Rekonstituering av membranbundna minimala aktinkortikor på stödda lipiddubbelskikt

Här demonstrerar vi en relativt enkel och okomplicerad procedur för att montera membranbundna aktomyosinnätverk och studera dynamiken med hjälp av avancerade ljusmikroskopiska tekniker. Den viktigaste fördelen är att vår analys tillåter sekventiell tillsats av proteiner och små molekyler utan att störa de membranbundna nätverken. Denna metod kan enkelt anpassas för att studera andra cytoskelettproteiner eller sammansatta nätverk.

Den mest kritiska delen av protokollet är att se till att det stödda lipid-dubbelskiktet bildas korrekt, så först var vi tvungna att behärska detta steg innan vi började lägga till cytoskelettproteinerna. För att börja, ta tre till fem rektangulära glasöverdrag och placera dem i en coplinburk. Slå på badljudaren och ställ in temperaturen till 65 grader Celsius.

Fyll coplinburken med 2% rengöringslösning för att helt sänka ner täckglasen och placera den i sonicator i 30 minuter i full pulsläge. Använd trubbiga PTFE-belagda pincett för att ta bort täckglasen en efter en. Skölj dem noggrant med destillerat vatten och lägg dem i en annan coplinburk fylld med två normala natriumhydroxid.

Sonicate täckglasen i 20 minuter i full pulsläge. Ta bort täckglasen, skölj noggrant med destillerat vatten och lägg i en annan coplinburk fylld med destillerat vatten. Innan du börjar experimentet, ta burken i en kemisk huva utrustad med kvävgasförsörjning.

Använd handskar och pincett för att ta bort täckglasen för att torka dem under kväveströmmen. Torka båda sidorna och placera dem på ett rent plastnät med lock. Placera lådan med täckglasen i en exsickator för att undvika kontakt med dammpartiklar, ta sedan autoklaverade PCR-rör och skär ut locken och nedre koniska halvorna med ett skarpt kirurgiskt blad.

Ta de cylindriska halvskurna rören, applicera UV-härdbart lim på den släta kanten på varje skuret rör och placera det inverterat på en nyrengjord täckglas så att fälgen sitter platt på täckglaset. Flytta inte cylindern i sidled när den är placerad på täckglaset för att säkerställa att limet inte spills ut i kammarens centrala utrymme. Sätt kammarens lagerskydd inuti en UV-ozonrengörare med syretillförsel och vakuum.

Slå på UV-lampan och tänd i tre till fem minuter så att limet kan polymeriseras. Ta ut täckglasen och testa kamrarna för läckage och kassera de läckande kamrarna. Tvätta varje kammare med SLB-bildningsbuffert och lämna 100 mikroliter buffert i slutet.

Markera buffertnivån vid 100 mikroliter med en permanent markör, tillsätt sedan två mikroliter 0,1 molar kalciumklorid till kammaren, följt av åtta mikroliter SUV-lösningen till varje kammare och inkubera i 15 minuter vid 25 grader Celsius. Ta bort 50 mikroliter av SLB-bildningsbufferten, lämna endast 50 mikroliter i provkammaren, tillsätt sedan 100 mikroliter av en XKMEH till kammaren och blanda försiktigt. Ta bort 100 mikroliter av bufferten utan att röra vid botten.

Upprepa tvättarna åtta till 10 gånger genom att tillsätta 100 mikroliter av en XKMEH och ta bort 100 mikroliter. Tillsätt 10 mikroliter av ett milligram per milliliter beta-kasein till dubbelskiktet, blanda försiktigt och inkubera i fem till 10 minuter vid rumstemperatur. Tvätta bort beta-kasein tre gånger med en XKMEH och sätt tillbaka buffertnivån till 100 mikroliter.

Under beta-kaseininkubationen, ta ut en alikvot av membran-aktinlänkprotein för minus 80 grader Celsius tinas snabbt vid 37 grader Celsius och håll det sedan på is. Späd alikvoten med proteinutspädningsbuffert till en koncentration av en mikromolär. Tillsätt linkerproteinet till lösningen i en definierad slutlig koncentration och blanda försiktigt.

Inkubera i 30 till 40 minuter vid rumstemperatur och tvätta tre till fem gånger med en XKMEH-buffert för att avlägsna det obundna HSE-proteinet. För tillbaka buffertnivån i varje kammare till 100 mikroliter. Provet är nu klart för avbildning.

Slå på mikroskopet, excitationslasrarna och detekteringskamerorna. Se till att lasern är inriktad, målet rengörs och programvaran är redo att skaffa bilder. Sätt olja på 100 gånger målet, montera provet på mikroskopsteget och fokusera målet på dubbelskiktet.

Se till att laserpositionen är sådan att den genomgår total intern reflektion på provet. Använd en excitation på 488 nanometer. För att bestämma dubbelskiktets integritet, utför en snabb FRAP-analys genom att välja ett område av intresse på dubbelskiktet och spela in några bilder av synfältet med hjälp av bildförhållanden som ger ett signal-brusförhållande på fem till en eller högre.

