Name: lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)
Uploaded: 2022-05-24T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI at JoVE.com

Bu çalışma, Birleşik Arap Emirlikleri Üniversitesi'nden (BAEÜ), hibe # 31R170 (Zayed Sağlık Bilimleri Merkezi) ve # 12R010'dan (UAEU-AUA hibesi) araştırma hibeleri ile desteklenmiştir. Prof. Randall Morse'a (Wadsworth Center, Albany, NY) makaleyi stil ve dilbilgisi açısından düzenlememize yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.
Tüm veriler talep üzerine temin edilebilir.

1. HEK293T hücrelerinin PEI veya Lipofectamine 3000 reaktifi kullanılarak transfeksiyonu
<ol><li>DMEM'deki kültür HEK293T hücreleri +% 10 FBS + 1x penisilin / streptomisin, transfeksiyon için tohumlamadan önce% 90 akıcıya kadar% 5 CO2 ve% 21O2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de. Yüksek titreli virüs üretimi için nispeten düşük bir geçiş hücresi sayısı kullanın (ideal olarak P30'dan daha az).</li>
	<li>100 mm'lik bir doku kültürü...

<ol>
	<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts.">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts:+Somatic+differentiation+in+vitro.">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro.</a> Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).</li><li>Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cells+and+gene+therapy.">Human embryonic stem cells and gene therapy.</a> Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).</li><li>Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+nonviral+gene+delivery+and+its+role+in+pluripotent+stem+cell+engineering.">Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).</li><li>Li, S. D., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+is+superior+to+viral+gene+delivery.">Nonviral is superior to viral gene delivery.</a> Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).</li><li>Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonviral+gene+delivery+systems:+From+simple+transfection+agents+to+artificial+viruses.">Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses.</a> Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li><li>Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+human+embryonic+stem+cells:+Small+and+macromolecule+loading+and+DNA+transfection.">Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection.</a> Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).</li><li>Sukhorukov, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+high-intensity+field+pulses:+Strategies+for+improving+robustness+and+performance+of+electrotransfection+and+electrofusion.">Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion.</a> The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).</li><li>Floch, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cationic+phosphonolipids+as+non+viral+vectors+for+DNA+transfection+in+hematopoietic+cell+lines+and+CD34++cells.">Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells.</a> Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).</li><li>Lakshmipathy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+transfection+of+embryonic+and+adult+stem+cells.">Efficient transfection of embryonic and adult stem cells.</a> Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).</li><li>Siemen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleofection+of+human+embryonic+stem+cells.">Nucleofection of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).</li><li>Zhang, X., Godbey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vectors+for+gene+delivery+in+tissue+engineering.">Viral vectors for gene delivery in tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).</li><li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors.">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li><li>Gropp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+genetic+modification+of+human+embryonic+stem+cells+by+lentiviral+vectors.">Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).</li><li>Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEK293+cell+line+as+a+platform+to+produce+recombinant+proteins+and+viral+vectors.">HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).</li><li>Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+lentiviral+vectors.">Production of lentiviral vectors.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 3, 16017 (2016).</li><li>Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., G&#246;pferich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine-based+nonviral+gene+delivery+systems.">Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).</li><li>Parween, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+O-GlcNAc+levels+are+associated+with+defects+in+progenitor+proliferation+and+premature+neuronal+differentiation+during+in-vitro+human+embryonic+cortical+neurogenesis.">Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).</li><li>Weissinger, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+in+purified+human+hematopoietic+peripheral-blood+stem+cells+by+means+of+electroporation+without+prestimulation.">Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation.</a> Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).</li><li>Cui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+transgene+expression+to+antigen-presenting+cells+derived+from+lentivirus-transduced+engrafting+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells.">Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells.</a> Blood. 99 (2), 399-408 (2002).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+with+two+independent+internal+promoters+transfer+high-level+expression+of+multiple+transgenes+to+human+hematopoietic+stem-progenitor+cells.">Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells.</a> Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).</li><li>Sweeney, N. P., Vink, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+lentiviral+vector+genome+size+and+producer+cell+genomic+to+gag-pol+mRNA+ratios+on+packaging+efficiency+and+titre.">The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre.</a> Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 21, 574-584 (2021).</li></ol>

Kök hücreleri çalışma veya klinik amaçlar için genetik olarak değiştirme yeteneği, hem teknoloji hem de hESC'lerin biyolojisinin temel anlayışı ile sınırlıdır. Lipofeksiyon ve elektroporasyon gibi fare ESC'lerinde önemli potansiyel gösteren teknikler, geleneksel yöntemlerle gen iletimi için oldukça zor olan hESC'ler için oldukça verimli değildir20. Bu kavram sadece mevcut tekniklerin optimizasyonuna değil, aynı zamanda hESC'lerde transfeksiyon verimliliğinin arttırılm...

