Name: lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)
Uploaded: 2022-05-24T15:00:00
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Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la Universidad de los Emiratos Árabes Unidos (UAEU), la subvención # 31R170 (Centro Zayed de Ciencias de la Salud) y # 12R010 (beca UAEU-AUA). Agradecemos al profesor Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) por ayudarnos a editar el manuscrito por estilo y gramática.
Todos los datos están disponibles bajo petición.

1. Transfección de células HEK293T utilizando el reactivo PEI o Lipofectamine 3000
<ol><li>Cultivo de células HEK293T en DMEM + 10% FBS + 1x penicilina/estreptomicina a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% co2 y 21% O2 hasta que sean 90% confluentes antes de la siembra para transfección. Utilice un número relativamente bajo de células de paso para la producción de virus de alto título (idealmente menos de P30).</li>
	<li>Sembrar 4 x 106...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+Somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).</li><li>Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+and+gene+therapy.">Human embryonic stem cells and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).</li><li>Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+nonviral+gene+delivery+and+its+role+in+pluripotent+stem+cell+engineering.">Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).</li><li>Li, S. D., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+is+superior+to+viral+gene+delivery.">Nonviral is superior to viral gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).</li><li>Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery+systems:+From+simple+transfection+agents+to+artificial+viruses.">Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li><li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+human+embryonic+stem+cells:+Small+and+macromolecule+loading+and+DNA+transfection.">Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection.</a> Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).</li><li>Sukhorukov, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+high-intensity+field+pulses:+Strategies+for+improving+robustness+and+performance+of+electrotransfection+and+electrofusion.">Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion.</a> The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).</li><li>Floch, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+phosphonolipids+as+non+viral+vectors+for+DNA+transfection+in+hematopoietic+cell+lines+and+CD34++cells.">Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).</li><li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells.">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).</li><li>Siemen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).</li><li>Zhang, X., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+in+tissue+engineering.">Viral vectors for gene delivery in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).</li><li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors.">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li><li>Gropp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+genetic+modification+of+human+embryonic+stem+cells+by+lentiviral+vectors.">Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).</li><li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors.">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).</li><li>Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors.">Production of lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 3, 16017 (2016).</li><li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., G&#246;pferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+nonviral+gene+delivery+systems.">Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li><li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation+during+in-vitro+human+embryonic+cortical+neurogenesis.">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).</li><li>Weissinger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+in+purified+human+hematopoietic+peripheral-blood+stem+cells+by+means+of+electroporation+without+prestimulation.">Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+transgene+expression+to+antigen-presenting+cells+derived+from+lentivirus-transduced+engrafting+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Blood. 99 (2), 399-408 (2002).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells.">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).</li><li>Sweeney, N. P., Vink, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+lentiviral+vector+genome+size+and+producer+cell+genomic+to+gag-pol+mRNA+ratios+on+packaging+efficiency+and+titre.">The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 574-584 (2021).</li></ol>

La capacidad de modificar genéticamente las células madre con fines de estudio o clínicos está limitada tanto por la tecnología como por la comprensión básica de la biología de las hESC. Las técnicas que han mostrado un potencial significativo en las ESC de ratón, como la lipofección y la electroporación, no son altamente eficientes para las hESC, que son notoriamente difíciles para la administración de genes por métodos convencionales20. Esta noción ha llevado no solo a la optimiz...

