Human embryonic stem cells and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).</li><li>Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+nonviral+gene+delivery+and+its+role+in+pluripotent+stem+cell+engineering.">Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).</li><li>Li, S. D., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+is+superior+to+viral+gene+delivery.">Nonviral is superior to viral gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).</li><li>Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery+systems:+From+simple+transfection+agents+to+artificial+viruses.">Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li><li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+human+embryonic+stem+cells:+Small+and+macromolecule+loading+and+DNA+transfection.">Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection.</a> Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).</li><li>Sukhorukov, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+high-intensity+field+pulses:+Strategies+for+improving+robustness+and+performance+of+electrotransfection+and+electrofusion.">Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion.</a> The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).</li><li>Floch, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+phosphonolipids+as+non+viral+vectors+for+DNA+transfection+in+hematopoietic+cell+lines+and+CD34++cells.">Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).</li><li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells.">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).</li><li>Siemen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).</li><li>Zhang, X., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+in+tissue+engineering.">Viral vectors for gene delivery in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).</li><li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors.">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li><li>Gropp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+genetic+modification+of+human+embryonic+stem+cells+by+lentiviral+vectors.">Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).</li><li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors.">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).</li><li>Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors.">Production of lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 3, 16017 (2016).</li><li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., G&#246;pferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+nonviral+gene+delivery+systems.">Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li><li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation+during+in-vitro+human+embryonic+cortical+neurogenesis.">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).</li><li>Weissinger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+in+purified+human+hematopoietic+peripheral-blood+stem+cells+by+means+of+electroporation+without+prestimulation.">Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+transgene+expression+to+antigen-presenting+cells+derived+from+lentivirus-transduced+engrafting+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Blood. 99 (2), 399-408 (2002).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells.">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).</li><li>Sweeney, N. P., Vink, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+lentiviral+vector+genome+size+and+producer+cell+genomic+to+gag-pol+mRNA+ratios+on+packaging+efficiency+and+titre.">The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 574-584 (2021).</li></ol>

La capacità di modificare geneticamente le cellule staminali per scopi di studio o clinici è limitata sia dalla tecnologia che dalla comprensione di base della biologia delle hESC. Le tecniche che hanno mostrato un potenziale significativo nelle ESC di topo, come la lipofezione e l'elettroporazione, non sono altamente efficienti per le hESC, che sono notoriamente difficili per la consegna genica con metodi convenzionali20. Questa nozione ha portato non solo all'ottimizzazione delle tecniche esis...

