Name: lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)
Uploaded: 2022-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI at JoVE.com

この研究は、アラブ首長国連邦大学(UAEU)からの研究助成金、助成金#31R170(ザイード健康科学センター)および#12R010(UAEU-AUA助成金)によって支援されました。ランドール・モース教授(ニューヨーク州オールバニーのワズワース・センター)が、スタイルと文法の原稿の編集を手伝ってくれたことに感謝します。
すべてのデータは要求に応じて利用可能です。

1. PEIまたはリポフェクタミン3000試薬のいずれかを使用したHEK293T細胞のトランスフェクション
<ol><li>HEK293T細胞をDMEM + 10% FBS + 1xペニシリン/ストレプトマイシン中で、5%CO2および21%O2 の雰囲気の加湿インキュベーター内で37°Cで培養し、トランスフェクションのために播種する前に90%コンフルエントになるまで培養 します。高力価ウイルス産生には比較的低い継代?...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+Somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).</li><li>Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+and+gene+therapy.">Human embryonic stem cells and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).</li><li>Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+nonviral+gene+delivery+and+its+role+in+pluripotent+stem+cell+engineering.">Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).</li><li>Li, S. D., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+is+superior+to+viral+gene+delivery.">Nonviral is superior to viral gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).</li><li>Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery+systems:+From+simple+transfection+agents+to+artificial+viruses.">Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li><li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+human+embryonic+stem+cells:+Small+and+macromolecule+loading+and+DNA+transfection.">Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection.</a> Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).</li><li>Sukhorukov, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+high-intensity+field+pulses:+Strategies+for+improving+robustness+and+performance+of+electrotransfection+and+electrofusion.">Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion.</a> The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).</li><li>Floch, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+phosphonolipids+as+non+viral+vectors+for+DNA+transfection+in+hematopoietic+cell+lines+and+CD34++cells.">Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).</li><li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells.">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).</li><li>Siemen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).</li><li>Zhang, X., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+in+tissue+engineering.">Viral vectors for gene delivery in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).</li><li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors.">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li><li>Gropp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+genetic+modification+of+human+embryonic+stem+cells+by+lentiviral+vectors.">Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).</li><li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors.">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).</li><li>Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors.">Production of lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 3, 16017 (2016).</li><li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., G&#246;pferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+nonviral+gene+delivery+systems.">Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li><li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation+during+in-vitro+human+embryonic+cortical+neurogenesis.">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).</li><li>Weissinger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+in+purified+human+hematopoietic+peripheral-blood+stem+cells+by+means+of+electroporation+without+prestimulation.">Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+transgene+expression+to+antigen-presenting+cells+derived+from+lentivirus-transduced+engrafting+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Blood. 99 (2), 399-408 (2002).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells.">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).</li><li>Sweeney, N. P., Vink, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+lentiviral+vector+genome+size+and+producer+cell+genomic+to+gag-pol+mRNA+ratios+on+packaging+efficiency+and+titre.">The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 574-584 (2021).</li></ol>

研究または臨床目的のために幹細胞を遺伝子改変する能力は、技術およびhESCの生物学の基本的な理解の両方によって制限される。リポフェクションやエレクトロポレーションなど、マウスESCにおいて大きな可能性を示している技術は、従来の方法では遺伝子送達が困難であることで悪名高いhESCにとって非常に効率的ではない20。この概念は、既存の技術の最適化だけでなく...

