Name: lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)
Uploaded: 2022-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av forskningsstipend fra De forente arabiske emirater University (UAEU), stipend # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) og # 12R010 (UAEU-AUA stipend). Vi takker professor Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) for å hjelpe oss med å redigere manuskriptet for stil og grammatikk.
Alle data er tilgjengelig på forespørsel.

1. Transfeksjon av HEK293T-celler ved bruk av enten PEI eller Lipofectamine 3000 reagens
<ol><li>Kultur HEK293T-celler i DMEM + 10% FBS + 1x penicillin / streptomycin ved 37 ° C i en fuktet inkubator med en atmosfære på 5% CO2 og 21% O2 til de er 90% sammenflytende før såing for transfeksjon. Bruk et relativt lavt passasje antall celler for høy titervirusproduksjon (ideelt mindre enn P30).</li>
	<li>Frø 4 x 106 celler i 10 ml komplett vekstmedium i en 100 mm vevs...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+Somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).</li><li>Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+and+gene+therapy.">Human embryonic stem cells and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).</li><li>Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+nonviral+gene+delivery+and+its+role+in+pluripotent+stem+cell+engineering.">Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).</li><li>Li, S. D., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+is+superior+to+viral+gene+delivery.">Nonviral is superior to viral gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).</li><li>Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery+systems:+From+simple+transfection+agents+to+artificial+viruses.">Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li><li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+human+embryonic+stem+cells:+Small+and+macromolecule+loading+and+DNA+transfection.">Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection.</a> Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).</li><li>Sukhorukov, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+high-intensity+field+pulses:+Strategies+for+improving+robustness+and+performance+of+electrotransfection+and+electrofusion.">Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion.</a> The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).</li><li>Floch, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+phosphonolipids+as+non+viral+vectors+for+DNA+transfection+in+hematopoietic+cell+lines+and+CD34++cells.">Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).</li><li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells.">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).</li><li>Siemen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).</li><li>Zhang, X., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+in+tissue+engineering.">Viral vectors for gene delivery in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).</li><li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors.">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li><li>Gropp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+genetic+modification+of+human+embryonic+stem+cells+by+lentiviral+vectors.">Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).</li><li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors.">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).</li><li>Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors.">Production of lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 3, 16017 (2016).</li><li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., G&#246;pferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+nonviral+gene+delivery+systems.">Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li><li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation+during+in-vitro+human+embryonic+cortical+neurogenesis.">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).</li><li>Weissinger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+in+purified+human+hematopoietic+peripheral-blood+stem+cells+by+means+of+electroporation+without+prestimulation.">Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+transgene+expression+to+antigen-presenting+cells+derived+from+lentivirus-transduced+engrafting+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Blood. 99 (2), 399-408 (2002).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells.">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).</li><li>Sweeney, N. P., Vink, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+lentiviral+vector+genome+size+and+producer+cell+genomic+to+gag-pol+mRNA+ratios+on+packaging+efficiency+and+titre.">The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 574-584 (2021).</li></ol>

Evnen til å genmodifisere stamceller for studier eller kliniske formål er begrenset både av teknologi og grunnleggende forståelse av biologien til hESCs. Teknikker som har vist betydelig potensial i muse-ESC, som fettinfeksjon og elektroporering, er ikke svært effektive for hESCs, som er notorisk vanskelig for genlevering ved konvensjonelle metoder20. Denne oppfatningen har ført til ikke bare optimalisering av eksisterende teknikker, men også utvikling av nye metoder for økt transfeksjonse...

