Name: genetic screen for identification of multicopy suppressors in schizosaccharomyces pombe
Uploaded: 2022-09-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe at JoVE.com

इस कार्य को जैव प्रौद्योगिकी विभाग, भारत सरकार से एक अनुसंधान अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था (अनुदान सं 2006)। बीटी/पीआर12568/बीआरबी/10/1369/2015) निमिषा शर्मा को। चार्ल्स हॉफमैन (बोस्टन कॉलेज, यूएसए) को एस पोम्बे सीडीएनए लाइब्रेरी के उपहार के लिए और प्रोफेसर सुसान फोर्सबर्ग को खमीर प्लास्मिड के लिए धन्यवाद देते हैं।

1. सीडीएनए लाइब्रेरी को क्वेरी एस पोम्बे म्यूटेंट स्ट्रेन में मल्टीकॉपी सप्रेसर्स के लिए स्क्रीन करने के लिए बदलना
नोट: मानक लिथियम-एसीटेट विधि27 का पालन एस पोम्बे सीडी?...

खमीर का व्यापक रूप से बुनियादी जैविक प्रक्रियाओं और मार्गों की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है जो यूकेरियोटिक जीवों में क्रमिक रूप से संरक्षित हैं। आनुवंशिक और जीनोमिक उपकरणों की उपलब्धता के साथ-स?...