胚盤胞内部細胞塊に由来するヒト胚性幹細胞(hESC)は多能性であり、in vitro条件下で外的要因に応じて異なる細胞型に分化することができる1,2。hESCの可能性を最大限に引き出すためには、これらの細胞に対して迅速かつ信頼性の高い遺伝子送達方法が不可欠です。従来、使用される技術は、大きく2つのタイプに分類することができる:非ウイルスおよびウイルス遺伝子送達系3、4。より頻繁に使用される非ウイルス遺伝子送達系は、リポフェクション、エレクトロポレーション、およびヌクレオフェクションである。非ウイルス送達系は、挿入変異が少なく、免疫原性の全体的な低下のために有利である5,6。しかしながら、これらの方法は、低いトランスフェクション効率および短い一過性遺伝子発現の持続時間をもたらし、これは長期分化研究のための主要な制限である7。エレクトロポレーションは、リポフェクションと比較してより良いトランスフェクション効率をもたらす。しかしながら、それは50%以上の細胞死をもたらす8、9、10。ヌクレオフェクションを使用すると、リポフェクションとエレクトロポレーションを組み合わせることで細胞の生存率とトランスフェクション効率を向上させることができますが、このアプローチには細胞固有のバッファーと特殊な機器が必要であり、したがって、スケールアップされたアプリケーションにとっては非常にコストがかかります11,12。
対照的に、ウイルスベクターは、形質導入後、改善されたトランスフェクション効率、ならびに全体的な低い細胞毒性を示している。さらに、送達された遺伝子は安定に発現しているため、この方法は長期的な研究に理想的です13。hESCへの遺伝子送達に最も一般的に使用されるウイルスベクターの中には、レンチウイルスベクター(LVS)があり、これは高力価のウイルス粒子14、15を使用して80%以上の形質導入効率を与えることができる。リポフェクションおよびCaPO4 沈殿は、HEK293T細胞またはその誘導体をパッケージングプラスミドとともに遺伝子導入ベクターで一過性にトランスフェクトしてレンチウイルス粒子を作製するために最も一般的に使用される方法の1つである16。リポフェクションは良好なトランスフェクション効率と低い細胞毒性をもたらすが、この技術はそのコストによって妨げられており、高力価のレンチウイルス粒子を得るためにスケールアップすることは非常にコストがかかるであろう。CaPO4 沈殿は、リポフェクションを用いて得られたものと比較的類似したトランスフェクション効率をもたらす。費用対効果は高いものの、CaPO4 沈殿はトランスフェクション後に著しい細胞死をもたらし、標準化を困難にし、バッチ間の変動を回避することを困難にしています17。このシナリオでは、高いトランスフェクション効率、低い細胞毒性、および費用対効果を提供する方法を開発することは、hESCに使用される高力価レンチウイルス粒子の製造にとって極めて重要である。
ポリエチレンイミン(PEI)は、細胞毒性をあまり持たずに高効率でHEK293T細胞をトランスフェクトできるカチオン性ポリマーであり、リポフェクションベースの方法と比較して無視できるコストを有する18。このような状況では、PEIは、様々な技術を用いて培養上清からのレンチウイルス粒子の濃縮を通じて、高力価LVS産生のスケールアップされた用途に使用することができる。提示された論文では、PEIを使用してHEK293T細胞をトランスフェクトし、スクロースクッションを介して超遠心分離を使用してレンチウイルスベクター濃度をトランスフェクトする方法について説明します。この方法を使用して、バッチ間の変動が少ない5 x107 IU/mLをはるかに超える力価を定期的に取得します。この方法は、hESCおよびhESC由来細胞への遺伝子送達のためのスケールアップされたアプリケーションに対して、シンプルで簡単で費用対効果が高い。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C14292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF Recombinant human</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin FRAC V</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Nutrient mix F12&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o: Ca and Mg</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovie serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2118S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Glutamine, 100X&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2924190090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH Polyclonal antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>15707-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH shRNA</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td></td>
			<td>Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR1 complete media</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium 1X CTS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1371201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 2 Supplement 100x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 27 Supplement 50x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-07200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin SOL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLKO.1 TRC vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLL3.7 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene infection reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR1003- G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2.0</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4551/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 
			dihydrochloride&#160;</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin .05% EDTA&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV 939</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3748/10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)

