Name: lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)
Uploaded: 2022-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI at JoVE.com

Detta arbete stöddes av forskningsbidrag från Förenade Arabemiratens universitet (UAEU), bidrag # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) och # 12R010 (UAEU-AUA-bidrag). Vi tackar prof Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) för att ha hjälpt oss att redigera manuskriptet för stil och grammatik.
Alla uppgifter är tillgängliga på begäran.

1. Transfektion av HEK293T-celler med antingen PEI- eller Lipofectamine 3000-reagens
<ol><li>Odla HEK293T-celler i DMEM + 10% FBS + 1x penicillin / streptomycin vid 37 ° C i en fuktad inkubator med en atmosfär av 5% CO2 och 21%O2 tills de är 90% sammanflytande före sådd för transfektion. Använd ett relativt lågt passageantal celler för hög titervirusproduktion (helst mindre än P30).</li>
	<li>Frö 4 x 106 celler i 10 ml fullständigt tillväxtmedium i en 100 ...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+Somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).</li><li>Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+and+gene+therapy.">Human embryonic stem cells and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).</li><li>Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+nonviral+gene+delivery+and+its+role+in+pluripotent+stem+cell+engineering.">Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).</li><li>Li, S. D., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+is+superior+to+viral+gene+delivery.">Nonviral is superior to viral gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).</li><li>Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery+systems:+From+simple+transfection+agents+to+artificial+viruses.">Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li><li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+human+embryonic+stem+cells:+Small+and+macromolecule+loading+and+DNA+transfection.">Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection.</a> Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).</li><li>Sukhorukov, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+high-intensity+field+pulses:+Strategies+for+improving+robustness+and+performance+of+electrotransfection+and+electrofusion.">Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion.</a> The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).</li><li>Floch, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+phosphonolipids+as+non+viral+vectors+for+DNA+transfection+in+hematopoietic+cell+lines+and+CD34++cells.">Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).</li><li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells.">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).</li><li>Siemen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).</li><li>Zhang, X., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+in+tissue+engineering.">Viral vectors for gene delivery in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).</li><li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors.">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li><li>Gropp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+genetic+modification+of+human+embryonic+stem+cells+by+lentiviral+vectors.">Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).</li><li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors.">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).</li><li>Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors.">Production of lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 3, 16017 (2016).</li><li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., G&#246;pferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+nonviral+gene+delivery+systems.">Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li><li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation+during+in-vitro+human+embryonic+cortical+neurogenesis.">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).</li><li>Weissinger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+in+purified+human+hematopoietic+peripheral-blood+stem+cells+by+means+of+electroporation+without+prestimulation.">Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+transgene+expression+to+antigen-presenting+cells+derived+from+lentivirus-transduced+engrafting+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Blood. 99 (2), 399-408 (2002).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells.">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).</li><li>Sweeney, N. P., Vink, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+lentiviral+vector+genome+size+and+producer+cell+genomic+to+gag-pol+mRNA+ratios+on+packaging+efficiency+and+titre.">The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 574-584 (2021).</li></ol>

Förmågan att genetiskt modifiera stamceller för studier eller kliniska ändamål begränsas både av teknik och den grundläggande förståelsen för hESCs biologi. Tekniker som har visat betydande potential i mus-ESC, som lipofektion och elektroporering, är inte särskilt effektiva för hESC, som är notoriskt svåra för genleverans med konventionella metoder20. Denna uppfattning har lett till inte bara optimering av befintliga tekniker utan också utveckling av nya metoder för ökad transf...