Las células madre embrionarias humanas (hESCs) derivadas de la masa celular interna del blastocisto son pluripotentes y pueden diferenciarse en diferentes tipos de células dependiendo de factores externos en condiciones in vitro 1,2. Con el fin de aprovechar plenamente el potencial de las hESC, es imperativo contar con métodos de administración de genes rápidos y confiables para estas células. Convencionalmente, las técnicas utilizadas se pueden clasificar ampliamente en dos tipos: sistemas de administración de genes no virales y virales 3,4. Los sistemas de administración de genes no virales más utilizados son la lipofección, la electroporación y la nucleofección. Los sistemas de administración no viral son ventajosos debido a la menor cantidad de mutaciones de inserción y una disminución general de la inmunogenicidad 5,6. Sin embargo, estos métodos dan como resultado una baja eficiencia de transfección y una corta duración de la expresión génica transitoria, lo que es una limitación importante para los estudios de diferenciación a largo plazo7. La electroporación da como resultado mejores eficiencias de transfección en comparación con la lipofección; sin embargo, resulta en más del 50% de muerte celular 8,9,10. Utilizando la nucleofection, la supervivencia celular y la eficiencia de la transfección se pueden mejorar combinando lipofección y electroporación, pero el enfoque necesita tampones específicos de la célula y equipos especializados y, por lo tanto, se vuelve bastante costoso para aplicaciones ampliadas11,12.
Por el contrario, los vectores virales han mostrado una mejora en la eficiencia de la transfección, así como una baja citotoxicidad general, después de la transducción. Además, los genes entregados se expresan de manera estable y, por lo tanto, hacen que este método sea ideal para estudios a largo plazo13. Entre los vectores virales más utilizados para la entrega de genes en hESCs se encuentran los vectores lentivirales (LVS), que pueden dar más del 80% de eficiencia de transducción utilizando partículas virales de alto título14,15. La lipofección y la precipitación de CaPO4 se encuentran entre los métodos más utilizados para transfectar transitoriamente las células HEK293T o sus derivados con vectores de transferencia de genes junto con plásmidos de empaquetamiento para producir partículas lentivirales16. Aunque la lipofección da como resultado una buena eficiencia de transfección y una baja citotoxicidad, la técnica se ve obstaculizada por su costo, y la ampliación para obtener partículas lentivirales de alto título sería muy costosa. La precipitación de CaPO4 da como resultado eficiencias de transfección relativamente similares a las obtenidas mediante lipofección. Aunque rentable, la precipitación de CaPO4 resulta en una muerte celular significativa después de las transfecciones, lo que dificulta la estandarización y evitar variaciones de lote a lote17. En este escenario, el desarrollo de un método que brinde una alta eficiencia de transfección, baja citotoxicidad y rentabilidad es crucial para la producción de partículas lentivirales de alto título que se utilizarán en hESC.
La polietilenimina (PEI) es un polímero catiónico que puede transfectar células HEK293T a alta eficiencia sin mucha citotoxicidad y tiene un costo insignificante en comparación con los métodos basados en lipofección18. En esta situación, pei se puede utilizar para aplicaciones ampliadas de producción de LVS de alto título a través de la concentración de partículas lentivirales de sobrenadantes de cultivo utilizando diversas técnicas. El artículo presentado describe el uso de PEI para transfectar células HEK293T y la concentración de vectores lentivirales utilizando ultracentrifugación a través de un cojín de sacarosa. Usando este método, obtenemos regularmente títulos muy por encima de 5 x 107 UI / ml con bajas variaciones de lote a lote. El método es simple, directo y rentable para aplicaciones ampliadas para la entrega de genes a células derivadas de hESCs y hESCs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C14292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF Recombinant human</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin FRAC V</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Nutrient mix F12&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o: Ca and Mg</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovie serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2118S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Glutamine, 100X&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2924190090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH Polyclonal antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>15707-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH shRNA</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td></td>
			<td>Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR1 complete media</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium 1X CTS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1371201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 2 Supplement 100x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 27 Supplement 50x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-07200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin SOL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLKO.1 TRC vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLL3.7 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene infection reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR1003- G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2.0</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4551/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 
			dihydrochloride&#160;</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin .05% EDTA&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV 939</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3748/10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)