現在のプロトコルは、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびhESCに由来する神経前駆細胞(NPC)の両方に短いヘアピンRNA(shRNA)を高効率で送達するためのレンチウイルス粒子の使用を記載している。レンチウイルス粒子は、低コストのカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を使用してパッケージングプラスミド(pAXおよびpMD2.G)とともに、エントリーベクター(shRNAを担持)を使用してHEK293T細胞を同時トランスフェクトすることによって生成されました。ウイルス粒子を超遠心分離を用いて濃縮し、平均力価が5 x107を超える結果となった。hESCsおよびNPCsは、ピューロマイシン選択およびhESCにおける安定発現、ならびにNPCにおける一過性GFP発現によって示されるように、これらのレンチウイルス粒子を使用して高効率で感染することができる。さらに、ウェスタンブロット解析は、shRNAによって標的とされる遺伝子の発現の有意な減少を示した。さらに、細胞は、CNSの異なる系統へのその後の分化によって証明されるように、それらの多能性ならびに分化能を保持した。現在のプロトコルはshRNAの送達を扱っている。しかし、過剰発現研究のためのcDNAの異所性発現にも同じアプローチが使用できる。

遺伝子導入後、hESCの高い生存率が必然的に要求される。hESCのエレクトロポレーション後の細胞死を減らすためのプロトコルの努力と最適化にもかかわらず、これらの細胞のエレクトロポレーション後には50%以上の細胞死が依然として観察され、トランスフェクション効率は低い20。レンチウイルス媒介遺伝子導入は、遺伝子導入の高効率をもたらすだけでなく、形質導入後...

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Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI

低コストのカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いて、H9ヒト胚性幹細胞(hESC)およびH9由来神経前駆細胞(NPC)においてshRNAを安定的に発現させるレンチウイルス粒子を高効率で製造しました。

低コストカチオン性ポリマーポリエチレンイミン(PEI)を用いたhESCおよびNPCへのshRNAのレンチウイルス媒介送達

The current protocol describes the use of lentiviral particles for the delivery of short hairpin RNAs (shRNAs) to both human embryonic stem cells (hESCs) ...