Mänskliga embryonala stamceller (hESC) som härrör från blastocystens inre cellmassa är pluripotenta och kan differentieras till olika celltyper beroende på yttre faktorer under in vitro-förhållanden 1,2. För att fullt ut utnyttja potentialen hos hESC är det absolut nödvändigt att ha snabba och pålitliga genleveransmetoder för dessa celler. Konventionellt kan de använda teknikerna i stort sett klassificeras i två typer: icke-virala och virala genleveranssystem 3,4. De vanligaste icke-bilaterala genleveranssystemen är lipofektion, elektroporering och nukleofektion. Icke-dödliga leveranssystem är fördelaktiga på grund av färre insättningsmutationer och en total minskning av immunogeniciteten 5,6. Dessa metoder resulterar dock i låg transfektionseffektivitet och en kort varaktighet av övergående genuttryck, vilket är en stor begränsning för långsiktiga differentieringsstudier7. Elektroporering resulterar i bättre transfektionseffektivitet jämfört med lipofektion; det resulterar dock i mer än 50% celldöd 8,9,10. Med hjälp av nukleofsektion kan cellöverlevnad och transfektionseffektivitet förbättras genom att kombinera lipofektion och elektroporering, men tillvägagångssättet behöver cellspecifika buffertar och specialutrustning och blir därmed ganska kostsamt för uppskalade applikationer11,12.
Däremot har virala vektorer visat förbättrad transfektionseffektivitet, liksom övergripande låg cytotoxicitet, efter transduktion. Dessutom är de levererade generna stabilt uttryckta och gör därför denna metod idealisk för långtidsstudier13. Bland de vanligaste virusvektorerna för genleverans till hESC är lentivirala vektorer (LVS), vilket kan ge mer än 80% transduktionseffektivitet med hjälp av viruspartiklar med hög titer 14,15. Lipofektion och CaPO 4-utfällning är bland de vanligaste metoderna för att övergående transfektera HEK293T-celler eller dess derivat med genöverföringsvektorer tillsammans med förpackningsplasmider för att ge lentivirala partiklar16. Även om lipofektion resulterar i god transfektionseffektivitet och låg cytotoxicitet, hindras tekniken av dess kostnad, och att skala upp för att få höga titer lentivirala partiklar skulle vara mycket kostsamt. CaPO 4-utfällning resulterar i relativt liknande transfektionseffektivitet som de som erhålls med lipofektion. Även om det är kostnadseffektivt resulterar CaPO4-nederbörd i betydande celldöd efter transfektioner, vilket gör det svårt att standardisera och undvika batch-till-batch-variationer17. I detta scenario är det avgörande att utveckla en metod som ger hög transfektionseffektivitet, låg cytotoxicitet och kostnadseffektivitet för produktionen av hög titer lentivirala partiklar som ska användas i hESC.
Polyetylenimin (PEI) är en katjonisk polymer som kan transfektera HEK293T-celler med hög effektivitet utan mycket cytotoxicitet och har en försumbar kostnad jämfört med lipofektionsbaserade metoder18. I denna situation kan PEI användas för uppskalade applikationer av LVS-produktion med hög titer genom koncentrationen av lentivirala partiklar från odlingssupnatanter med hjälp av olika tekniker. Den presenterade artikeln beskriver användningen av PEI för att transfektera HEK293T-celler och lentivirral vektorkoncentration med hjälp av ultracentrifugering genom en sackaroskudde. Med hjälp av denna metod får vi regelbundet titrar långt över 5 x 107 IE / ml med låga batch-till-batch-variationer. Metoden är enkel, okomplicerad och kostnadseffektiv för uppskalade applikationer för genleverans till hESCs och hESCs-härledda celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C14292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF Recombinant human</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin FRAC V</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Nutrient mix F12&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o: Ca and Mg</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovie serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2118S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Glutamine, 100X&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2924190090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH Polyclonal antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>15707-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH shRNA</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td></td>
			<td>Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR1 complete media</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium 1X CTS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1371201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 2 Supplement 100x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 27 Supplement 50x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-07200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin SOL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLKO.1 TRC vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLL3.7 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene infection reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR1003- G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2.0</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4551/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 
			dihydrochloride&#160;</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin .05% EDTA&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV 939</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3748/10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)