Pausa inspelningen och stäng TIRF-mikroskopets fältmembran för att fokusera en koncentrerad laserstråle på ett litet cirkulärt område i dubbelskiktet för att lokalt bleka fluoroforerna. Slå på lasern till dess maximala utgång för att fotobleka det lilla området i tre till 10 sekunder och stäng sedan av lasern. Öppna fältmembranet igen till dess ursprungliga radie, justera avbildningstillståndet tillbaka till inställningarna före blekning och återuppta omedelbart inspelningen av återhämtningen av fluorescerande signal i synfältet.

Kontrollera om dubbelskiktet är flytande och spara bilderna som 16-bitars TIF-filer. Blanda omärkt och fluorescerande märkt G-aktin i ett 10 till ett molförhållande och fyll på det med G-buffert så att koncentrationen av G-aktin är 20 mikromolär. Tillsätt en tiondel av 10 gånger ME-bufferten till blandningen för en engångslösning och inkubera i två minuter vid rumstemperatur.

Därefter tina injektionsflaskan med capping proteinbuljong snabbt vid 37 grader Celsius och håll den sedan på is. Späd med G-buffertar så att koncentrationen av kapslingsprotein nu är dubbelt så hög som den önskade slutkoncentrationen och tillsätt sedan en lika stor volym av den utspädda kapslingsproteinlösningen till aktinblandningen. Slutligen tillsätt en lika stor volym färsk två gånger målbuffert till reaktionsblandningen.

Den slutliga volymen av lösningen bör vara fyra gånger volymen av aktinblandningen. Se till att den slutliga koncentrationen av komponenter är som beskrivs i textmanuskriptet. Inkubera proverna i mörkret vid 25 grader Celsius i 45 till 60 minuter för att möjliggöra polymerisation.

Pipettera försiktigt ut fem mikromolära polymeriserade aktin med en trubbig pipettspets och lägg den till ett rent autoklaverat PCR-rör. Tillsätt en XKMEH i röret för att göra den slutliga volymen mer än 20 mikroliter och blanda försiktigt för att undvika skjuvning av F-aktin. Ta bort en lika stor volym av bufferten från den monterade provkammaren.

Tillsätt den polymeriserade aktinlösningen i kammaren och pipettera försiktigt upp och ner tre gånger utan att vidröra dubbelskiktet längst ner. Montera provet på TIRF-mikroskopet och låt det vila i 20 till 30 minuter. Spela in några bilder från olika synfält efter att F-actin dessutom har nått ett stabilt tillstånd.

Efter 30 minuters aktinkubation, montera provet tillbaka på mikroskopet. Kontrollera signalen på länkproteinet och F-aktinkanalerna. Justera bildförhållandena om det behövs.

Välj en bra region för en lång tidsfördröjningsinspelning. Spela in 10 till 15 bilder vid 0,1 till 0,2 hertz före myosintillägg och pausa inspelningen. Pipettera ut den önskade volymen av återvunnen muskelmyosin två från lagerflaskan med en trubbig ände pipettspets och lägg till ett rent autoklaverat PCR-rör.

Tillsätt omedelbart en XKMEH i röret för att göra volymen mer än 20 mikroliter och blanda försiktigt. Ta försiktigt bort en lika stor volym av KMEH-bufferten från den monterade provkammaren utan att störa den och tillsätt försiktigt myosinlösningen till provkammaren. Pipettera inte upp och ner, eftersom det kommer att störa de ytbundna filamenten.

Återuppta omedelbart time-lapse-inspelningen och spara alla bilder och ta sedan bakgrundsbilder för alla kanaler med ett buffertprov. Spara alla bilder som TIF-filer. Det anpassade värdet på diffusionskoefficienten var 1, 34 kvadratmikrometer per sekund, vilket nära överensstämde med det formelbaserade beräknade värdet på 1, 39 kvadratmikrometer per sekund.

Linjeprofilen efter fotoblekning och återhämtningsprofilen för det blekta området passar ekvationerna fyra respektive fem. Den mobila fraktionen av lipid-dubbelskiktet som representerar fraktionen av den blekta befolkningen som återhämtar sig var större än 0,9, vilket indikerar ett bra lipid-dubbelskikt. Myosinaktivitet inducerade kontraktila aktomyosinflöden som uppstod i astroliknande strukturer vid steady state, vilket driver lokal klustring av den kopplade membrankomponenten.

Man kan använda en mängd olika mikroskopitekniker som interferometrisk spridningsmikroskopi för att studera dynamiken i omärkta aktomyosinnätverk utan att inducera någon fotoskada, eller använda fluorescensmikroskopi med superupplösning. Denna teknik banar väg för forskare som är intresserade av att förstå hur membranproteinkomplex interagerar med ett dynamiskt aktomyosinnätverk för att modulera deras arkitektur och sammansättning.