Name: differentiated mouse adipocytes in primary culture: a model of insulin resistance
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance at JoVE.com

Vi takker Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla og María Antonieta Carbajo for deres tekniske assistance og Jessica Gonzalez Norris for kritisk redigering af manuskriptet. Denne protokol blev støttet af Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (til Y.M.).

Alle gnaverforsøg blev godkendt af Bioethics Committee of the Institute of Neurobiology of the UNAM, protokolnummer 075.
1. Isolering af museadipocytprecursorceller
<ol><li>Aflive 8-10 uger gamle C57BL/6-hanmus (f.eks. ved CO2 indånding og efterfølgende cervikal dislokation) (fire dyr pr. isolation). Desinficer musene ved at gnide med 70% ethanol og få fedtvævet umiddelbart efter ofring. BEMÆRK: Efter eutanasi af gnavere skal du straks isolere fedtvævet ...

<ol>
	<li>Elmus, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signaling+and+insulin+resistance.">Insulin signaling and insulin resistance.</a> Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).</li><li>Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+stimulates+tyrosine+phosphorylation+of+the+insulin+receptor+in+a+cell-free+system.">Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system.</a> Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).</li><li>Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+stimulates+the+phosphorylation+of+the+95,000-dalton+subunit+of+its+own+receptor.">Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor.</a> Science. 215 (4529), 185-187 (1982).</li><li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Insulin Resistance. StatPearls Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/</a> (2021)</li><li>Petersen, M. C., Shulm, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+insulin+action+and+insulin+resistance.">Mechanisms of insulin action and insulin resistance.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).</li><li>Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+underlying+defect+in+insulin+action+in+type+2+diabetes.">Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).</li><li>Unamuno, X., Fr&#252;hbeck, G., Catal&#225;n, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue.">Adipose Tissue.</a> Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , 370-384 (2019).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pink+adipocytes.">Pink adipocytes.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).</li><li>Kahn, B. B., Flier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+insulin+resistance.">Obesity and insulin resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).</li><li>Klemm, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-induced+adipocyte+differentiation.">Insulin-induced adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).</li><li>Wilcox, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+and+insulin+resistance.">Insulin and insulin resistance.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).</li><li>Yohannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+insulin+resistance,+and+type+2+diabetes:+associations+and+therapeutic+implications.">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).</li><li>James, D. E., St&#246;ckli, J., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+and+molecular+landscape+of+insulin+resistance.">The etiology and molecular landscape of insulin resistance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).</li><li>Wondmkun, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+insulin+resistance,+and+type+2+diabetes:+associations+and+therapeutic+implications.">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).</li><li>Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+causes+the+insulin+resistance+underlying+obesity.">What causes the insulin resistance underlying obesity.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).</li><li>Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-J&#228;rvinen, H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+does+obesity+cause+diabetes.">Why does obesity cause diabetes.</a> Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).</li><li>Lo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+in+vitro+insulin-resistance+models+and+their+physiological+relevance+to+in+vivo+diet-induced+adipose+insulin+resistance.">Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance.</a> Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).</li><li>Asterholm, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+inflammation+is+essential+for+healthy+adipose+tissue+expansion+and+remodeling.">Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling.</a> Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).</li><li>Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+inhibits+signaling+from+the+insulin+receptor.">Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).</li><li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-&#945;+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activates+expression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes.+Nuclear+factor-&#954;B+activation+by+TNF-&#945;+is+obligatory.">Tumor necrosis factor-&#945; suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-&#954;B activation by TNF-&#945; is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li><li>Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+receptor+signaling+in+normal+and+insulin-resistant+states.">Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).</li><li>Hotamisligil, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRS-1-mediated+inhibition+of+insulin+receptor+tyrosine+kinase+activity+in+TNF-alpha-+and+obesity-induced+insulin+resistance.">IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance.</a> Science. 271 (5249), 665-668 (1996).</li><li>Copps, K. D., White, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+insulin+sensitivity+by+serine/threonine+phosphorylation+of+insulin+receptor+substrate+proteins+IRS1+and+IRS2.">Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2.</a> Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).</li><li>Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+western+blots:+pitfalls+of+densitometry.">Quantifying western blots: pitfalls of densitometry.</a> Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).</li><li>Skurk, T., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+human+adipocyte+precursor+cells:+expansion+and+differentiation.">Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).</li><li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots.">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+white+adipocyte+proliferation.">The biology of white adipocyte proliferation.</a> Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).</li><li>Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipogenesis+and+aging:+does+aging+make+fat+go+MAD.">Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD.</a> Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).</li><li>Guo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+results+in+paradoxical+susceptibility+of+fat+cell+progenitors+to+lipotoxicity.">Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).</li><li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F.Tumor+necrosis+factor-a+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activatesexpression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes:+nuclear+factor-kappaB+activation+by+TNF-a+is+obligatory.">F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li><li>Jager, J., Gre &#769;meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1b-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+throughdown-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-6+(IL-6)+induces+insulinresistance+in+3T3-L1+adipocytes+and+is,+like+IL-8+and+tumor+necrosis+factor-a,overexpressed+in+human+fat+cells+from+insulin-resistant+subjects.">Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).</li><li>Isidor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+rewires+the+metabolic+gene+program+and+glucose+utilization+in+human+white+adipocytes.">Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes.</a> International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).</li><li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance.">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li></ol>