Blastosist iç hücre kütlesinden türetilen insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) pluripotenttir ve in vitro koşullar altında dış etkenlere bağlı olarak farklı hücre tiplerine ayrılabilir 1,2. hESC'lerin potansiyelini tam olarak kullanmak için, bu hücreler için hızlı ve güvenilir gen dağıtım yöntemlerine sahip olmak zorunludur. Geleneksel olarak, kullanılan teknikler genel olarak iki tipte sınıflandırılabilir: viral olmayan ve viral gen dağıtım sistemleri 3,4. Daha sık kullanılan nonviral gen taşıyıcı sistemler lipofeksiyon, elektroporasyon ve nükleofeksiyondur. Nonviral dağıtım sistemleri, daha az yerleştirme mutasyonu ve immünojenisitedeki genel azalma nedeniyle avantajlıdır 5,6. Bununla birlikte, bu yöntemler düşük transfeksiyon etkinliği ve kısa süreli geçici gen ekspresyonu ile sonuçlanır, bu da uzun süreli farklılaşma çalışmaları için önemli bir sınırlamadır7. Elektroporasyon, lipofeksiyona kıyasla daha iyi transfeksiyon verimliliği sağlar; ancak %50'den fazla hücre ölümüile sonuçlanır 8,9,10. Nükleofeksiyon kullanılarak, lipofeksiyon ve elektroporasyon birleştirilerek hücre sağkalımı ve transfeksiyon verimliliği artırılabilir, ancak yaklaşım hücreye özgü tamponlara ve özel ekipmanlara ihtiyaç duyar ve bu nedenle ölçeklendirilmiş uygulamalar için oldukça maliyetli hale gelir11,12.
Buna karşılık, viral vektörler, transdüksiyonu takiben transfeksiyon verimliliklerinin yanı sıra genel olarak düşük sitotoksisiteyi de göstermiştir. Ek olarak, verilen genler istikrarlı bir şekilde ifade edilir ve bu nedenle bu yöntemi uzun süreli çalışmalar için ideal kılar13. hESC'lere gen iletimi için en sık kullanılan viral vektörler arasında, yüksek titreli viral parçacıklar14,15 kullanarak% 80'den fazla transdüksiyon verimliliği sağlayabilen lentiviral vektörler (LVS) bulunmaktadır. Lipofeksiyon ve CaPO4 çökeltmesi, HEK293T hücrelerini veya türevlerini gen transfer vektörleri ile geçici olarak transfekte etmek için en yaygın kullanılan yöntemler arasındadır ve lentiviral parçacıklar üretmek için plazmidleri paketlemektedir16. Lipofeksiyon iyi transfeksiyon etkinliği ve düşük sitotoksisite ile sonuçlanmasına rağmen, teknik maliyeti nedeniyle engellenir ve yüksek titreli lentiviral parçacıklar elde etmek için ölçeklendirilmesi çok maliyetli olacaktır. CaPO4 çökelmesi, lipofeksiyon kullanılarak elde edilenlere nispeten benzer transfeksiyon verimlilikleri ile sonuçlanır. Uygun maliyetli olmasına rağmen, CaPO4 çökeltisi, transfeksiyonları takiben önemli hücre ölümü ile sonuçlanır, bu da standardizasyonu ve partiden partiye varyasyonlardan kaçınmayı zorlaştırır17. Bu senaryoda, yüksek transfeksiyon verimliliği, düşük sitotoksisite ve maliyet etkinliği sağlayan bir yöntem geliştirmek, hESC'lerde kullanılacak yüksek titreli lentiviral parçacıkların üretimi için çok önemlidir.
Polietilenimin (PEI), HEK293T hücrelerini fazla sitotoksisite olmadan yüksek verimlilikte transfekte edebilen ve lipofeksiyon bazlı yöntemlere kıyasla ihmal edilebilir bir maliyeti olan katyonik bir polimerdir18. Bu durumda, PEI, çeşitli teknikler kullanılarak kültür süpernatantlarından lentiviral parçacıkların konsantrasyonu yoluyla yüksek titreli LVS üretiminin ölçeklendirilmiş uygulamaları için kullanılabilir. Sunulan makalede, HEK293T hücrelerini ve lentiviral vektör konsantrasyonunu transfekte etmek için PEI'nin bir sakkaroz yastığı aracılığıyla ultrasantrifüjleme kullanılarak kullanımı açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, düzenli olarak 5 x 107 IU / mL'nin çok üzerinde, düşük partiden partiye varyasyonlara sahip titreler elde ediyoruz. Yöntem, hESC'lere ve hESC'lerden türetilmiş hücrelere gen iletimi için ölçeklendirilmiş uygulamalar için basit, basit ve uygun maliyetlidir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>31350010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>C14292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF Recombinant human</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHG0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin FRAC V</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclopamine</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11995073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Nutrient mix F12&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS w/o: Ca and Mg</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovie serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2118S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution</td>
			<td>GE healthcare</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L Glutamine, 100X&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>2924190090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH Polyclonal antibody</td>
			<td>Proteintech</td>
			<td>15707-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L2HGDH shRNA</td>
			<td>Macrogen</td>
			<td></td>
			<td>Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 3000 kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>L3000001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTesR1 complete media</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium 1X CTS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1371201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 2 Supplement 100x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-11050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuropan 27 Supplement 50x</td>
			<td>PAN Biotech</td>
			<td>P07-07200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin SOL</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLKO.1 TRC vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>10878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pLL3.7 vector&#160;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>11795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMD2.G</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene infection reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>TR1003- G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylenimine, branched</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2.0</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purmorphamine</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4551/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A1113802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 
			dihydrochloride&#160;</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB 431542</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1614/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin .05% EDTA&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XAV 939</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3748/10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lentiviral mediated delivery of shrnas to hescs and npcs using low-cost cationic polymer polyethylenimine (pei)

