Name: differentiated mouse adipocytes in primary culture: a model of insulin resistance
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00
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Wir danken Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla und María Antonieta Carbajo für ihre technische Unterstützung und Jessica Gonzalez Norris für die kritische Bearbeitung des Manuskripts. Dieses Protokoll wurde vom Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), dem Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (an Y.M.) unterstützt.

Alle Nagetierexperimente wurden von der Bioethikkommission des Instituts für Neurobiologie der UNAM, Protokollnummer 075, genehmigt.
1. Isolierung von Adipozyten-Vorläuferzellen der Maus
<ol><li>8-10 Wochen alte männliche C57BL/6-Mäuse einschläfern (z. B. durch CO2 -Inhalation und anschließende Zervixluxation) (vier Tiere pro Isolierung). Desinfizieren Sie die Mäuse durch Einreiben mit 70%igem Ethanol und erhalten Sie das Fettgewebe sofort nach der Opferung...

<ol>
	<li>Elmus, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signaling+and+insulin+resistance.">Insulin signaling and insulin resistance.</a> Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).</li><li>Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+stimulates+tyrosine+phosphorylation+of+the+insulin+receptor+in+a+cell-free+system.">Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system.</a> Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).</li><li>Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+insulin+resistance,+and+type+2+diabetes:+associations+and+therapeutic+implications.">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).</li><li>James, D. E., St&#246;ckli, J., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+and+molecular+landscape+of+insulin+resistance.">The etiology and molecular landscape of insulin resistance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).</li><li>Wondmkun, Y. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1b-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+throughdown-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-6+(IL-6)+induces+insulinresistance+in+3T3-L1+adipocytes+and+is,+like+IL-8+and+tumor+necrosis+factor-a,overexpressed+in+human+fat+cells+from+insulin-resistant+subjects.">Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).</li><li>Isidor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+rewires+the+metabolic+gene+program+and+glucose+utilization+in+human+white+adipocytes.">Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes.</a> International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).</li><li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance.">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li></ol>

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Untersuchung der Insulinresistenz vorgestellt, bei der primäre Adipozyten in Kulturen verwendet werden, die mit TNF-α behandelt wurden. Dieses Modell hat den Vorteil, dass primäre Adipozyten unter definierten Bedingungen über lange Zeiträume mit einer strengen Kontrolle zellulärer Umweltfaktoren kultiviert werden können26. Die Testdauer beträgt 15-20 Tage, obwohl es zwischen den Experimenten zu Abweichungen im Prozentsatz der differenzierten Adipozyte...