Dette papir giver en metode til undersøgelse af insulinresistens, der bruger primære adipocytter i kultur behandlet med TNF-α. Denne model har den fordel, at primære adipocytter kan dyrkes under definerede betingelser i lange perioder med en stram kontrol af cellulære miljøfaktorer26. Assayvarigheden er 15-20 dage, selvom variationer i procentdelen af differentierede adipocytter kan forekomme mellem eksperimenter. Primære adipocytter har fordele i forhold til cellelinjer, da de ikke kontinu...

Insulin er et anabolsk hormon produceret af bugspytkirteløen β-celler og nøgleregulatoren for glukose- og lipidmetabolisme. Blandt dets mange funktioner regulerer insulin glukoseoptagelse, glykogensyntese, glukoneogenese, proteinsyntese, lipogenese og lipolyse1. Det indledende molekylære signal efter insulininteraktion med dets receptor (IR) er aktiveringen af den iboende tyrosinproteinkinaseaktivitet afIR2, hvilket resulterer i dets autophosphorylering3 og den efterfølgende aktivering af en familie af proteiner kendt som insulinreceptorsubstrater (IRS), som binder til adaptorproteiner, hvilket fører til aktivering af en kaskade af proteinkinaser4 . Insulin aktiverer to hovedsignalveje: phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-proteinkinase B (AKT) og Ras-mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK). Førstnævnte udgør et vigtigt grenpunkt eller knude 4,5 til aktivering af adskillige downstream-effektorer, der er involveret i forskellige fysiologiske funktioner, herunder regulering af brændstofhomeostase, mens sidstnævnte regulerer cellevækst og differentiering 4,6. Insulinhandlinger afhænger i sidste ende af celletypen og den fysiologiske kontekst7.
Et af de vigtigste insulinresponsive metaboliske væv er fedtvævet. Hvidt fedtvæv er den mest rigelige type fedt hos mennesker og gnavere, fordelt inden for subkutant fedt (mellem hud og muskler) og visceralt fedt (omkring organerne i bughulen). På grund af deres store volumen er adipocytter eller fedtceller den mest rigelige celletype i fedtvæv. Disse fedtceller kan være brune/beige (termogene), lyserøde (i brystkirtlen) og hvide 8,9. Hvide adipocytter holder de vigtigste energireserver i kroppen i form af triglycerider, en insulinafhængig proces. Insulin fremmer glukosetransport og lipogenese, mens det hæmmer lipolyse eller lipidnedbrydning 7,10. Det letter også differentieringen af preadipocytter i adipocytter - de modne fedtlagrende celler11.
Insulinresistens opstår, når et normalt insulinniveau producerer et svækket biologisk respons, hvilket resulterer i kompenserende hyperinsulinæmi12. Insulinresistens er en tilstand forbundet med overvægt og fedme5, at når kombineret fører til type 2-diabetes (T2D) og andre metaboliske sygdomme13. Hyperinsulinæmi kompenserer insulinresistens i perifere væv for at opretholde normale blodsukkerniveauer14. Imidlertid fører eventuelt tab eller udmattelse af β celler sammen med forværret insulinresistens til forhøjede blodsukkerniveauer i overensstemmelse med T2D5. Derfor kan insulinresistens og hyperinsulinæmi bidrage til udviklingen af fedmeafledte metaboliske sygdomme15. Desuden kan fedme forårsage kronisk lavgradig lokal inflammation, der fremmer insulinresistens i fedtvæv15,16,17. Derudover fører fedmeafledte ændringer i fedtvæv, såsom fibrose, inflammation og reduceret angiogenese og adipogenese, til lavere adiponectinserumniveauer (et insulinsensibilisator) og øget sekretion af faktorer såsom plasminogenaktivatorhæmmer 1 (PAI-1), frie fedtsyrer og eksosomer i blodbanen, hvilket forværrer insulinresistens17.
Mange aspekter af insulinresistens forbliver ukendte. In vitro og in vivo modeller er blevet udviklet til at studere de mekanismer, der medierer insulinresistens i større målvæv, herunder fedtvæv. Fordelen ved in vitro-modeller er, at forskerne har mere kontrol over miljøforholdene og kan vurdere insulinresistens i specifikke celletyper. Især har adipocytprecursorceller (APC'er) donorvævets individuelle fænotype, hvilket kan afspejle fysiologi bedre end adipocytcellelinjer. En hovedfaktor, der inducerer insulinresistens in vitro, er tumornekrosefaktor-α (TNF-α). TNF-α er et proinflammatorisk cytokin udskilt af adipocytter og makrofager i fedtvæv18. Mens det er nødvendigt for korrekt fedtvæv remodellering og ekspansion19, langvarig eksponering for TNF-α inducerer insulinresistens i fedtvæv in vivo og i adipocytter in vitro20. Kronisk TNF-α behandling af flere celletyper fører til øget serinphosphorylering af både IR og IRS-1 og derved fremmer nedsat tyrosinphosphorylering21. Øget phosphorylering af IRS-1 på serinrester hæmmer IR-tyrosinkinaseaktiviteten og kan være en af de vigtigste mekanismer, hvormed kronisk TNF-α-behandling forringer insulinvirkningen22,23. TNF-α aktiverer veje, der involverer serin/threoninkinasehæmmeren af kernefaktor ĸB-kinase β (IKKβ) og c-Jun N terminalkinase (JNK)24. JNK inducerer et komplekst proinflammatorisk transkriptionsprogram, men også direkte phosphorylater IRS-16.
Forståelse af patogenesen af insulinresistens er blevet stadig vigtigere for at styre udviklingen af fremtidige terapier mod T2D. APC'er har vist sig at være en fremragende model til undersøgelse af fedtcellebiologi, herunder følsomhed og resistens over for insulin, og til identifikation af de iboende egenskaber ved adipocytter uafhængigt af det systemiske miljø. APC'er kan let opnås fra forskellige fedtdepoter og under passende betingelser differentieres til modne adipocytter. Med denne metode kan direkte virkninger på insulinresistens/følsomhed evalueres i adipocytter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Isolation mouse adipocyte precursor cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer&#160;</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin Microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0311-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Equitech-Bio, Inc.</td>
			<td>BAC63-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12800017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS mix</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid-albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 201 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-nr-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-18</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peniciline-Streptomycine</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (70 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5020-BP-010</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1756</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>71742</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-005&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0404</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem E system</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td>Running and Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2- mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>907007</td>
			<td>Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3624-05</td>
			<td>TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77F-0379</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH&#160;</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3722-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P2O7</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>114F-0762</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein standard&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho- Insulin Receptor &#946;&#160;</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Akt (Ser473) Antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose&#160;</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>407205</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610302</td>
			<td>Running and laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td>Running, transfer and laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4103-02</td>
			<td>RIPA buffer - TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>TBS-T</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiated mouse adipocytes in primary culture: a model of insulin resistance

