Name: differentiated mouse adipocytes in primary culture: a model of insulin resistance
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance at JoVE.com

אנו מודים לדניאל מונדרגון, אנטוניו פראדו, פרננדו לופז-בררה, מרטין גרסיה-סרבין, אלחנדרה קסטילה ומריה אנטונייטה קרבאג'ו על עזרתם הטכנית, ולג'סיקה גונזלס נוריס על העריכה הביקורתית של כתב היד. פרוטוקול זה נתמך על ידי Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (ל- Y.M).

כל ניסויי המכרסמים אושרו על ידי הוועדה לביואתיקה של המכון לנוירוביולוגיה של UNAM, פרוטוקול מספר 075.
1. בידוד של תאים מבשרי אדיפוציט עכבר
<ol><li>הרדימו עכברי C57BL/6 זכרים בני 8-10 שבועות (למשל, על ידי שאיפתCO2 ונקע צוואר הרחם לאחר מכן) (ארבעה בעלי חיים בכל בידוד). לחטא את ה?...

<ol>
	<li>Elmus, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signaling+and+insulin+resistance.">Insulin signaling and insulin resistance.</a> Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).</li><li>Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+stimulates+tyrosine+phosphorylation+of+the+insulin+receptor+in+a+cell-free+system.">Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system.</a> Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).</li><li>Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+stimulates+the+phosphorylation+of+the+95,000-dalton+subunit+of+its+own+receptor.">Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor.</a> Science. 215 (4529), 185-187 (1982).</li><li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Insulin Resistance. StatPearls Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/</a> (2021)</li><li>Petersen, M. C., Shulm, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+insulin+action+and+insulin+resistance.">Mechanisms of insulin action and insulin resistance.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).</li><li>Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+underlying+defect+in+insulin+action+in+type+2+diabetes.">Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).</li><li>Unamuno, X., Fr&#252;hbeck, G., Catal&#225;n, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue.">Adipose Tissue.</a> Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , 370-384 (2019).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pink+adipocytes.">Pink adipocytes.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).</li><li>Kahn, B. B., Flier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+insulin+resistance.">Obesity and insulin resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).</li><li>Klemm, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-induced+adipocyte+differentiation.">Insulin-induced adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).</li><li>Wilcox, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+and+insulin+resistance.">Insulin and insulin resistance.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).</li><li>Yohannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+insulin+resistance,+and+type+2+diabetes:+associations+and+therapeutic+implications.">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).</li><li>James, D. E., St&#246;ckli, J., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+and+molecular+landscape+of+insulin+resistance.">The etiology and molecular landscape of insulin resistance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).</li><li>Wondmkun, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+insulin+resistance,+and+type+2+diabetes:+associations+and+therapeutic+implications.">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).</li><li>Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+causes+the+insulin+resistance+underlying+obesity.">What causes the insulin resistance underlying obesity.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).</li><li>Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-J&#228;rvinen, H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+does+obesity+cause+diabetes.">Why does obesity cause diabetes.</a> Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).</li><li>Lo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+in+vitro+insulin-resistance+models+and+their+physiological+relevance+to+in+vivo+diet-induced+adipose+insulin+resistance.">Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance.</a> Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).</li><li>Asterholm, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+inflammation+is+essential+for+healthy+adipose+tissue+expansion+and+remodeling.">Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling.</a> Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).</li><li>Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+inhibits+signaling+from+the+insulin+receptor.">Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).</li><li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-&#945;+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activates+expression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes.+Nuclear+factor-&#954;B+activation+by+TNF-&#945;+is+obligatory.">Tumor necrosis factor-&#945; suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-&#954;B activation by TNF-&#945; is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li><li>Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+receptor+signaling+in+normal+and+insulin-resistant+states.">Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).</li><li>Hotamisligil, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRS-1-mediated+inhibition+of+insulin+receptor+tyrosine+kinase+activity+in+TNF-alpha-+and+obesity-induced+insulin+resistance.">IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance.</a> Science. 271 (5249), 665-668 (1996).</li><li>Copps, K. D., White, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+insulin+sensitivity+by+serine/threonine+phosphorylation+of+insulin+receptor+substrate+proteins+IRS1+and+IRS2.">Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2.</a> Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).</li><li>Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+western+blots:+pitfalls+of+densitometry.">Quantifying western blots: pitfalls of densitometry.</a> Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).</li><li>Skurk, T., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+human+adipocyte+precursor+cells:+expansion+and+differentiation.">Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).</li><li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots.">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+white+adipocyte+proliferation.">The biology of white adipocyte proliferation.</a> Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).</li><li>Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipogenesis+and+aging:+does+aging+make+fat+go+MAD.">Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD.</a> Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).</li><li>Guo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+results+in+paradoxical+susceptibility+of+fat+cell+progenitors+to+lipotoxicity.">Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).</li><li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F.Tumor+necrosis+factor-a+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activatesexpression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes:+nuclear+factor-kappaB+activation+by+TNF-a+is+obligatory.">F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li><li>Jager, J., Gre &#769;meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1b-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+throughdown-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-6+(IL-6)+induces+insulinresistance+in+3T3-L1+adipocytes+and+is,+like+IL-8+and+tumor+necrosis+factor-a,overexpressed+in+human+fat+cells+from+insulin-resistant+subjects.">Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).</li><li>Isidor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+rewires+the+metabolic+gene+program+and+glucose+utilization+in+human+white+adipocytes.">Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes.</a> International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).</li><li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance.">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li></ol>