Insulin ist ein anaboles Hormon, das von den β-Zellen der Pankreasinsel produziert wird und der Schlüsselregulator des Glukose- und Fettstoffwechsels ist. Insulin reguliert unter anderem die Glukoseaufnahme, die Glykogensynthese, die Gluconeogenese, die Proteinsynthese, die Lipogenese und die Lipolyse1. Das erste molekulare Signal nach der Interaktion von Insulin mit seinem Rezeptor (IR) ist die Aktivierung der intrinsischen Tyrosinkinase-Aktivität von IR2, was zu seiner Autophosphorylierung3 und der anschließenden Aktivierung einer Familie von Proteinen führt, die als Insulinrezeptorsubstrate (IRS) bekannt sind und an Adapterproteine binden, was zur Aktivierung einer Kaskade von Proteinkinasenführt 4 . Insulin aktiviert zwei Hauptsignalwege: die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K)-Proteinkinase B (AKT) und die Ras-Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK). Ersterer stellt einen wichtigen Verzweigungspunkt oder Knoten 4,5 für die Aktivierung zahlreicher nachgeschalteter Effektoren dar, die an verschiedenen physiologischen Funktionen beteiligt sind, einschließlich der Regulation der Brennstoffhomöostase, während letzterer das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung reguliert 4,6. Die Insulinwirkung hängt letztendlich vom Zelltyp und dem physiologischen Kontext ab7.
Eines der wichtigsten insulinempfindlichen Stoffwechselgewebe ist das Fettgewebe. Weißes Fettgewebe ist die am häufigsten vorkommende Art von Fett bei Menschen und Nagetieren, verteilt in subkutanem Fett (zwischen Haut und Muskeln) und viszeralem Fett (um die Organe in der Bauchhöhle). Aufgrund ihres großen Volumens sind Adipozyten oder Fettzellen der am häufigsten vorkommende Zelltyp im Fettgewebe. Diese Fettzellen können braun/beige (thermogen), rosa (in der Brustdrüse) und weiß sein 8,9. Weiße Adipozyten halten die wichtigsten Energiereserven im Körper in Form von Triglyceriden, einem insulinabhängigen Prozess. Insulin fördert den Glukosetransport und die Lipogenese, während es die Lipolyse oder den Lipidabbau hemmt 7,10. Es erleichtert auch die Differenzierung von Präadipozyten in Adipozyten – die reifen fettspeichernden Zellen11.
Eine Insulinresistenz tritt auf, wenn ein normaler Insulinspiegel eine abgeschwächte biologische Reaktion hervorruft, was zu einer kompensatorischen Hyperinsulinämie führt12. Insulinresistenz ist eine Erkrankung, die mit Übergewicht und Adipositas einhergeht5 und in Kombination zu Typ-2-Diabetes (T2D) und anderen Stoffwechselerkrankungen führt13. Hyperinsulinämie kompensiert die Insulinresistenz im peripheren Gewebe, um einen normalen Blutzuckerspiegel aufrechtzuerhalten14. Ein eventueller Verlust oder eine Erschöpfung β Zellen führt jedoch zusammen mit einer verschlimmerten Insulinresistenz zu erhöhten Blutzuckerspiegeln, die mit T2D5 übereinstimmen. Daher können Insulinresistenz und Hyperinsulinämie zur Entwicklung von Adipositas-bedingten Stoffwechselerkrankungen beitragen15. Darüber hinaus kann Adipositas eine chronische, niedriggradige lokale Entzündung verursachen, die die Insulinresistenz im Fettgewebe fördert15,16,17. Darüber hinaus führen durch Fettleibigkeit verursachte Veränderungen des Fettgewebes, wie z. B. Fibrose, Entzündungen und eine verminderte Angiogenese und Adipogenese, zu niedrigeren Adiponektin-Serumspiegeln (einem Insulinsensibilisator) und einer erhöhten Sekretion von Faktoren wie dem Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1), freien Fettsäuren und Exosomen in den Blutkreislauf, was die Insulinresistenz verschlimmert17.
Viele Aspekte, die der Insulinresistenz zugrunde liegen, sind noch unbekannt. In-vitro- und In-vivo-Modelle wurden entwickelt, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Insulinresistenz in wichtigen Zielgeweben, einschließlich des Fettgewebes, vermitteln. Der Vorteil von In-vitro-Modellen besteht darin, dass die Forscher die Umweltbedingungen besser kontrollieren und die Insulinresistenz in bestimmten Zelltypen beurteilen können. Insbesondere Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs) weisen den individuellen Phänotyp des Spendergewebes auf, der die Physiologie besser widerspiegeln könnte als Adipozyten-Zelllinien. Ein Hauptfaktor, der die Insulinresistenz in vitro induziert, ist der Tumornekrosefaktor-α (TNF-α). TNF-α ist ein proinflammatorisches Zytokin, das von Adipozyten und Makrophagen im Fettgewebe sezerniertwird 18. Während es für den korrekten Umbau und die Expansion des Fettgewebes erforderlich ist19, induziert eine langfristige Exposition gegenüber TNF-α eine Insulinresistenz im Fettgewebe in vivo und in Adipozyten in vitro20. Die chronische TNF-α-Behandlung verschiedener Zelltypen führt zu einer erhöhten Serinphosphorylierung sowohl von IR als auch von IRS-1, wodurch eine verminderte Tyrosinphosphorylierung gefördertwird 21. Eine erhöhte Phosphorylierung von IRS-1 auf Serinresten hemmt die Aktivität der IR-Tyrosinkinase und könnte einer der Schlüsselmechanismen sein, durch die eine chronische TNF-α-Behandlung die Insulinwirkung beeinträchtigt22,23. TNF-α aktiviert Signalwege, die den Serin/Threonin-Kinase-Inhibitor der nukleären Faktor-ĸB-Kinase β (IKKβ) und der c-Jun N-terminalen Kinase (JNK) betreffen24. JNK induziert ein komplexes proinflammatorisches Transkriptionsprogramm, phosphoryliert aber auch direkt IRS-16.
Das Verständnis der Pathogenese der Insulinresistenz wird immer wichtiger, um die Entwicklung zukünftiger Therapien gegen T2D zu steuern. APCs haben sich als hervorragendes Modell für die Untersuchung der Fettzellbiologie, einschließlich der Sensitivität und Resistenz gegenüber Insulin, und für die Identifizierung der intrinsischen Eigenschaften von Adipozyten unabhängig von der systemischen Umgebung erwiesen. APCs können leicht aus verschiedenen Fettdepots gewonnen und unter geeigneten Bedingungen in reife Adipozyten differenziert werden. Mit dieser Methode können direkte Effekte auf die Insulinresistenz/-sensitivität in Adipozyten untersucht werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Isolation mouse adipocyte precursor cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer&#160;</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin Microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0311-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Equitech-Bio, Inc.</td>
			<td>BAC63-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12800017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS mix</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid-albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 201 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-nr-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-18</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peniciline-Streptomycine</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (70 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5020-BP-010</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1756</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>71742</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-005&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0404</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem E system</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td>Running and Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2- mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>907007</td>
			<td>Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3624-05</td>
			<td>TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77F-0379</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH&#160;</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3722-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P2O7</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>114F-0762</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein standard&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho- Insulin Receptor &#946;&#160;</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Akt (Ser473) Antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose&#160;</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>407205</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610302</td>
			<td>Running and laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td>Running, transfer and laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4103-02</td>
			<td>RIPA buffer - TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>TBS-T</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiated mouse adipocytes in primary culture: a model of insulin resistance