Det nuvarande protokollet beskriver användningen av lentivirala partiklar för leverans av korta hårnåls-RNA (shRNA) till både mänskliga embryonala stamceller (hESC) och neurala stamceller (NPC) härledda från hESC med hög effektivitet. Lentivirala partiklar genererades genom att samtransfektera HEK293T-celler med hjälp av ingångsvektorer (bärande shRNA) tillsammans med förpackningsplasmider (pAX och pMD2.G) med användning av den billiga katjoniska polymeren polyetylenimine (PEI). Virala partiklar koncentrerades med hjälp av ultracentrifugering, vilket resulterade i genomsnittliga titrar över 5 x 107. Både hESC och NPC kan infekteras med hög effektivitet med hjälp av dessa lentivirala partiklar, vilket framgår av puromycinval och stabilt uttryck i hESC, samt övergående GFP-uttryck i NPC. Dessutom visade western blot-analys en signifikant minskning av uttrycket av gener riktade mot shRNA. Dessutom behöll cellerna sin pluripotens såväl som differentieringspotential, vilket framgår av deras efterföljande differentiering i olika linjer av CNS. Det nuvarande protokollet behandlar leverans av shRNA; samma tillvägagångssätt kan dock användas för ektopiskt uttryck av cDNA för överuttrycksstudier.

Efter genöverföring krävs oundvikligen hög livskraft hos hESC. Trots ansträngningar och optimering av protokoll för att minska celldöd efter elektroporering av hESC observeras fortfarande mer än 50% celldöd efter elektroporering av dessa celler, tillsammans med låg transfektionseffektivitet20. Lentivirral medierad genöverföring resulterar inte bara i hög effektivitet av genöverföring utan visar också höga nivåer av cellviabilitet efter transduktion. Resultaten nedan presenterar t...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI at JoVE.com

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI

Med hjälp av den billiga katjoniska polymeren polyetylenimin (PEI) producerade vi lentivirala partiklar för stabilt uttryck av shRNA i H9 humana embryonala stamceller (hESCs) och övergående transducerade H9-härledda neurala stamceller (NPC) med hög effektivitet.

Lentivirral medierad leverans av shRNA till hESC och NPC med hjälp av billig katjonisk polymerpolyetylenimine (PEI)

The current protocol describes the use of lentiviral particles for the delivery of short hairpin RNAs (shRNAs) to both human embryonic stem cells (hESCs) ...