Humane embryonale stamceller (hESC) avledet fra blastocystens indre cellemasse er pluripotente og kan differensieres til forskjellige celletyper avhengig av eksterne faktorer under in vitro-tilstander 1,2. For å fullt ut utnytte potensialet til hESCs, er det viktig å ha raske og pålitelige genleveringsmetoder for disse cellene. Konvensjonelt kan teknikkene som brukes grovt klassifiseres i to typer: ikke-smittsomme og virale genleveringssystemer 3,4. De hyppigere brukte ikke-smittsomme genleveringssystemene er fettinfeksjon, elektroporering og nukleofeksjon. Ikke-miljømessige leveringssystemer er fordelaktige på grunn av færre innsettingsmutasjoner og en generell reduksjon i immunogenisitet 5,6. Imidlertid resulterer disse metodene i lav transfeksjonseffektivitet og kort varighet av forbigående genuttrykk, noe som er en stor begrensning for langsiktige differensieringsstudier7. Elektroporering resulterer i bedre transfeksjonseffektivitet sammenlignet med fettinfeksjon; Det resulterer imidlertid i mer enn 50% celledød 8,9,10. Ved hjelp av nukleofeksjon kan celleoverlevelsen og transfeksjonseffektiviteten forbedres ved å kombinere fettinfeksjon og elektroporering, men tilnærmingen trenger cellespesifikke buffere og spesialutstyr og blir dermed ganske kostbar for oppskalerte applikasjoner11,12.
I motsetning til dette har virale vektorer vist forbedret transfeksjonseffektivitet, samt generell lav cytotoksisitet, etter transduksjon. I tillegg er genene som leveres stabilt uttrykt og dermed gjør denne metoden ideell for langsiktige studier13. Blant de mest brukte virale vektorene for genlevering i hESC er lentivirale vektorer (LVS), som kan gi mer enn 80% transduksjonseffektivitet ved bruk av høye titerviruspartikler14,15. Fettinfeksjon og CaPO 4-utfelling er blant de mest brukte metodene for å forbigående transfektere HEK293T-celler eller dets derivater med genoverføringsvektorer sammen med emballasjeplasmider for å gi lentivirale partikler16. Selv om fettinfeksjon resulterer i god transfeksjonseffektivitet og lav cytotoksisitet, hindres teknikken av kostnadene, og oppskalering for å få høye titer lentivirale partikler vil være svært kostbart. CaPO 4-utfelling resulterer i relativt lik transfeksjonseffektivitet som de som oppnås ved bruk av fettinfeksjon. Selv omdet er kostnadseffektivt, resulterer CaPO 4-utfelling i betydelig celledød etter transfeksjoner, noe som gjør det vanskelig å standardisere og unngå batch-til-batch-variasjoner17. I dette scenariet er utvikling av en metode som gir høy transfeksjonseffektivitet, lav cytotoksisitet og kostnadseffektivitet avgjørende for produksjon av lentivirale partikler med høy titer som skal brukes i hESC.
Polyetylenimine (PEI) er en kationisk polymer som kan transfektere HEK293T-celler med høy effektivitet uten mye cytotoksisitet og har en ubetydelig kostnad sammenlignet med lipofeksjonsbaserte metoder18. I denne situasjonen kan PEI brukes til oppskalerte anvendelser av høy titer LVS-produksjon gjennom konsentrasjon av lentivirale partikler fra kultursupernatanter ved hjelp av forskjellige teknikker. Den presenterte artikkelen beskriver bruken av PEI til å transfektere HEK293T-celler og lentivirale vektorkonsentrasjon ved bruk av ultrasentrifugering gjennom en sukrosepute. Ved hjelp av denne metoden får vi regelmessig titere godt over 5 x 107 IE / ml med lave batch-til-batch-variasjoner. Metoden er enkel, rett frem og kostnadseffektiv for oppskalerte applikasjoner for genlevering til hESCs og hESCs-avledede celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C14292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF Recombinant human</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin FRAC V</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Nutrient mix F12&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o: Ca and Mg</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovie serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2118S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Glutamine, 100X&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2924190090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH Polyclonal antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>15707-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH shRNA</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td></td>
			<td>Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR1 complete media</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium 1X CTS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1371201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 2 Supplement 100x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 27 Supplement 50x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-07200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin SOL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLKO.1 TRC vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLL3.7 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene infection reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR1003- G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2.0</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4551/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 
			dihydrochloride&#160;</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin .05% EDTA&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV 939</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3748/10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)