Insulinresistenz ist eine verminderte Wirkung von Insulin auf seine Zielzellen, die in der Regel auf eine verminderte Signalübertragung der Insulinrezeptoren zurückzuführen ist. Insulinresistenz trägt zur Entwicklung von Typ-2-Diabetes (T2D) und anderen durch Fettleibigkeit verursachten Krankheiten mit hoher Prävalenz weltweit bei. Daher ist es von großer Relevanz, die Mechanismen zu verstehen, die der Insulinresistenz zugrunde liegen. Mehrere Modelle wurden verwendet, um die Insulinresistenz sowohl in vivo als auch in vitro zu untersuchen. Primäre Adipozyten stellen eine attraktive Option dar, um die Mechanismen der Insulinresistenz zu untersuchen und Moleküle zu identifizieren, die diesem Zustand entgegenwirken, sowie die molekularen Ziele von insulinsensibilisierenden Medikamenten. In dieser Arbeit haben wir ein Insulinresistenzmodell mit primären Adipozyten in Kulturen etabliert, die mit Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) behandelt wurden.
Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs), die aus Kollagenase-verdautem subkutanem Fettgewebe der Maus mittels Magnetzelltrennungstechnologie isoliert wurden, werden in primäre Adipozyten differenziert. Die Insulinresistenz wird dann durch die Behandlung mit TNF-α induziert, einem proinflammatorischen Zytokin, das die Tyrosinphosphorylierung/-aktivierung von Mitgliedern der Insulinsignalkaskade reduziert. Die verminderte Phosphorylierung des Insulinrezeptors (IR), des Insulinrezeptorsubstrats (IRS-1) und der Proteinkinase B (AKT) wird mittels Western Blot quantifiziert. Diese Methode bietet ein hervorragendes Werkzeug, um die Mechanismen zu untersuchen, die die Insulinresistenz im Fettgewebe vermitteln.

Die zunehmende Prävalenz von Adipositas und T2D hat in den letzten Jahren zu einer intensiven Suche nach den Mechanismen geführt, die die Insulinresistenz im Fettgewebe vermitteln. Mit dem hier beschriebenen Protokoll können APCs in reife Adipozyten differenziert werden, um die Insulinresistenz und -sensitivität zu bewerten. Sobald die APCs die Konfluenz erreicht haben, dauert es 10 Tage, bis ihre Differenzierung in reife Adipozyten und ihre TNF-α-vermittelte Induktion der Insulinresistenz abgeschlossen sind (<stron...

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Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Präadipozyten der Maus aus subkutanem Fett, ihre Differenzierung in reife Adipozyten und die Induktion einer Insulinresistenz. Die Insulinwirkung wird durch die Phosphorylierung/Aktivierung von Mitgliedern des Insulin-Signalwegs durch Western Blot bewertet. Diese Methode ermöglicht die direkte Bestimmung der Insulinresistenz/-sensitivität in primären Adipozyten.