Le cellule staminali embrionali umane (hESC) derivate dalla massa cellulare interna della blastocisti sono pluripotenti e possono essere differenziate in diversi tipi di cellule a seconda di fattori esterni in condizioni in vitro 1,2. Al fine di sfruttare appieno il potenziale delle hESC, è imperativo disporre di metodi di consegna genica rapidi e affidabili per queste cellule. Convenzionalmente, le tecniche utilizzate possono essere ampiamente classificate in due tipi: sistemi di consegna genica non virale e virale 3,4. I sistemi di consegna genica non virale più frequentemente utilizzati sono la lipofezione, l'elettroporazione e la nucleofezione. I sistemi di somministrazione non virale sono vantaggiosi a causa del minor numero di mutazioni di inserzione e di una diminuzione complessiva dell'immunogenicità 5,6. Tuttavia, questi metodi si traducono in una bassa efficienza di trasfezione e una breve durata dell'espressione genica transitoria, che è una delle principali limitazioni per gli studi di differenziazione a lungo termine7. L'elettroporazione si traduce in migliori efficienze di trasfezione rispetto alla lipofezione; tuttavia, si traduce in oltre il 50% di morte cellulare 8,9,10. Utilizzando la nucleofezione, la sopravvivenza cellulare e l'efficienza della trasfezione possono essere migliorate combinando lipofezione ed elettroporazione, ma l'approccio richiede tamponi specifici per le cellule e attrezzature specializzate e, quindi, diventa piuttosto costoso per le applicazioni scaled-up11,12.
Al contrario, i vettori virali hanno mostrato una migliore efficienza di trasfezione, così come una bassa citotossicità complessiva, dopo la trasduzione. Inoltre, i geni consegnati sono espressi stabilmente e, quindi, rendono questo metodo ideale per studi a lungo termine13. Tra i vettori virali più comunemente usati per la consegna genica nelle hESC ci sono i vettori lentivirali (LVS), che possono dare un'efficienza di trasduzione superiore all'80% utilizzando particelle virali ad alto titolo14,15. La lipofezione e la precipitazione di CaPO4 sono tra i metodi più comunemente usati per trasfettare transitoriamente le cellule HEK293T o i suoi derivati con vettori di trasferimento genico insieme a plasmidi di imballaggio per produrre particelle lentivirali16. Sebbene la lipofezione si traduca in una buona efficienza di trasfezione e bassa citotossicità, la tecnica è ostacolata dal suo costo e il ridimensionamento per ottenere particelle lentivirali ad alto titolo sarebbe molto costoso. La precipitazione di CaPO4 si traduce in efficienze di trasfezione relativamente simili a quelle ottenute utilizzando la lipofezione. Sebbene economicamente vantaggiosa, la precipitazione di CaPO4 provoca una significativa morte cellulare a seguito di trasfezioni, il che rende difficile standardizzare ed evitare variazioni da lotto a lotto17. In questo scenario, lo sviluppo di un metodo che dia un'elevata efficienza di trasfezione, bassa citotossicità ed economicità è fondamentale per la produzione di particelle lentivirali ad alto titolo da utilizzare nelle hESC.
La polietilenimina (PEI) è un polimero cationico in grado di trasfettare le cellule HEK293T ad alta efficienza senza molta citotossicità e ha un costo trascurabile rispetto ai metodi basati sulla lipofezione18. In questa situazione, PEI può essere utilizzato per applicazioni su larga scala di produzione di LVS ad alto titolo attraverso la concentrazione di particelle lentivirali da supernatanti di coltura utilizzando varie tecniche. L'articolo presentato descrive l'uso del PEI per trasfettare le cellule HEK293T e la concentrazione del vettore lentivirale utilizzando l'ultracentrifugazione attraverso un cuscino di saccarosio. Usando questo metodo, otteniamo regolarmente titoli ben al di sopra di 5 x 107 UI / mL con basse variazioni da lotto a lotto. Il metodo è semplice, diretto ed economico per applicazioni su larga scala per la consegna di geni a hESC e cellule derivate da hESC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C14292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF Recombinant human</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin FRAC V</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Nutrient mix F12&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o: Ca and Mg</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovie serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2118S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Glutamine, 100X&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2924190090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH Polyclonal antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>15707-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH shRNA</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td></td>
			<td>Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR1 complete media</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium 1X CTS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1371201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 2 Supplement 100x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 27 Supplement 50x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-07200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin SOL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLKO.1 TRC vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLL3.7 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene infection reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR1003- G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2.0</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4551/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 
			dihydrochloride&#160;</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin .05% EDTA&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV 939</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3748/10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)

L'attuale protocollo descrive l'uso di particelle lentivirali per la somministrazione di RNA a forcina corta (shRNA) sia alle cellule staminali embrionali umane (hESC) che alle cellule progenitrici neurali (NPC) derivate da hESC ad alta efficienza. Le particelle lentivirali sono state generate co-trasfettando le cellule HEK293T utilizzando vettori di ingresso (che trasportano shRNA) insieme a plasmidi di imballaggio (pAX e pMD2.G) utilizzando il polimero cationico a basso costo polietilenimmina (PEI). Le particelle virali sono state concentrate utilizzando l'ultracentrifugazione, che ha portato a titoli medi superiori a 5 x 107. Sia le hESC che le NPC potrebbero essere infettate ad alta efficienza utilizzando queste particelle lentivirali, come dimostrato dalla selezione della puromicina e dall'espressione stabile nelle hESC, nonché dall'espressione transitoria della GFP nelle NPC. Inoltre, l'analisi western blot ha mostrato una significativa riduzione dell'espressione dei geni presi di mira dagli shRNA. Inoltre, le cellule hanno mantenuto la loro pluripotenza e il potenziale di differenziazione, come evidenziato dalla loro successiva differenziazione in diversi lignaggi del SNC. L'attuale protocollo si occupa della consegna di shRNA; tuttavia, lo stesso approccio potrebbe essere utilizzato per l'espressione ectopica dei cDNA per gli studi di sovraespressione.