Den nåværende protokollen beskriver bruken av lentivirale partikler for levering av kort hårnålsRNA (shRNA) til både humane embryonale stamceller (hESC) samt nevrale stamceller (NPC) avledet fra hESCs ved høy effektivitet. Lentivirale partikler ble generert ved å co-transfektere HEK293T-celler ved hjelp av inngangsvektorer (bærer shRNA) sammen med emballasjeplasmider (pAX og pMD2.G) ved bruk av lavpris kationisk polymerpolyetylenimine (PEI). Viruspartikler ble konsentrert ved hjelp av ultrasentrifugering, noe som resulterte i gjennomsnittlige titere over 5 x 107. Både hESC og NPC kan infiseres med høy effektivitet ved bruk av disse lentivirale partiklene, som vist ved puromycinvalg og stabilt uttrykk i hESC, samt forbigående GFP-uttrykk i NPCer. Videre viste western blot-analyse en signifikant reduksjon i uttrykket av gener målrettet av shRNA. I tillegg beholdt cellene sin pluripotens så vel som differensieringspotensial, som det fremgår av deres etterfølgende differensiering i forskjellige linjer av CNS. Den nåværende protokollen omhandler levering av shRNA; Den samme tilnærmingen kan imidlertid brukes til ektopisk ekspresjon av cDNA for overekspresjonsstudier.

Etter genoverføring er det uunngåelig nødvendig med høy levedyktighet av hESCs. Til tross for innsatsen og optimaliseringen av protokoller for å redusere celledød etter elektroporering av hESCs, observeres fortsatt mer enn 50% celledød etter elektroporering av disse cellene, sammen med lav transfeksjonseffektivitet20. Lentiviralmediert genoverføring resulterer ikke bare i høy effektivitet av genoverføring, men demonstrerer også høye nivåer av celle levedyktighet etter transduksjon. Re...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI at JoVE.com

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI

Ved hjelp av lavkost kationisk polymerpolyetylenimine (PEI) produserte vi lentivirale partikler for stabilt uttrykk av shRNA i H9 humane embryonale stamceller (hESCs) og forbigående transducerte H9-avledede nevrale stamceller (NPC) ved høy effektivitet.

Lentiviralmediert levering av shRNA til hESC og NPC ved bruk av lavpris kationisk polymerpolyetylenimine (PEI)

The current protocol describes the use of lentiviral particles for the delivery of short hairpin RNAs (shRNAs) to both human embryonic stem cells (hESCs) ...