Mevcut protokol, kısa saç tokası RNA'larının (shRNA'lar) hem insan embriyonik kök hücrelerine (hESC'ler) hem de hESC'lerden türetilen nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) yüksek verimlilikte verilmesi için lentiviral parçacıkların kullanımını açıklamaktadır. Lentiviral parçacıklar, düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanılarak ambalaj plazmidleri (pAX ve pMD2.G) ile birlikte giriş vektörleri (shRNA'lar taşıyan) kullanılarak HEK293T hücrelerinin birlikte transfekte edilmesiyle üretildi. Viral parçacıklar ultrasantrifüjleme kullanılarak konsantre edildi, bu da ortalama titrelerin 5 x 107'nin üzerinde olmasına neden oldu. Hem hESC'ler hem de NPC'ler, püromisin seçimi ve hESC'lerde kararlı ekspresyonun yanı sıra NPC'lerde geçici GFP ekspresyonu ile gösterildiği gibi, bu lentiviral partiküller kullanılarak yüksek verimlilikte enfekte olabilir. Ayrıca, batı leke analizi, shRNA'lar tarafından hedeflenen genlerin ekspresyonunda önemli bir azalma olduğunu göstermiştir. Ek olarak, hücreler, CNS'nin farklı soylarına daha sonraki farklılaşmalarıyla kanıtlandığı gibi, pluripotensilerini ve farklılaşma potansiyellerini korudular. Mevcut protokol, shRNA'ların verilmesi ile ilgilidir; Bununla birlikte, aynı yaklaşım aşırı ekspresyon çalışmaları için cDNA'ların ektopik ekspresyonu için de kullanılabilir.

Gen transferini takiben, hESC'lerin yüksek canlılığı kaçınılmaz olarak gereklidir. hESC'lerin elektroporasyonunu takiben hücre ölümünü azaltmak için protokollerin çabalarına ve optimizasyonuna rağmen, bu hücrelerin elektroporasyonundan sonra% 50'den fazla hücre ölümü ve düşük transfeksiyon verimliliği20 ile birlikte gözlenmektedir. Lentiviral aracılı gen transferi sadece gen transferinin yüksek verimliliği ile sonuçlanmakla kalmaz, aynı zamanda transdüksiyonu taki...