Insulinresistens er en reduceret virkning af insulin på dets målceller, normalt afledt af nedsat insulinreceptorsignalering. Insulinresistens bidrager til udviklingen af type 2-diabetes (T2D) og andre fedmeafledte sygdomme med høj forekomst på verdensplan. Derfor er forståelse af mekanismerne bag insulinresistens af stor relevans. Flere modeller er blevet brugt til at studere insulinresistens både in vivo og in vitro; Primære adipocytter repræsenterer en attraktiv mulighed for at studere mekanismerne for insulinresistens og identificere molekyler, der modvirker denne tilstand og de molekylære mål for insulinsensibiliserende lægemidler. Her har vi etableret en insulinresistensmodel ved hjælp af primære adipocytter i kultur behandlet med tumornekrosefaktor-α (TNF-α).
Adipocytprecursorceller (APC'er), isoleret fra kollaganasefordøjet musesubkutant fedtvæv ved magnetisk celleseparationsteknologi, differentieres til primære adipocytter. Insulinresistens induceres derefter ved behandling med TNF-α, et proinflammatorisk cytokin, der reducerer tyrosinphosphoryleringen / aktiveringen af medlemmer af insulinsignalkaskaden. Nedsat phosphorylering af insulinreceptor (IR), insulinreceptorsubstrat (IRS-1) og proteinkinase B (AKT) kvantificeres ved western blot. Denne metode giver et fremragende værktøj til at studere de mekanismer, der medierer insulinresistens i fedtvæv.