आनुवंशिक इंटरैक्शन के नेटवर्क जीन के बारे में कार्यात्मक जानकारी प्रदान करते हैं और मार्गों और जैविक प्रक्रियाओं को चित्रित करते हैं जो ये जीन विवो में शामिल हो सकते हैं। इसके अलावा, वे यह भी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं कि विभिन्न जीन एक दूसरे के साथ कैसे बातचीत करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक विशिष्ट फेनोटाइप 1,2,3 होता है। वर्षों से, मौलिक जैविक प्रश्नों के उत्तर देने और मानव रोगों का अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं द्वारा विभिन्न प्रकार की आनुवंशिक स्क्रीन डिजाइन की गई हैं। आनुवंशिक इंटरैक्शन की पहचान के लिए स्क्रीन कई तरीकों से किया जा सकता है। विभिन्न आनुवंशिक स्क्रीन में पहचाने गए आनुवंशिक इंटरैक्शन जीन के बीच अलग-अलग यांत्रिक संबंधों का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। इसके अलावा, अध्ययनों से पता चला है कि आनुवंशिक इंटरैक्शन का एक सामान्य सेट जीन द्वारा साझा किया जाता है जो एक ही मार्ग या जटिल 4,5 से संबंधित प्रोटीन को एन्कोड करता है। इस प्रकार, आनुवंशिक इंटरैक्शन नेटवर्क का उपयोग एक सेल में कार्यात्मक संगठन को स्थापित करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें सबसे समान प्रोफाइल साझा करने वाले जीन एक ही जटिल या मार्ग से संबंधित होते हैं, कुछ हद तक कम समान प्रोफाइल साझा करने वाले जीन एक ही जैविक प्रक्रिया से संबंधित होते हैं, और ओवरलैपिंग लेकिन अधिक विविध प्रोफाइल प्रदर्शित करने वाले जीन एक ही सेलुलर कम्पार्टमेंट6 से संबंधित सदस्यों को दर्शाते हैं।
खुराक दमन ('उच्च-प्रतिलिपि या मल्टीकॉपी दमन') के आधार पर आनुवंशिक इंटरैक्शन स्क्रीन आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोणों में से एक है। इन स्क्रीनों को एक उच्च-प्रतिलिपि-संख्या जीनोमिक या सीडीएनए लाइब्रेरी के साथ एक क्वेरी उत्परिवर्ती तनाव को बदलकर किया जा सकता है, इसके बाद आनुवंशिक इंटरैक्शन 7,8,9 को दबाने या बढ़ाने की पहचान करने के लिए उपयुक्त परख / चयन तकनीकें हैं। एक व्यापक जीनोम-व्यापी कवरेज सुनिश्चित करने के लिए, इन स्क्रीनों को जीनोम-वाइड लॉस-ऑफ-फंक्शन म्यूटेंट के संग्रह में रुचि के एक विशिष्ट जीन को अतिरंजित करके या लॉस-ऑफ-फंक्शन क्वेरी म्यूटेंट 9,10,11,12,13,14,15 में उच्च-कॉपी-नंबर प्लास्मिड-एन्कोडेड जीनोमिक या सीडीएनए लाइब्रेरी को अतिरंजित करके भी किया गया है। . मल्टीकॉपी रणनीति एक विनियमन योग्य प्रमोटर का उपयोग करके एक प्रमुख / ओवरएक्प्रेशन दृष्टिकोण का उपयोग करके भी काम कर सकती है।
शमन-आधारित स्क्रीन का उपयोग करने के मुख्य लाभ यह हैं कि किसी अन्य जीन द्वारा उत्परिवर्ती तनाव में पहले से मौजूद फेनोटाइप का दमन इन दो जीन उत्पादों के बीच एक आनुवंशिक संबंध स्थापित करता है जो अन्य दृष्टिकोणों का उपयोग करके प्रदर्शित नहीं किया जा सकता है। दूसरा, यह देखा गया है कि पहले से मौजूद उत्परिवर्तन की उपस्थिति एक विशेष मार्ग को संवेदनशील बनाती है, जिससे उस मार्ग के अतिरिक्त घटकों को सप्रेसर्स के अलगाव द्वारा पहचाना जा सकता है, जिन्हें अधिक प्रत्यक्ष आनुवंशिक चयन द्वारा पहचाना नहीं जा सकता है। इसके अलावा, इस स्क्रीन का उपयोग दमनकर्ताओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जिनकेपास दमन के विभिन्न तंत्र हैं। सप्रेसर इंटरैक्शन आमतौर पर जीन के बीच होते हैं जो कार्यात्मक रूप से संबंधित होते हैं और मार्गों में पदानुक्रम को स्पष्ट करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। दमन का सटीक अंतर्निहित तंत्र कई कारकों के आधार पर भिन्न हो सकता है, जिसमें स्क्रीन में उपयोग किए जाने वाले क्वेरी उत्परिवर्ती का प्रकार, प्रयोगात्मक स्थितियां और जीन अभिव्यक्ति का स्तर शामिल है। सामान्य खुराक दमन तंत्र में से एक में जीन एन्कोडिंग उत्पाद शामिल हैं जो एक ही परिसर में या एक ही सेलुलर / जैविक प्रक्रिया में समानांतर में एक साथ कार्य करते हैं। खमीर जैसे सरल मॉडल जीवों में ऐसी स्क्रीन के परिणामों को उच्च यूकेरियोटिक जीवों तक बढ़ाया जा सकता है क्योंकि अधिकांश मौलिक जैविक मार्ग और प्रक्रियाएं विकास में संरक्षित हैं।
इन आनुवंशिक स्क्रीन को विभिन्न जैविक प्रश्नों के उत्तर देने के लिए कई तरीकों से संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, विभिन्न जीवों के ऑर्थोलॉगस जीन जो क्वेरी उत्परिवर्ती तनाव के फेनोटाइप को दबा सकते हैं, की पहचान की जा सकती है। इसका उपयोग संभावित प्रतिरोध तंत्र को चित्रित करने और नए जीवाणुरोधी17,18, एंटिफंगल 19,20, एंटीपैरासिटिक 21 और एंटीकैंसर 22 यौगिकों के प्रोटीन लक्ष्यों को निर्धारित करने के लिए भी किया गया है। इस स्क्रीन का उपयोग दवा दवाओं की गतिविधि के शमनकर्ताओं की पहचान करने के लिए भी किया गया है जिनकी कार्रवाई का तंत्र ज्ञात नहीं है। इस प्रकार, सिद्धांत रूप में, इन मल्टीकॉपी सप्रेसर स्क्रीन को विभिन्न जीवों में विभिन्न अनुप्रयोगों में अनुकूलित और उपयोग किया जा सकता है। यद्यपि खमीर शोधकर्ताओं द्वारा नियोजित अधिकांश आनुवंशिक स्क्रीन शुरू में एस सेरेविसिया में विकसित किए गए हैं, एस पोम्बे विभिन्न आनुवंशिक स्क्रीन और परख23 को पूरा करने के लिए एक पूरक मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है। इसके अलावा, एस पोम्बे में जीनोमिक संगठन और जैविक प्रक्रियाएं, जैसे कि अधिक जीनों में इंट्रोन्स की घटना, डीएनए प्रतिकृति की उत्पत्ति की जटिलता, सेंट्रोमियर संरचना, कोशिका चक्र का संगठन और आरएनएआई मशीनरी की उपस्थिति, एस पोम्बे और उच्च यूकेरियोट्स23,24 के बीच अधिक समानता दिखाती हैं, जो एस पोम्बे में आनुवंशिक उपकरणों को डिजाइन करने और उपयोग करने के महत्व को रेखांकित करती हैं।
यह पेपर एस पोम्बे में लॉस-ऑफ-फंक्शन म्यूटेंट फेनोटाइप के 'खुराक दमन' के आधार पर आनुवंशिक इंटरएक्टर्स की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस प्रोटोकॉल का आधार यह है कि यह सीडीएनए लाइब्रेरी को मल्टीकॉपी प्लास्मिड पर और / या एक मजबूत प्रमोटर से जंगली प्रकार के जीन को अधिक व्यक्त करने के लिए एक तेज़ और कुशल तरीका है। इस प्रोटोकॉल के चार मुख्य चरण हैं: लाइब्रेरी को क्वेरी म्यूटेंट स्ट्रेन में बदलना, प्लास्मिड क्लोन का चयन जो क्वेरी म्यूटेंट स्ट्रेन के वांछित फेनोटाइप को दबाता है, इन शमन क्लोनों से प्लास्मिड (ओं) को पुनः प्राप्त करना, और फेनोटाइप के दमन के लिए जिम्मेदार जीन की पहचान करना। जैसा कि लाइब्रेरी से सीडीएनए के चयन और पहचान के आधार पर किसी भी विधि के लिए सच है, स्क्रीन की सफलता उच्च गुणवत्ता और उच्च जटिलता लाइब्रेरी का उपयोग करने पर निर्भर है क्योंकि स्क्रीन केवल उन सीडीएनए क्लोनों को पुनर्प्राप्त कर सकती है जो लाइब्रेरी में मौजूद हैं।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने क्वेरी एस पोम्बे एल 1 नल उत्परिवर्ती के जीनोटॉक्सिक तनाव-संवेदनशील फेनोटाइप के दो नए सप्रेसर्स की सफलतापूर्वक पहचान की है। प्रतिलेखन बढ़ाव कारकों का एलईएल (ग्यारह उन्नीस लाइसिन रिच ल्यूकेमिया) परिवार इन विट्रो जैव रासायनिक परखों में डीएनए टेम्पलेट्स पर आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय के क्षणिक विराम को दबा देता है और विखंडन खमीरसे मनुष्यों तक विभिन्न जीवों में संरक्षित होता है। पहले के काम ने सबूत प्रदान किया है कि एक एस पोम्बे एल 1 नल उत्परिवर्ती 4-नाइट्रोक्विनोलिन 1-ऑक्साइड (4-एनक्यूओ) और मिथाइल मीथेनसल्फोनेट (एमएमएस) 26 की उपस्थिति में जीनोटॉक्सिक तनाव संवेदनशीलता दिखाता है। इसलिए, हमने एक एस पोम्बे प्लास्मिड-एन्कोडेड मल्टीकॉपी सीडीएनए लाइब्रेरी को क्वेरी एस पोम्बे एल 1 नल उत्परिवर्ती में बदल दिया और दो कथित क्लोनों की पहचान की, जिन्होंने 4-एनक्यूओ की उपस्थिति में एस पोम्बे एल 1 नल उत्परिवर्ती की जीनोटॉक्सिक तनाव संवेदनशीलता को दबाने की क्षमता प्रदर्शित की, एक यौगिक जो डीएनए घावों को प्रेरित करता है। प्लास्मिड क्लोन में मौजूद इंसर्ट के बाद के अनुक्रमण ने पहचान की कि रैक्स 2 + और ओएसएच 6 + को एन्कोडिंग करने वाले जीन एल 1 नल उत्परिवर्ती की जीनोटॉक्सिक तनाव संवेदनशीलता को दबाने के लिए जिम्मेदार थे जब एल 1 नल उत्परिवर्ती में अतिरंजित किया गया था।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-NQO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid, glacial</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1371301000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenine Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>50004L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>ER0051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM1023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium hydrogen phospahte anhydrous</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM3960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single stranded DNA from Salmon testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA disodium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>324503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferric Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM6353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ionositol</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Qualigen</td>
			<td>Q26897</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucine</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Acetatae</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>517992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Hexahydrate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molybdic Acid</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinic Acid</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>CMS177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG, MW 4000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>81240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentothinic Acid</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>TC159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydrogen Pthallate</td>
			<td>Merc</td>
			<td>DDD7D670815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium iodide</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Fermentas</td>
			<td>EN0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM1183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulphate</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris free Base</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>MB209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>GRM264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Powder</td>
			<td>Himedia</td>
			<td>RM668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Sulphate Heptahydrate</td>
			<td>Merc</td>
			<td>DJ9D692580</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic screen for identification of multicopy suppressors in schizosaccharomyces pombe