Transfektion av HEK293T-celler måste utföras vid 90% sammanflöde. Dessutom är användningen av ett 0,45 mikron lågproteinbindningsfilter för lentiviral vektorfiltrering och användningen av en sackaroskudde för ultracentrifugering avgörande. Börja med att odla HEK293T-celler i DMEM-medium innehållande 10% FBS och 1X penicillinstreptomycin vid 37 grader Celsius i en fuktad inkubator med en atmosfär av 5% koldioxid och 21% syre tills cellerna når 90% sammanflöde före sådd för transfektion.Frö fyra gånger 10 till de sex cellerna i 10 ml fullständigt tillväxtmedium i en 100-millimeter vävnadsodlingsplatta och växer över natten i en fuktad vävnadsodlingsinkubator med en atmosfär av 5% koldioxid och 21% syre. För varje transfektion, späd ett milligram per milliliter plasmid-DNA-lager i en milliliter serumfria DMEM-medier i 1,5-milliliter centrifugrör genom att följa förhållandet mellan inträdes- och förpackningsplasmider som beskrivs i textmanuskriptet. Virvla röret i 10 sekunder och snurra vid 10 000 gånger G i 30 sekunder vid rumstemperatur för att samla upp.Tillsätt sedan 70 mikroliter av ett milligram per milliliter stamlösning av polymerpolyetenimin, eller PEI, till röret. Återigen, virvel och snurra kort röret. För lipofektaminbaserad transsektion, späd vektorerna i 500 mikroliter serumfria DMEM-medier innehållande 45 mikroliter reagens P som medföljer i satsen.Späd sedan 70 mikroliter reagens L med användning av 500 mikroliter av samma medium. Inkubera båda rören vid rumstemperatur i fem minuter. Kombinera sedan innehållet i båda rören och inkubera vid rumstemperatur i 20 minuter för att möjliggöra komplex bildning.Tillsätt sedan droppvis en milliliter DNA PEI- eller DNA-lipofektaminkomplex till plattan som innehåller celler och inkubera i sex timmar vid 37 grader Celsius med en atmosfär av 5% koldioxid och 21% syre. Efter inkubation, byt ut media med 10 ml färskt komplett tillväxtmedium och återför plattan till inkubatorn. Efter två dagars transfektion, samla det virusinnehållande mediet och överlagra cellerna med 10 ml färskt komplett tillväxtmedium.Återigen, efter tre dagars transfektion, samla in det virusinnehållande mediet och kombinera det med media som samlats in vid två dagars tidpunkt. Centrifugera den virala supernatanten vid 2 000 gånger G i 10 minuter vid fyra grader Celsius för att pelletera cellulärt skräp. Filtrera supernatanten med ett 0,45 mikron porstorlek med låg proteinbindningsfilter och förvara vid fyra grader Celsius tills det är klart för ultracentrifugering.Sterilisera ultracentrifugrörens hållkoppar genom att tvätta med 70% etanol i 10 minuter. Lufttorka, stäng och placera kopparna vid fyra grader Celsius. Tillsätt 36 ml vid filtrerat medium innehållande lentivirala partiklar till ett sterilt ultracentrifugrör.Fyll fem milliliter av en steril stripette med fyra milliliter steril 20% sackaroslösning framställd i PBS och dispensera den till botten av röret som innehåller lentivirala vektorer, eller LVS. Se till att sackaroslösningen inte blandas med mediet och gör en lutning längst ner på röret. Balansera alla ultracentrifugrör med serumfria DMEM-medier, placera rören i kalla ultracentrifugrörshållande koppar och stäng locken.Snurra rören vid 125 000 gånger G i två timmar vid fyra grader Celsius. Efter snurrningen, kassera försiktigt supernatanten genom att invertera rörets innehåll i en behållare som innehåller blekmedel utan att störa pelleten. Markera pelleten om den är synlig.Placera ultracentrifugröret i ett 50-milliliter sterilt rör och tillsätt 200 mikroliter steril DPBS högst upp på pelleten. Placera röret vid fyra grader Celsius över natten. Följande dag, blanda försiktigt innehållet i ett rör genom att pipettera upp och ner innan du snurrar vid 13 000 gånger G i en bordscentrifug för att pelletera eventuellt skräp.Överför supernatanten till ett nytt rör och alikvotera viruspreparatet. Slutligen förvara rören vid minus 80 grader Celsius. Efter transfektion observerades rikligt GFP-uttryck i HEK293T-celler.Uttrycket av virala proteiner resulterade i syncytiabildning av HEK293T-celler där enstaka celler smälts samman. Efter infektion observerades också markant uttryck av GFP i virusinfekterade neurala stamceller. LVS-titermätning mellan det billiga PEI- och lipofectamine 3000-reagenset visade ingen signifikant skillnad i viral titer.De virala titrarna för PLK 0.1-baserade vektorer visas här. Lentivirala transfekterade celler visade mer än 80% cellviabilitet jämfört med icke-transducerade celler, medan inga celler överlevde behandlingen. Western blot-analys visade rikligt uttryck av L-2-hydroxyglutaratdehydrogenas i celler transducerade med en tom vektor ryggrad.Inget uttryck observerades emellertid i celler som transducerades med en vektor som bär korta hårnåls-RNA. Den största fördelen med denna teknik är användningen av billig katjonisk polymerpolyetylenimin för att producera lentivirala partiklar genom samtransfektering av HEK293T-celler med användning av ingångs- och förpackningsvektorer.

Research

JoVE Journal

Biology

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI)

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Märkning hESCs och hMSCs med nanopartiklar av järnoxid för icke-invasiv in vivo-spårning med MR

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

Från MEFs till Matrigel I: Passaging hESCs i närvaro av MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

Från MEFs till Matrigel 2: Dela hESCs från MEFs på Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Från MEFs till Matrigel 3: Passaging hESCs från Matrigel på Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-medierad Knockdown Under Ex vivo Erytropoes av mänskliga hematopoetiska stamceller

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Generering av Human inducerade pluripotenta stamceller från perifert blod Använda STEMCCA lentivirusvektorn

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Långsiktig tysta Intersectin-1s i muslunga genom upprepad Leverans av en specifik siRNA via katjoniska liposomer. Utvärdering av knockdown Effekter med elektronmikroskopi

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Använda Coculture att upptäcka Kemiskt medierade mellan arter Interaktioner

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generering av Myospheres Från hESCs genom epigenetiska omprogrammeringen

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Fosfopeptiden Analys av gnagare Epididymal Spermier

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...