El protocolo actual describe el uso de partículas lentivirales para la entrega de ARN de horquilla corta (shRNA) tanto a células madre embrionarias humanas (hESC) como a células progenitoras neurales (NPC) derivadas de hESCs de alta eficiencia. Las partículas lentivirales se generaron mediante la co-transfección de células HEK293T utilizando vectores de entrada (portadores de shRNAs) junto con plásmidos de empaquetamiento (pAX y pMD2.G) utilizando el polímero catiónico de bajo costo polietilinimina (PEI). Las partículas virales se concentraron mediante ultracentrifugación, lo que dio lugar a títulos medios superiores a 5 x 107. Tanto las hESC como las NPC podrían infectarse a altas eficiencias utilizando estas partículas lentivirales, como lo demuestra la selección de puromicina y la expresión estable en las hESC, así como la expresión transitoria de GFP en las NPC. Además, el análisis de Western Blot mostró una reducción significativa en la expresión de genes dirigidos por shRNAs. Además, las células conservaron su pluripotencia, así como su potencial de diferenciación, como lo demuestra su posterior diferenciación en diferentes linajes del SNC. El protocolo actual se ocupa de la entrega de shRNAs; sin embargo, el mismo enfoque podría utilizarse para la expresión ectópica de los ADNc para los estudios de sobreexpresión.

Después de la transferencia de genes, inevitablemente se requiere una alta viabilidad de hESCs. A pesar de los esfuerzos y la optimización de los protocolos para reducir la muerte celular después de la electroporación de hESCs, más del 50% de la muerte celular todavía se observa después de la electroporación de estas células, junto con la baja eficiencia de transfección20. La transferencia de genes mediada por lentivirales no solo resulta en una alta eficiencia de transferencia de genes,...

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Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI

Utilizando el polímero catiónico de bajo costo polietilenimina (PEI), producimos partículas lentivirales para la expresión estable de shRNAs en células madre embrionarias humanas H9 (hESC) y células progenitoras neurales derivadas de H9 (NPC) transducidas transitoriamente con alta eficiencia.

Administración mediada por lentiviral de shRNAs a hESCs y NPCs usando polietileno de polímero catiónico de bajo costo (PEI)

The current protocol describes the use of lentiviral particles for the delivery of short hairpin RNAs (shRNAs) to both human embryonic stem cells (hESCs) ...