A seguito del trasferimento genico, è inevitabilmente richiesta un'elevata vitalità delle hESC. Nonostante gli sforzi e l'ottimizzazione dei protocolli per ridurre la morte cellulare a seguito dell'elettroporazione delle hESC, oltre il 50% della morte cellulare è ancora osservato dopo l'elettroporazione di queste cellule, insieme a una bassa efficienza di trasfezione20. Il trasferimento genico mediato da lentivirale non solo si traduce in un'elevata efficienza del trasferimento genico, ma dimos...

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Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI

Utilizzando il polimero cationico a basso costo polietilenimina (PEI), abbiamo prodotto particelle lentivirali per l'espressione stabile di shRNA in cellule staminali embrionali umane H9 (hESC) e cellule progenitrici neurali derivate da H9 trasdotte transitoriamente (NPC) ad alta efficienza.

Consegna mediata lentivirale di shRNA a hESC e NPC utilizzando polietilenimina polimerica cationica a basso costo (PEI)

The current protocol describes the use of lentiviral particles for the delivery of short hairpin RNAs (shRNAs) to both human embryonic stem cells (hESCs) ...

La trasfezione delle cellule HEK293T deve essere eseguita al 90% di confluenza. Inoltre, l'uso di un filtro legante a basso contenuto proteico da 0,45 micron per la filtrazione vettoriale lentivirale e l'uso di un cuscino di saccarosio per l'ultracentrifugazione sono essenziali. Inizia coltivando cellule HEK293T in mezzo DMEM contenente il 10% di FBS e 1X di penicillina streptomicina a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con un'atmosfera di 5% di anidride carbonica e 21% di ossigeno fino a quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza prima di seminare per la trasfezione.Semina quattro volte 10 alle sei cellule in 10 millilitri di terreno di coltura completo in una piastra di coltura tissutale da 100 millimetri e cresci durante la notte in un incubatore di colture tissutali umidificate con un'atmosfera di 5% di anidride carbonica e 21% di ossigeno. Per ogni trasfezione, diluire un milligrammo per millilitro di scorte di DNA plasmidico in un millilitro di mezzi DMEM privi di siero in tubi di centrifuga da 1,5 millilitri seguendo il rapporto tra plasmidi di ingresso e imballaggio come descritto nel manoscritto di testo. Ruotare il tubo per 10 secondi e ruotare a 10.000 volte G per 30 secondi a temperatura ambiente per raccogliere.Quindi, aggiungere 70 microlitri di un milligrammo per millilitro di soluzione madre di polimero polietileneimina, o PEI, al tubo. Ancora una volta, vortice e girare brevemente il tubo. Per la transezione a base di lipofetamina, diluire i vettori in 500 microlitri di mezzi DMEM privi di siero contenenti 45 microlitri di reagente P forniti nel kit.Quindi, diluire 70 microlitri di reagente L utilizzando 500 microlitri dello stesso mezzo. Incubare entrambi i tubi a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, combinare il contenuto di entrambi i tubi e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire la formazione di complessi.Quindi, aggiungere un millilitro di DNA PEI o dna lipofectamine complessi alla piastra contenente cellule e incubare per sei ore a 37 gradi Celsius con un'atmosfera di 5% di anidride carbonica e 21% di ossigeno. Dopo l'incubazione, sostituire il mezzo con 10 millilitri di terreno di crescita fresco completo e restituire la piastra all'incubatore. Dopo due giorni di trasfezione, raccogliere i mezzi contenenti virus e sovrapporre le cellule con 10 millilitri di mezzi di crescita freschi e completi.Ancora una volta, dopo tre giorni di trasfezione, raccogliere i media contenenti virus e combinarli con i media raccolti al punto temporale di due giorni. Centrifugare il surnatante virale a 2.