I løbet af de sidste par år har den øgede forekomst af fedme og T2D givet anledning til en intens søgning efter de mekanismer, der medierer insulinresistens i fedtvæv. Med protokollen beskrevet her kan APC'er differentieres til modne adipocytter for at evaluere insulinresistens og følsomhed. Når APC'erne når sammenløb, tager det 10 dage at fuldføre deres differentiering i modne adipocytter og deres TNF-α-medierede induktion af insulinresistens (figur 1).
<p class="jove_content...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance at JoVE.com

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

Denne protokol beskriver isoleringen af musepreadipocytter fra subkutant fedt, deres differentiering i modne adipocytter og induktionen af insulinresistens. Insulinvirkningen evalueres ved phosphorylering/aktivering af medlemmer af insulinsignalvejen gennem western blot. Denne metode muliggør direkte bestemmelse af insulinresistens/følsomhed i primære adipocytter.

Differentierede museadipocytter i primær kultur: en model for insulinresistens

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

Insulinresistens kan evalueres i primære adipocytter, hvilket muliggør undersøgelse af donorer under forskellige fysiopatologiske sammenhænge, såsom magert versus overvægtigt eller celler fra forskellige fedtaflejringer. Primære adipocytter bevarer mange af deres iboende egenskaber og kan dyrkes under definerede betingelser i lang tid med en stram kontrol af cellulære miljøfaktorer. For at starte differentieringsprocessen skal cellerne være ved 80% sammenløb.Hvis differentiering starter ved en lavere eller højere sammenløb, vil celler differentiere mindre eller miste deres differentieringskapacitet. Efter ofring af dyret desinficeres musene ved at gnide med 70% ethanol. Disseker det inguinale subkutane fedtvæv fra hver mus og saml det i et 15 ml konisk rør, der indeholder 15 ml type en kollaganaseopløsning på is.Skær fedtvævet i små stykker med steril kirurgisk saks og fordøje prøverne ved inkubation med type en kollagenaseopløsning ved 37 grader Celsius i en orbitalryster ved 150 RPM i 30 minutter. Kontroller fordøjelsen hvert 10. minut for at sikre, at den virker, og for at forhindre overfordøjelse. Filtrer ved hjælp af en 200 mikrometer maskesprøjte for at fjerne vævet, der ikke fordøjes med collagenase, og før filteret over kanten af røret for at dræne så mange celler som muligt ind i opløsningen.Tilsæt 15 ml kold DMEM 1%BSA for at stoppe fordøjelsen, og centrifuger ved 400 G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Aspirer det øverste lag indeholdende modne adipocytter og det meste af det flydende lag. Tilsæt 20 ml kold PBS 2% FBS til det og resuspender pelleten.Efter centrifugering igen i fem minutter fjernes supernatanten ved at opsuge det øverste lag for at fjerne de resterende adipocytter og fedt. Resuspender pellet i en milliliter ACK lysing buffer. Inkuber på is i fem minutter.Tilsæt 10 ml PBS 2%FBS og bland det. Efter centrifugering i fem minutter og opsugning af supernatanten resuspenderes pelletten i 200 mikroliter anti-FC-opløsning. Inkuber på is i fem minutter og overfør cellesuspensionen til et fem milliliter rør, der passer ind i de forkølede stativer i en magnetisk celleseparator.Efter centrifugering i fem minutter og eliminering af supernatanten tilsættes 200 mikroliter af blandingen af CD 31 monoklonalt antistofbiotin og CD 45 monoklonalt antistofbiotin til den. Bland godt og inkuber på is i 15 minutter. Derefter tilsættes 400 mikroliter PBS 2% FBS og centrifugeres igen ved 400 G i fem minutter ved fire grader Celsius.Supernatanten suges til synkende og inkuberes i 100 mikroliter antibiotinmikroperler i 15 minutter på is. Tilsæt 400 mikroliter PBS 2% FBS og centrifuger igen ved 400 G i fem minutter ved fire grader Celsius, som vist tidligere. Efter at supernatanten er kasseret, resuspenderes pelletten i 350 mikroliter PBS 2% FBS.For at fjerne celleaggregaterne eller store partikler fra enkeltcellesuspensionerne med et 70 mikrometer forseparationsfilter skal du aktivere filteret med 100 mikroliter PBS 2% FBS. Før cellesuspensionen gennem filteret, og saml den i et rent rør. Vask derefter filteret med 100 mikroliter PBS 2%FBS.For at udføre magnetisk adskillelse af celler ved hjælp af den negative separationsstrategi skal prøven placeres i position A i kølestativet og to tomme rør i position B og C for at genvinde