Watch this Scientific Journal Video about Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI at JoVE.com

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine PEI

Düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanarak, H9 insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) shRNA'ların kararlı ekspresyonu için lentiviral parçacıklar ürettik ve geçici olarak dönüştürülmüş H9 türevi nöral progenitör hücreler (NPC'ler) yüksek verimlilikte.

Lentiviral Aracılı shRNA'ların Düşük Maliyetli Katyonik Polimer Polietilenimin (PEI) Kullanılarak hESC'lere ve NPC'lere Verilmesi

The current protocol describes the use of lentiviral particles for the delivery of short hairpin RNAs (shRNAs) to both human embryonic stem cells (hESCs) ...

HEK293T hücrelerinin transfeksiyonu% 90 oranında yapılmalıdır. Ayrıca, lentiviral vektör filtrasyonu için 0.45 mikron düşük protein bağlayıcı filtrenin kullanılması ve ultrasantrifüjleme için bir sakkaroz yastığının kullanılması esastır. HEK293T hücrelerini, 37 santigrat derecede %10 FBS ve 1X penisilin streptomisin içeren DMEM ortamında, transfeksiyon için tohumlamadan önce hücreler %90 akıcıya ulaşana kadar nemlendirilmiş bir inkübatörde %5 karbondioksit ve %21 oksijen atmosferi ile kültürleyerek başlayın.100 milimetrelik bir doku kültürü plakasında 10 mililitre tam büyüme ortamında altı hücreye dört kez 10 kez tohumlayın ve% 5 karbondioksit ve% 21 oksijen atmosferine sahip nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe gece boyunca büyür. Her transfeksiyon için, metin makalesinde açıklandığı gibi giriş ve ambalaj plazmidlerinin oranını takip ederek, 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerinde bir mililitre serumsuz DMEM ortamında mililitre plazmid DNA stokları başına bir miligram seyreltin. Tüpü 10 saniye boyunca vorteks yapın ve toplamak için oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 10.000 kez G'de döndürün.Daha sonra, tüpe mililitre başına bir miligramlık 70 mikrolitre polimer polietilenamin veya PEI stok çözeltisi ekleyin. Yine, vorteks ve kısaca tüpü döndürün. Lipofektamin bazlı transeksiyon için, vektörleri, kit içinde verilen 45 mikrolitre reaktif P içeren 500 mikrolitre serumsuz DMEM ortamında seyreltin.Daha sonra, aynı ortamın 500 mikrolitresini kullanarak 70 mikrolitre reaktif L'yi seyreltin. Her iki tüpü de oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, her iki tüpün içeriğini birleştirin ve karmaşık formasyona izin vermek için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.Daha sonra, hücreleri içeren plakaya damla damla bir mililitre DNA PEI veya DNA lipofectamine kompleksleri ekleyin ve% 5 karbondioksit ve% 21 oksijen atmosferi ile 37 santigrat derecede altı saat boyunca inkübe edin. Kuluçkadan sonra, ortamı 10 mililitre taze tam büyüme ortamı ile değiştirin ve plakayı inkübatöre geri koyun. İki günlük transfeksiyondan sonra, virüs içeren ortamı toplayın ve hücreleri 10 mililitre taze tam büyüme ortamı ile kaplayın.Yine, üç günlük transfeksiyondan sonra, virüs içeren medyayı toplayın ve iki günlük zaman noktasında toplanan medyayla birleştirin. Viral süpernatantı 2.000 kez G'de dört santigrat derecede 10 dakika boyunca hücresel kalıntıları pelet etmek için santrifüj edin. Süpernatantı 0,45 mikron gözenek boyutunda düşük protein bağlayıcı bir filtre kullanarak filtreleyin ve ultrasantrifüjlemeye hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın.Ultrasantrifüj tüplerinin tutma bardaklarını %70 etanol ile 10 dakika yıkayarak sterilize edin. Bardakları hava ile kurutun, kapatın ve dört santigrat dereceye yerleştirin. Steril bir ultrasantrifüj tüpüne lentiviral parçacıklar içeren filtrelenmiş ortama 36 mililitre ekleyin.PBS'de hazırlanan dört mililitre steril% 20 sakkaroz çözeltisi ile steril bir striptizin beş mililitresini doldurun ve lentiviral vektörler veya LVS içeren tüpün dibine dağıtın. Sakkaroz çözeltisinin medya ile karıştırılmadığından ve tüpün dibinde bir gradyan oluşturduğundan emin olun. Serumsuz DMEM ortamını kullanarak tüm ultrasantrifüj tüplerini dengeleyin, tüpleri soğuk ultrasantrifüj tüp tutma kaplarına yerleştirin ve kapakları kapatın.Tüpleri dört santigrat derecede iki saat boyunca 125.000 kez G'de döndürün. Spinden sonra, peleti rahatsız etmeden tüpün içeriğini çamaşır suyu içeren bir kapta ters çevirerek süpernatantı dikkatlice atın. Görünürse peleti işaretleyin.Ultra santrifüj tüpünü 50 mililitrelik steril bir tüpe yerleştirin ve peletin üstüne 200 mikrolitre steril DPBS ekleyin. Tüpü gece boyunca dört santigrat dereceye yerleştirin. Ertesi gün, herhangi bir döküntüyü pelet etmek için bir masa üstü santrifüjde 13.000 kez G'de dönmeden önce bir tüpün içeriğini yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın.Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve virüs preparatını aliquot. Son olarak, tüpleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Transfeksiyondan sonra, HEK293T hücrelerinde bol miktarda GFP ekspresyonu gözlendi.Viral proteinlerin ekspresyonu, tek hücrelerin kaynaştığı HEK293T hücrelerinin sinsiti oluşumuna neden oldu. Enfeksiyonu takiben, viral enfekte nöral progenitör hücrelerde GFP'nin belirgin ekspresyonu da gözlendi. Düşük maliyetli PEI ve lipofectamine 3000 reaktifi arasındaki LVS titre ölçümü viral titrede anlamlı bir fark göstermedi.PLK 0.1 tabanlı vektörler için viral titreler burada gösterilmiştir. Lentiviral transfekte hücreler, transdüktif olmayan hücrelere kıyasla% 80'den fazla hücre canlılığı gösterirken, hiçbir hücre tedaviden kurtulamadı. Batı leke analizi, boş bir vektör omurgası ile dönüştürülen hücrelerde L-2-hidroksiglutarat dehidrogenazın bol miktarda ekspresyonunu gösterdi.Bununla birlikte, kısa saç tokası RNA'ları taşıyan bir vektörle dönüştürülen hücrelerde hiçbir ekspresyon gözlenmedi. Bu tekniğin temel avantajı, giriş ve paketleme vektörlerini kullanarak HEK293T hücrelerini birlikte transfekte ederek lentiviral parçacıklar üretmek için düşük maliyetli katyonik polimer polietilendiminin kullanılmasıdır.