Transfeksjon av HEK293T-celler må utføres ved 90% sammenløp. Også bruk av et 0, 45 mikron lavt proteinbindingsfilter for lentivirale vektorfiltrering og bruk av en sukrosepute for ultracentrifugering er avgjørende. Begynn med å dyrke HEK293T-celler i DMEM-medium som inneholder 10% FBS og 1X penicillin streptomycin ved 37 grader Celsius i en fuktet inkubator med en atmosfære på 5% karbondioksid og 21% oksygen til cellene når 90% sammenløp før såing for transfeksjon.Frø fire ganger 10 til de seks cellene i 10 milliliter komplett vekstmedium i en 100 millimeter vevskulturplate og vokser over natten i en fuktet vevskulturinkubator med en atmosfære på 5% karbondioksid og 21% oksygen. For hver transfeksjon fortynnes en milligram per milliliter plasmid-DNA-lagre i en milliliter serumfrie DMEM-medier i 1,5 milliliter sentrifugerør ved å følge forholdet mellom inngangs- og emballasjeplasmider som beskrevet i tekstmanuskriptet. Vortex røret i 10 sekunder og spinn ved 10.000 ganger G i 30 sekunder ved romtemperatur for å samle.Deretter tilsettes 70 mikroliter på en milligram per milliliter lagerløsning av polymerpolyetylenimin, eller PEI, til røret. Igjen, vortex og kort spinn røret. For lipofectamine-basert transseksjon, fortynn vektorene i 500 mikroliter serumfrie DMEM-medier som inneholder 45 mikroliter reagens P levert i settet.Fortynn deretter 70 mikroliter reagens L ved bruk av 500 mikroliter av samme medium. Inkuber begge rørene ved romtemperatur i fem minutter. Deretter kombinerer du innholdet i begge rørene og inkuberer ved romtemperatur i 20 minutter for å tillate kompleksdannelse.Deretter legger du dråpevis en milliliter DNA PEI eller DNA lipofectamine komplekser til platen som inneholder celler og inkuberer i seks timer ved 37 grader Celsius med en atmosfære på 5% karbondioksid og 21% oksygen. Etter inkubering, erstatt mediet med 10 ml friskt komplett vekstmedium og returner platen til inkubatoren. Etter to dager med transfeksjon, samle virusholdige medier og legg over cellene med 10 milliliter fersk komplett vekstmedium.Igjen, etter tre dager med transfeksjon, samle det virusholdige mediet og kombiner det med media samlet på to-dagers tidspunkt. Sentrifuger den virale supernatanten ved 2.000 ganger G i 10 minutter ved fire grader Celsius til pelletcellulært rusk. Filtrer supernatanten ved hjelp av et 0,45 mikron porestørrelsesfilter med lav proteinbinding og lagre ved fire grader Celsius til det er klart for ultrasentrifugering.Steriliser ultracentrifugerørenes holdekopper ved å vaske med 70% etanol i 10 minutter. Lufttørk, lukk og plasser koppene ved fire grader Celsius. Tilsett 36 milliliter ved filtrerte medier som inneholder lentivirale partikler til et sterilt ultracentrifugerør.Fyll fem milliliter av en steril stripette med fire milliliter steril 20% sukroseoppløsning fremstilt i PBS og dispenser den til bunnen av røret som inneholder lentivirale vektorer, eller LVS. Sørg for at sukroseoppløsningen ikke skal blandes med mediet og lager en gradient i bunnen av røret. Balanser alle ultracentrifugerørene ved hjelp av serumfrie DMEM-medier, plasser rørene i kalde ultracentrifugerør som holder kopper, og lukk lokkene.Spinn rørene ved 125.000 ganger G i to timer ved fire grader Celsius. Etter spinnet, kast forsiktig supernatanten ved å invertere innholdet i røret i en beholder som inneholder blekemiddel uten å forstyrre pelleten. Merk pelleten hvis den er synlig.Plasser ultracentrifugerøret i et 50 milliliter sterilt rør og tilsett 200 mikroliter steril DPBS på toppen av pelleten. Plasser røret på fire grader Celsius over natten. Dagen etter blander du forsiktig innholdet i et rør ved å pipettere opp og ned før du spinner på 13.000 ganger G i en bordplate sentrifuge for å pelletere rusk.Overfør supernatanten til et nytt rør og aliquot viruspreparatet. Til slutt lagrer du rørene ved minus 80 grader Celsius. Etter transfeksjon ble det observert rikelig GFP-ekspresjon i HEK293T-celler.Ekspresjonen av virale proteiner resulterte i synkytidannelse av HEK293T-celler hvor enkeltceller smeltes sammen. Etter infeksjon ble det også observert markert uttrykk for GFP i virusinfiserte nevrale stamceller. LVS titermåling mellom lavpris PEI og lipofectamine 3000 reagens viste ingen signifikant forskjell i viral titer.Virale titere for PLK 0,1-baserte vektorer er vist her. Lentivirale transfekterte celler viste mer enn 80% celle levedyktighet sammenlignet med ikke-transducerte celler, mens ingen celler overlevde behandlingen. Western blot-analyse viste rikelig ekspresjon av L-2-hydroksyglutaratdehydrogenase i celler transducert med en tom vektorryggrad.Imidlertid ble det ikke observert noe uttrykk i celler transducert med en vektor som bærer korte hårnåls-RNA. Den største fordelen med denne teknikken er bruken av billig kationisk polymerpolyetylenimin for å produsere lentivirale partikler ved å transfektere HEK293T-celler ved bruk av inngangs- og emballasjevektorer.

Research

JoVE Journal

Biology

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI)

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Generasjon av menneskeskapte pluripotente stamceller fra perifert blod Bruke STEMCCA lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Langsiktig stanse av Intersectin-1s i muselunger etter Gjentatt Levering av en spesifikk siRNA via Kationiske Liposomes. Evaluering av Knockdown Effekter av elektronmikroskopi

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Bruke coculture å oppdage Kjemisk mediert uspesifikt Interaksjoner

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generering av Myospheres Fra hESCs av Epigenetic Omprogrammering

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Phosphopeptide Analyse av gnagere bitestiklenes Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...