de ikke-mærkede og mærkede celler. Læg derefter vaskebufferen og løbebufferen i de tilsvarende flasker. I separationsafsnittet skal du vælge antallet af prøver, der skal adskilles, og vælge nedbrydelsesprotokollen.Tryk på kør, og start adskillelsen. I slutningen af programmet skal du gendanne de umærkede celler. Overtræk derefter en 12-brønds plade med kældermembranmatrix ved at tilføje 400 mikroliter 2,5% kældermembranmatrix for at dække hele overfladen af hver brønd.Fjern overskydende opløsning, og lad pladen tørre inde i laminar flowhætten i mindst en time. Efter centrifugering i fem minutter og kassering af supernatanten resuspenderes pellet i 500 mikroliter vækstmedium. Frø adipocytforløbercellerne eller APC'erne i en brønd i den 12-brønds plade, der tidligere var belagt med 2,5% kældermembranmatrix.Inkuber ved 37 grader Celsius i en 5% kuldioxidatmosfære, og skift mediet hver 48. time, indtil cellerne når 80% sammenløb. Efter fjernelse af mediet skal cellerne vaskes med 350 mikroliter PBS 2% FBS. Høst cellerne med 350 mikroliter 0,05% tripsin EDTA i to minutter ved 37 grader Celsius, og tilsæt to milliliter vækstmedium.Saml cellerne i et nyt 50 ml konisk rør og centrifuger ved 400 G i fem minutter. Passage APC'erne til 12-brønds plader, der tidligere var belagt med 2,5% kældermembranmatrix, og inkuber ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid. Skift mediet hver 48. time, indtil cellerne når 80% sammenløb.Ved 80% sammenløb aspireres ethvert vækstmedium og erstattes med 500 mikroliter differentieringsmedium, der indeholder 3,3 nanomolært knoglemorfogenetisk protein i hver brønd. Efter 48 timer udskiftes mediet med 500 mikroliter pr. Brønddifferentieringsmedium og differentieringscocktailen. Fjern mediet 72 timer senere, og tilsæt 100 nanomolær insulin i 500 mikroliter frisk differentieringsmedium.48 timer senere, fremkalde insulinresistens med fire nanogram per milliliter tumornekrose faktor alfa, eller TNF alfa. Opsug ethvert differentieringsmedium og erstat det med 500 mikroliter simpelt medium 2% FBS med TNF alpha. Efter inkubation i 24 timer tilsættes fire nanogram pr. milliliter TNF alfa i et simpelt medium 0% FBS.Aktivér insulinsignalvejen 24 timer senere ved at tilsætte 100 nanomolært insulin og inkubere i 15 minutter ved 37 grader Celsius i en 5% kuldioxidatmosfære, som vist tidligere. Efter inkubation fjernes mediet og vaskes med 500 mikroliter PBS, herunder en kontrolbrønd uden insulinbehandling. Ekstraher protein og mål fosforylering af insulin-signalering markører af Western blot.Subkutane adipocytprecursorceller ved 80% sammenløb før inducerende differentiering i 12-brønds kulturpladerne og primære adipocytter efter syv dages inducerende differentiering er vist i denne figur. Insulinresistensen induceret af TNF alfa i subkutane primære adipocytter blev påvist ved nedsat insulininduceret phosphorylering af insulinreceptor, insulinreceptorsubstrat et og proteinkinase B eller AKT. Membranen blev undersøgt med antiphosphoryleret insulinreceptor, antiphosphoryleret insulinreceptorsubstrat et, antiphosphoryleret AKT og anti-beta-tubulin blev anvendt som belastningskontrol.Signalet blev visualiseret med kemiluminescensdetektion. De repræsentative blots og kvantificeringen fra tre uafhængige eksperimenter er vist her. Når du forsøger denne procedure, er en ting, der skal tages hånd om, at induktionen af insulinresistens med TNF alfa er med 2% FBS i 24 timer og med 0% FBS i de sidste 24 timer.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rotte levercellerne

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering og dyrkning af Mouse Primære Pancreas acinarceller

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

En video-protokollen af ​​retroviral infektion i Primary Intestinal organoide Kultur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validering af en musemodel at afbryde LINC komplekser i en celle-specifik måde

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Måling af glukoseoptagelse og reaktion på insulinstimulering i<em&gt; In Vitro</em&gt; Cultured Human Primary Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering og kultur af primære muskeratinocytter fra neonatal og voksen mus hud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

En vævskultur Model af østrogen-producerende primære Bovine Granulosa-celler

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...