Research

JoVE Journal

Biology

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI)

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

Demir Oksit hESC ve hMSCs Etiketleme MR Görüntüleme in vivo Takip Non-Invasive Nanopartiküller

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Biyoloji

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

MEFS I Matrigel: MEFS Durum Pasajlanması hESC

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

MEFS Matrigel 2 Matrigel üzerine MEFS Yarma hESC:

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

Matrigel MEFS Matrigel 3: Matrigel üzerine gelen Pasajlanması hESC

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral aracılı demonte sırasında Ex vivo İnsan Hematopoetik Kök Hücre Eritropoiesis

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

STEMCCA lentiviral Vektör Kullanma Çevresel Blood İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre Üretimi

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Long-term Silencing of Intersectin-1s in Mouse Lungs by Repeated Delivery of a Specific siRNA via Cationic Liposomes. Evaluation of Knockdown Effects by Electron Microscopy

Katyonik lipozomlar üzeri özel siRNA tekrar teslim ile Fare Akciğerler Intersectin-1s uzun süreli suskunluğu. Elektron Mikroskobu ile demonte Etkilerinin Değerlendirilmesi

Previous  studies showed that knockdown of ITSN-1s (KDITSN), an endocytic  protein involved in regulating lung vascular permeability and endothelial cells ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

Kimyasal Dolayımlı Türler arası etkileşimleri tespit etmek Coculture kullanma

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Epigenetik yeniden programlanması ile hESC itibaren Myospheres Üretimi

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Kemirgen Epididimal Spermatozoa&#39;lar phosphopeptide Analizi

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...