La transfección de células HEK293T debe realizarse al 90% de confluencia. Además, el uso de un filtro de baja unión a proteínas de 0,45 micras para la filtración de vectores lentivirales y el uso de un cojín de sacarosa para la ultracentrifugación son esenciales. Comience cultivando células HEK293T en medio DMEM que contenga 10% FBS y 1X de estreptomicina de penicilina a 37 grados Celsius en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y 21% de oxígeno hasta que las células alcancen el 90% de confluencia antes de la siembra para la transfección.Sembrar cuatro veces 10 a las seis células en 10 mililitros de medio de crecimiento completo en una placa de cultivo de tejido de 100 milímetros y crecer durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados con una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y 21% de oxígeno. Para cada transfección, diluya un miligramo por mililitro de existencias de ADN plásmido en un mililitro de medios DMEM sin suero en tubos centrífugos de 1,5 mililitros siguiendo la proporción de plásmidos de entrada y envasado como se describe en el manuscrito de texto. Vórtice el tubo durante 10 segundos y gire a 10, 000 veces G durante 30 segundos a temperatura ambiente para recoger.Luego, agregue 70 microlitros de un miligramo por mililitro de solución madre de polietilenoimina polimérica, o PEI, al tubo. De nuevo, vórtice y gire brevemente el tubo. Para la transección a base de lipofectamina, diluya los vectores en 500 microlitros de medios DMEM sin suero que contengan 45 microlitros de reactivo P suministrados en el kit.Luego, diluya 70 microlitros de reactivo L usando 500 microlitros del mismo medio. Incubar ambos tubos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego, combine el contenido de ambos tubos e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir la formación compleja.A continuación, agregue un mililitro de PEI de ADN o complejos de lipofectamina de ADN a la placa que contiene células e incube durante seis horas a 37 grados Celsius con una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y 21% de oxígeno. Después de la incubación, reemplace el medio con 10 mililitros de medios de crecimiento completos frescos y devuelva la placa a la incubadora. Después de dos días de transfección, recoja los medios que contienen el virus y superponga las células con 10 mililitros de medios de crecimiento completos frescos.Una vez más, después de tres días de transfección, recoja los medios que contienen el virus y combínelos con los medios recolectados en el punto de tiempo de dos días. Centrifugar el sobrenadante viral a 2.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para granular los desechos celulares. Filtre el sobrenadante utilizando un filtro de baja unión a proteínas de tamaño de poro de 0,45 micras y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para la ultracentrifugación.Esterilizar las tazas de sujeción de los tubos de la ultracentrífuga lavándolas con etanol al 70% durante 10 minutos. Seque al aire, cierre y coloque las tazas a cuatro grados centígrados. Agregue 36 mililitros en medios filtrados que contengan partículas lentivirales a un tubo de ultracentrífuga estéril.Llene cinco mililitros de una stripette estéril con cuatro mililitros de solución estéril de sacarosa al 20% preparada en PBS y dispensarla al fondo del tubo que contiene vectores lentivirales, o LVS. Asegúrese de que la solución de sacarosa no se mezcle con el medio y haga un gradiente en la parte inferior del tubo. Equilibre todos los tubos de ultracentrífuga utilizando medios DMEM sin suero, coloque los tubos en vasos de retención de tubos de ultracentrífuga fríos y cierre las tapas.Gire los tubos a 125, 000 veces G durante dos horas a cuatro grados Centígrados. Después del centrifugado, deseche cuidadosamente el sobrenadante invirtiendo el contenido del tubo en un recipiente que contenga lejía sin molestar el pellet. Marque el pellet si es visible.Coloque el tubo de la ultracentrífuga en un tubo estéril de 50 mililitros y agregue 200 microlitros de DPBS estéril en la parte superior del pellet. Coloque el tubo a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, mezcle suavemente el contenido de un tubo mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo antes de girar a 13, 000 veces G en una centrífuga de mesa para granular cualquier residuo.Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y alícue la preparación del virus. Finalmente, guarde los tubos a menos 80 grados centígrados. Después de la transfección, se observó una abundante expresión de GFP en las células HEK293T.La expresión de proteínas virales dio lugar a la formación de sincitia de células HEK293T donde se fusionan células individuales. Después de la infección, también se observó una marcada expresión de GFP en células progenitoras neurales infectadas por virus. La medición del título de LVS entre el PEI de bajo costo y el reactivo de lipofectamina 3000 no mostró ninguna diferencia significativa en el título viral.Los títulos virales para vectores basados en PLK 0.1 se muestran aquí. Las células transfectadas lentivirales mostraron más del 80% de viabilidad celular en comparación con las células no transducidas, mientras que ninguna célula sobrevivió al tratamiento. El análisis de Western blot mostró una abundante expresión de L-2-hidroxiglutarato deshidrogenasa en células transducidas con una columna vertebral vectorial vacía.Sin embargo, no se observó expresión en células transducidas con un vector portador de ARN de horquilla corta. La principal ventaja de esta técnica es el uso de polietilenomimina de polímero catiónico de bajo costo para producir partículas lentivirales mediante la coinfectación de células HEK293T utilizando vectores de entrada y empaquetamiento.

Research

JoVE Journal

Biology

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI)

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Etiquetado y hESCs hMSCs con nanopartículas de óxido de hierro para no invasivo en el seguimiento in vivo mediante RM

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Investigación

Biología

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

Desde que me MEFs Matrigel: hESCs pases en la presencia de MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
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From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

Desde MEFs a Matrigel 2: La división de hESCs MEFs en Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Desde MEFs a Matrigel 3: hESCs pases de Matrigel en Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral mediada por derribo Durante Ex Vivo Eritropoyesis de las células estaminales hematopoyéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Usando Coculture detectar químicamente mediadas por interacciones interespecíficas

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generación de Myospheres De hESCs por epigenética Reprogramación

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Análisis Phosphopeptide de roedores epidídimo Espermatozoides

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...