आनुवंशिक अंतःक्रियाओं की पहचान जैविक मार्गों और प्रक्रियाओं में अन्य जीनों और संगठन के साथ उनके कार्यात्मक संबंधों में अंतर्दृष्टि प्रदान करके जीन (ओं) के कार्यों को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यद्यपि अधिकांश आनुवंशिक स्क्रीन शुरू में सैक्रोमाइसेस सेरेविसिया में विकसित किए गए थे, इन आनुवंशिक स्क्रीन को पूरा करने के लिए एक पूरक मंच स्किज़ोसैक्रोमाइसेस पोम्बे द्वारा प्रदान किया गया है। आनुवंशिक इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सामान्य तरीकों में से एक जीनोम-वाइड, हाई-कॉपी-नंबर प्लास्मिड लाइब्रेरी से क्लोन ों के ओवरएक्प्रेशन द्वारा एक लॉस-ऑफ-फंक्शन म्यूटेंट में है, इसके बाद क्लोन का चयन होता है जो उत्परिवर्ती फेनोटाइप को दबाता है।
यह पेपर एस पोम्बे में इस 'मल्टीकॉपी दमन' आधारित आनुवंशिक स्क्रीन को पूरा करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इस स्क्रीन ने एस पोम्बे में एल 1 प्रतिलेखन बढ़ाव कारक की अनुपस्थिति से जुड़े जीनोटॉक्सिक तनाव-संवेदनशील फेनोटाइप के मल्टीकॉपी सप्रेसर (ओं) की पहचान करने में मदद की है। स्क्रीन को उच्च-कॉपी-नंबर एस पोम्बे सीडीएनए प्लास्मिड लाइब्रेरी के साथ क्वेरी एल 1 नल उत्परिवर्ती तनाव के परिवर्तन और ईएमएम 2 प्लेटों पर 4-नाइट्रोक्विनोलिन 1-ऑक्साइड (4-एनक्यूओ), एक जीनोटॉक्सिक तनाव-उत्प्रेरण यौगिक युक्त सप्रेसर्स का चयन करके शुरू किया गया था। इसके बाद, प्लास्मिड को दो शॉर्टलिस्ट किए गए शमन कालोनियों से अलग किया गया और सम्मिलित डीएनए को छोड़ने के लिए प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा पचाया गया। एक सम्मिलित डीएनए टुकड़े को जारी करने वाले प्लास्मिड को 4-एनक्यूओ और अन्य जीनोटॉक्सिक यौगिकों की उपस्थिति में एल 1 विलोपन उत्परिवर्ती के विकास को बहाल करने के लिए इन शमन प्लास्मिड क्लोनों की क्षमता की पुष्टि करने के लिए एल 1 विलोपन तनाव में फिर से स्थानांतरित किया गया था। विलोपन फेनोटाइप के बचाव को दिखाने वाले उन प्लास्मिड को एल 1 विलोपन से जुड़े जीनोटॉक्सिक तनाव-संवेदनशील फेनोटाइप के दमन के लिए जिम्मेदार जीन (ओं) की पहचान करने के लिए अनुक्रमित किया गया था।