Differenzierte Mausadipozyten in Primärkultur: ein Modell der Insulinresistenz

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

Die Insulinresistenz kann in primären Adipozyten untersucht werden, was die Untersuchung von Spendern in verschiedenen physiopathologischen Kontexten ermöglicht, wie z. B. mager oder fettleibig oder Zellen aus verschiedenen Fettdepots. Primäre Adipozyten behalten viele ihrer intrinsischen Eigenschaften bei und können unter definierten Bedingungen über einen langen Zeitraum kultiviert werden, wobei zelluläre Umweltfaktoren streng kontrolliert werden. Um den Differenzierungsprozess zu starten, müssen die Zellen eine Konfluenz von 80 % aufweisen.Beginnt die Differenzierung bei einer niedrigeren oder höheren Konfluenz, differenzieren sich die Zellen weniger oder verlieren ihre Differenzierungsfähigkeit. Desinfizieren Sie die Mäuse nach der Tötung des Tieres, indem Sie sie mit 70%igem Ethanol einreiben. Sezieren Sie das subkutane Fettgewebe der Leistenhaut von jeder Maus und sammeln Sie es in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen, das 15 Milliliter Kollagenaselösung vom Typ 1 auf Eis enthält.Schneiden Sie das Fettgewebe mit einer sterilen chirurgischen Schere in kleine Stücke und verdauen Sie die Proben durch Inkubation mit Kollagenaselösung vom Typ 1 bei 37 Grad Celsius in einem Orbitalschüttler bei 150 U/min für 30 Minuten. Überprüfen Sie die Verdauung alle 10 Minuten, um sicherzustellen, dass sie funktioniert, und um eine Überverdauung zu vermeiden. Filtern Sie mit einer 200-Mikrometer-Netzspritze, um das nicht mit Kollagenase verdaute Gewebe zu entfernen, und führen Sie den Filter über den Rand des Röhrchens, um so viele Zellen wie möglich in die Lösung zu entwässern.Fügen Sie 15 Milliliter kaltes DMEM 1%BSA hinzu, um die Verdauung zu stoppen, und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 400 G bei vier Grad Celsius. Saugen Sie die oberste Schicht mit reifen Adipozyten und den größten Teil der Flüssigkeitsschicht ab. Fügen Sie 20 Milliliter kaltes PBS 2%FBS hinzu und resuspendieren Sie das Pellet.Nachdem Sie erneut fünf Minuten lang zentrifugiert haben, entfernen Sie den Überstand, indem Sie die obere Schicht absaugen, um die verbleibenden Adipozyten und das Fett zu entfernen. Resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter ACK-Lysepuffer. Fünf Minuten auf Eis inkubieren.Fügen Sie 10 Milliliter PBS 2% FBS hinzu und mischen Sie es. Nachdem Sie fünf Minuten lang zentrifugiert und den Überstand abgesaugt haben, resuspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern Anti-FC-Lösung. Inkubieren Sie fünf Minuten lang auf Eis und übertragen Sie die Zellsuspension in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen, das in die vorgekühlten Racks eines Magnetzellenseparators passt.Nachdem Sie fünf Minuten lang zentrifugiert und den Überstand entfernt haben, fügen Sie 200 Mikroliter der Mischung aus monoklonalem Antikörper CD 31 Biotin und monoklonalem Antikörper CD 45 Biotin hinzu. Gut mischen und 15 Minuten auf Eis inkubieren. Dann 400 Mikroliter PBS 2%FBS zugeben und erneut bei 400 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.Saugen Sie den Überstand ab und inkubieren Sie ihn in 100 Mikrolitern Anti-Biotin-Mikrokügelchen 15 Minuten lang auf Eis. Fügen Sie 400 Mikroliter PBS 2%FBS hinzu und zentrifugieren Sie erneut bei 400 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, wie zuvor gezeigt. Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, resuspendieren Sie das Pellet in 350 Mikrolitern PBS 2%FBS.Um die Zellaggregate oder große Partikel aus den einzelnen Zellsuspensionen mit einem 70-Mikrometer-Vorabscheidefilter zu entfernen, aktivieren Sie den Filter mit 100 Mikrolitern PBS 2%FBS. Führen Sie die Zellsuspension durch den Filter und sammeln Sie sie in einem sauberen Röhrchen. Waschen Sie dann den Filter mit 100 Mikrolitern PBS 2%FBS.Um eine magnetische Trennung von Zellen mit der negativen Trennstrategie durchzuführen, platzieren Sie die Probe in Position A des gekühlten Racks und zwei leere Röhrchen in den Positionen B und C, um die nicht markierten und markierten Zellen zu gewinnen. Anschließend Waschpuffer und Laufpuffer in die entsprechenden Flaschen füllen. Wählen Sie im Abschnitt "Trennung" die Anzahl der zu trennenden Proben aus und wählen Sie das Erschöpfungsprotokoll aus.Drücken Sie auf Ausführen und starten Sie die Trennung. Stellen Sie am Ende des Programms die unbeschrifteten Zellen wieder her. Beschichten Sie als Nächstes eine 12-Well-Platte mit einer Basalmembranmatrix, indem Sie 400 Mikroliter 2,5%-Basalmembranmatrix hinzufügen, um die gesamte Oberfläche jedes Wells abzudecken.Entfernen Sie die überschüssige Lösung und lassen Sie die Platte mindestens eine Stunde lang in der Laminar-Flow-Haube trocknen. Nachdem Sie fünf Minuten lang zentrifugiert und den Überstand entsorgt haben, resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Wachstumsmedium. Säen Sie die Adipozyten-Vorläuferzellen (APCs) in eine Vertiefung der 12-Well-Platte, die zuvor mit einer 2,5%igen Basalmembranmatrix beschichtet wurde.Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid und wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen. Nachdem Sie das Medium vollständig entfernt haben, waschen Sie die Zellen mit 350 Mikrolitern PBS 2%FBS. Ernten Sie die Zellen mit 350 Mikrolitern 0,05%Tripsin EDTA für zwei Minuten bei 37 Grad Celsius und fügen Sie zwei Milliliter Wachstumsmedium hinzu.Die Zellen werden in einem neuen konischen 50-Milliliter-Röhrchen gesammelt und fünf Minuten lang bei 400 G zentrifugiert. Die APCs werden zu 12-Well-Platten geleitet, die zuvor mit einer 2,5%igen Basalmembranmatrix beschichtet waren, und bei 37 Grad Celsius mit 5%Kohlendioxid inkubiert. Wechseln Sie das Medium alle 48 Stunden, bis die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht haben.Bei einer Konfluenz von 80 % wird ein beliebiges Wachstumsmedium abgesaugt und durch 500 Mikroliter Differenzierungsmedium ersetzt, das in jeder Vertiefung 3,3 nanomolare knochenmorphogenetisches Protein enthält. Ersetzen Sie nach 48 Stunden das Medium durch 500 Mikroliter pro Well-Differenzierungsmedium und den Differenzierungscocktail. Entfernen Sie das Medium 72 Stunden später und geben Sie 100 Nanomolar Insulin in 500 Mikroliter frisches Differenzierungsmedium.Induzieren Sie 48 Stunden später eine Insulinresistenz mit vier Nanogramm pro Milliliter Tumornekrosefaktor alpha oder TNF alpha. Saugen Sie ein beliebiges Differenzierungsmedium ab und ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter einfaches Medium 2%FBS mit TNF alpha. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden werden vier Nanogramm TNF alpha pro Milliliter in einem einfachen mittleren 0%FBS zugegeben.Aktivieren Sie den Insulin-Signalweg 24 Stunden später durch Zugabe von 100 nanomolaren Insulin und inkubieren Sie ihn 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einer 5%igen Kohlendioxidatmosphäre, wie bereits gezeigt. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und waschen Sie es mit 500 Mikrolitern PBS, einschließlich einer Kontrollmulde ohne Insulinbehandlung. Proteinextraktion und Messung der Phosphorylierung von Insulin-Signalmarkern mittels Western Blot.Subkutane Adipozyten-Vorläuferzellen bei 80%Konfluenz vor der Induktion der Differenzierung in den 12-Well-Kulturplatten und primäre Adipozyten nach sieben Tagen der Induktionsdifferenzierung sind in dieser Abbildung dargestellt. Die durch TNF alpha induzierte Insulinresistenz in subkutanen primären Adipozyten wurde durch eine verminderte Insulin-induzierte Phosphorylierung des Insulinrezeptors, des Insulinrezeptorsubstrats und der Proteinkinase B oder AKT nachgewiesen. Die Membran wurde mit anti-phosphoryliertem Insulinrezeptor, anti-phosphoryliertem Insulinrezeptorsubstrat eins, anti-phosphoryliertem AKT und Anti-Beta-Tubulin als Beladungskontrolle untersucht.Das Signal wurde mittels Chemilumineszenz-Detektion visualisiert. Die repräsentativen Blots und die Quantifizierung aus drei unabhängigen Experimenten sind hier dargestellt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens muss darauf geachtet werden, dass die Induktion einer Insulinresistenz mit TNF alpha mit 2 % FBS für 24 Stunden und mit 0 % FBS für die letzten 24 Stunden erfolgt.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Forschung

Biologie

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolierung und Kultivierung von primären Maus Azinuszellen des Pankreas

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Ein Video-Protokoll von retrovirale Infektion in der Grunddarm Organoide Kultur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

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Glukoseaufnahme Messung und Response auf Insulin Stimulation in<em&gt; In vitro</em&gt; Kultivierte menschliche primäre Myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolierung und Kultur der primären Maus Keratinozyten aus neonatalen und erwachsenen Maus Haut

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Ein Tissue Culture Modell der Östrogen-produzierenden primäre Bovine Granulosa Zellen

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...