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius per pellettizzare i detriti cellulari. Filtrare il surnatante utilizzando un filtro a bassa legatura proteica da 0,45 micron e conservare a quattro gradi Celsius fino a quando non è pronto per l'ultracentrifugazione.Sterilizzare le coppette dei tubi ultracentrifuga lavando con etanolo al 70% per 10 minuti. Asciugare all'aria, chiudere e posizionare le tazze a quattro gradi Celsius. Aggiungere 36 millilitri a mezzi filtrati contenenti particelle lentivirali a un tubo ultracentrifugale sterile.Riempire cinque millilitri di una stripette sterile con quattro millilitri di soluzione sterile al 20% di saccarosio preparata in PBS e dispensarla sul fondo del tubo contenente vettori lentivirali o LVS. Assicurarsi che la soluzione di saccarosio non debba essere miscelata con il fluido e faccia un gradiente nella parte inferiore del tubo. Bilanciare tutti i tubi ultracentrifuga utilizzando supporti DMEM privi di siero, posizionare i tubi in tazze fredde ultracentrifuga e chiudere i coperchi.Ruotare i tubi a 125.000 volte G per due ore a quattro gradi Celsius. Dopo la rotazione, scartare con cura il surnatante invertendo il contenuto del tubo in un contenitore contenente candeggina senza disturbare il pellet. Contrassegnare il pellet se visibile.Posizionare il tubo ultracentrifuga in un tubo sterile da 50 millilitri e aggiungere 200 microlitri di DPBS sterile nella parte superiore del pellet. Posizionare il tubo a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, mescolare delicatamente il contenuto di un tubo tubando su e giù prima di girare a 13.000 volte G in una centrifuga da tavolo per pellettizzare eventuali detriti.Trasferire il surnatante in un nuovo tubo e aliquotare la preparazione del virus. Infine, conservare i tubi a meno 80 gradi Celsius. Dopo la trasfezione, è stata osservata un'abbondante espressione di GFP nelle cellule HEK293T.L'espressione di proteine virali ha portato alla formazione di sincizia delle cellule HEK293T in cui sono fuse singole cellule. Dopo l'infezione, è stata osservata una marcata espressione di GFP anche nelle cellule progenitrici neurali infettate da virus. La misurazione del titolo LVS tra il pei a basso costo e il reagente lipofectamine 3000 non ha mostrato alcuna differenza significativa nel titolo virale.I titoli virali per i vettori basati su PLK 0.1 sono mostrati qui. Le cellule trasfettate lentivirali hanno mostrato una vitalità cellulare superiore all'80% rispetto alle cellule non trasdotte, mentre nessuna cellula è sopravvissuta al trattamento. L'analisi Western blot ha mostrato un'abbondante espressione di L-2-idrossiglutarato deidrogenasi in cellule trasdotte con una spina dorsale vettoriale vuota.Tuttavia, non è stata osservata alcuna espressione nelle cellule trasdotte con un vettore che trasporta RNA a forcina corta. Il vantaggio principale di questa tecnica è l'uso di polimero cationico a basso costo polietileneimmina per produrre particelle lentivirali co-trasfezionando celle HEK293T utilizzando vettori di ingresso e confezionamento.

Research

JoVE Journal

Biology

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI)

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Etichettatura hESC e hMSCs con nanoparticelle di ossido di ferro per i non-invasiva in vivo inseguimento con la RM

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Ricerca

Biologia

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

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From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

Dal MEF per Matrigel 2: hESC scissione dal MEF sul Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Dal MEF per Matrigel 3: hESC Passaging da Matrigel su Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

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Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo</emEritropoiesi> di cellule staminali emopoietiche

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