एस पोम्बे में एल 1 विलोपन से जुड़े जीनोटॉक्सिक तनाव संवेदनशीलता के मल्टीकॉपी सप्रेसर (ओं) के लिए स्क्रीनिंग हमने क्वेरी एल 1 विलोपन उत्परिवर्ती तनाव के हानि-ऑफ-फ़ं?...

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Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe

यह काम स्किज़ोसैक्रोमाइसेस पोम्बे में एक मल्टीकॉपी सप्रेसर आनुवंशिक स्क्रीन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह स्क्रीन एक क्वेरी म्यूटेंट स्ट्रेन से जुड़े लॉस-ऑफ-फंक्शन फेनोटाइप के सप्रेसर क्लोन (ओं) की पहचान करने के लिए जीनोम-वाइड प्लास्मिड लाइब्रेरी का उपयोग करती है। इस स्क्रीन का उपयोग करके एल 1 नल उत्परिवर्ती के नए आनुवंशिक शमनकर्ताओं की पहचान की गई थी।

स्किज़ोसैक्रोमाइसेस पोम्बे में मल्टीकॉपी सप्रेसर्स की पहचान के लिए आनुवंशिक स्क्रीन

Identification of genetic interactions is a powerful tool to decipher the functions of gene(s) by providing insights into their functional relationships ...

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe

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