HEK293T細胞のトランスフェクションは、90%コンフルエントで行わなければならない。また、レンチウイルスベクターろ過用の0.45ミクロンの低タンパク質結合フィルターの使用および超遠心分離用のスクロースクッションの使用も不可欠です。HEK293T細胞を、10%FBSおよび1Xペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM培地中で、5%二酸化炭素および21%酸素の雰囲気の加湿インキュベーター内で、トランスフェクションのために播種する前に細胞が90%コンフルエンシーに達するまで摂氏37度で培養することから始めます。100ミリメートルの組織培養プレート中の10ミリリットルの完全な増殖培地中の6つの細胞を4回10回シードし、5%二酸化炭素および21%酸素の雰囲気を有する加湿組織培養インキュベーター内で一晩増殖させる。トランスフェクションごとに、テキスト原稿に記載されているエントリープラスミドとパッケージングプラスミドの比率に従って、1.5ミリリットル遠心チューブ内の無血清DMEM培地1ミリリットル中のプラスミドDNAストック1ミリリットルあたり1ミリグラムを希釈します。チューブを10秒間ボルテックスし、室温で30秒間Gを10,000回で回転させて集めた。次に、ポリマーポリエチレンイミン(PEI)の原液1ミリリットルあたり1ミリグラムの70マイクロリットルをチューブに加える。再び、渦を巻き、チューブを短時間回転させる。リポフェクタミンベースのトランセクションの場合、ベクターを、キットに供給される45マイクロリットルの試薬Pを含む500マイクロリットルの無血清DMEM培地で希釈する。次いで、500マイクロリットルの同じ培地を用いて70マイクロリットルの試薬Lを希釈する。両方のチューブを室温で5分間インキュベートする。次いで、両方のチューブの内容物を結合し、室温で20分間インキュベートして複合体形成を可能にする。次に、細胞を含むプレートにDNA PEIまたはDNAリポフェクタミン複合体を1ミリリットル滴下し、5%二酸化炭素および21%酸素の雰囲気下で摂氏37度で6時間インキュベートする。インキュベーション後、培地を10ミリリットルの新鮮な完全成長培地と交換し、プレートをインキュベーターに戻します。トランスフェクションの2日後、ウイルス含有培地を収集し、10ミリリットルの新鮮な完全増殖培地で細胞を重ね合わせます。ここでも、トランスフェクションの3日後、ウイルス含有培地を収集し、2日間の時点で収集された培地と組み合わせる。ウイルス上清を2, 000倍Gで4°Cで10分間遠心分離し、細胞破片をペレット化する。0.45ミクロンの孔径の低いタンパク質結合フィルターを使用して上清をろ過し、超遠心分離の準備ができるまで摂氏4度で保存します。超遠心チューブの保持カップを70%エタノールで10分間洗浄して滅菌します。カップを風乾し、閉じて、摂氏4度に置きます。レンチウイルス粒子を含む濾過培地で36ミリリットルを滅菌超遠心チューブに加える。5ミリリットルの滅菌ストリペットをPBSで調製した4ミリリットルの滅菌20%スクロース溶液で満たし、レンチウイルスベクターまたはLVSを含むチューブの底に分配する。スクロース溶液を媒体と混合してはならず、チューブの底に勾配を作るようにしてください。無血清DMEM培地を使用してすべての超遠心チューブのバランスを取り、チューブを冷たい超遠心チューブ保持カップに入れ、蓋を閉めます。チューブを125, 000倍のGで4°Cで2時間回転させます。スピン後、ペレットを乱すことなく漂白剤を入れた容器にチューブの内容物を反転させて上清を慎重に捨てる。ペレットが表示されている場合はマークを付けます。超遠心チューブを50ミリリットルの滅菌チューブに入れ、ペレットの上部に200マイクロリットルの滅菌DPBSを加える。一晩でチューブを摂氏4度に置きます。翌日、卓上遠心分離機で13,000倍Gで回転する前に、チューブの内容物を上下にピペッティングして穏やかに混合し、破片をペレット化する。上清を新しいチューブに移し、ウイルス調製物をアリコートする。最後に、チューブをマイナス80°Cで保管します。トランスフェクション後、HEK293T細胞において豊富なGFP発現が観察された。ウイルスタンパク質の発現は、単一細胞が融合したHEK293T細胞の合胞体形成をもたらした。感染後、ウイルス感染神経前駆細胞においてもGFPの顕著な発現が観察された。低コストPEIとリポフェクタミン3000試薬との間のLVS力価測定は、ウイルス力価に有意差を示さなかった。PLK 0.1ベースのベクターのウイルス力価をここに示します。レンチウイルス形質移入細胞は、非形質導入細胞と比較して80%以上の細胞生存率を示したが、治療を生き延びた細胞はなかった。ウェスタンブロット分析は、空のベクター骨格で形質導入された細胞におけるL-2-ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼの豊富な発現を示した。しかしながら、短いヘアピン型RNAを有するベクターで形質導入された細胞では発現は認められなかった。この技術の主な利点は、低コストのカチオン性ポリマーポリエチレンイミンを使用して、エントリーベクターおよびパッケージングベクターを使用してHEK293T細胞を同時トランスフェクトすることによってレンチウイルス粒子を製造することです。

Research

JoVE Journal

Biology

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI)

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

MRイメージングと生体内追跡非侵襲のための酸化鉄ナノ粒子で標識ヒトES細胞とhMSCs

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

生物学

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

MEFの存在下で継代ヒトES細胞：MEFをから私をマトリゲルする

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
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From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

マトリゲル上のMEFから分割ヒトES細胞：MEFのからマトリゲル2〜

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

マトリゲル上にマトリゲルからの継代ヒトES細胞：MEFのからマトリゲル3〜

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で</emヒト造血幹細胞の>赤血球

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

カチオン性リポソームを介した特異的siRNAの再配達によるマウスの肺におけるIntersectin-1Sの長期サイレン。電子顕微鏡によるノックダウン効果の評価

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

エピジェネティックリプログラミングによるヒトES細胞からMyospheresの生成

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

齧歯類精巣上体精子のリン酸化ペプチドの分析

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...