מאמר זה מספק שיטה לחקר עמידות לאינסולין המשתמשת באדיפוציטים ראשוניים בתרבית המטופלת ב-TNF-α. למודל זה יש יתרון בכך שניתן לגדל בתרבית אדיפוציטים ראשוניים בתנאים מוגדרים לפרקי זמן ארוכים עם בקרה הדוקה של גורמים סביבתיים תאיים26. משך הבדיקה הוא 15-20 ימים, אם כי שינויים באחוז האדיפו?...

אינסולין הוא הורמון אנבולי המיוצר על ידי תאי β של איון הלבלב והרגולטור העיקרי של מטבוליזם של גלוקוז ושומנים. בין תפקידיו הרבים, אינסולין מווסת את ספיגת הגלוקוז, סינתזת גליקוגן, גלוקונאוגנזה, סינתזת חלבונים, ליפוגנזיסוליפוליזה 1. האות המולקולרי הראשוני לאחר אינטראקציה של אינסולין עם הקולטן שלו (IR) הוא הפעלת הפעילות הפנימית של חלבון טירוזין קינאז של IR2, וכתוצאה מכך אוטופוספורילציה3 שלו והפעלה לאחר מכן של משפחה של חלבונים הידועים בשם מצעי קולטן אינסולין (IRS), אשר נקשר חלבונים מתאמים המוביל להפעלת מפל של קינאזות חלבון4 . אינסולין מפעיל שני מסלולי איתות עיקריים: פוספטידילינוזיטול 3-קינאז (PI3K)-חלבון קינאז B (AKT) וחלבון קינאז המופעל על ידי ראס-מיטוגן (MAPK). הראשון מהווה נקודת הסתעפות או צומת4,5 עיקריים להפעלת גורמים רבים במורד הזרם המעורבים בתפקודים פיזיולוגיים מגוונים, כולל ויסות הומאוסטזיס דלק, ואילו האחרון מווסת את גדילת התאים והתמיינותם 4,6. פעולות אינסולין תלויות בסופו של דבר בסוג התא ובהקשר הפיזיולוגי7.
אחת הרקמות המטבוליות העיקריות המגיבות לאינסולין היא רקמת השומן. רקמת השומן הלבן היא סוג השומן הנפוץ ביותר בבני אדם ובמכרסמים, המופץ בתוך שומן תת עורי (בין העור לשרירים) ושומן ויסצרלי (סביב האיברים בחלל הבטן). בהתחשב בנפח הגדול שלהם, אדיפוציטים או תאי שומן הם סוג התא הנפוץ ביותר ברקמת השומן. תאי שומן אלה יכולים להיות חומים/בז' (תרמוגניים), ורודים (בבלוטת החלב) ולבנים 8,9. אדיפוציטים לבנים שומרים על עתודות האנרגיה העיקריות בגוף בצורה של טריגליצרידים, תהליך תלוי אינסולין. אינסולין מקדם הובלת גלוקוז וליפוגנזיס, בעוד שהוא מעכב ליפוליזה או פירוק שומנים 7,10. זה גם מקל על התמיינות של preadipocytes לתוך אדיפוציטים - תאים בוגרים אוגרים שומן11.
תנגודת לאינסולין מתרחשת כאשר רמת אינסולין נורמלית מייצרת תגובה ביולוגית מוחלשת, וכתוצאה מכך היפראינסולינמיה מפצה12. עמידות לאינסולין היא מצב הקשור לעודף משקל והשמנת יתר5, שבשילוב מוביל לסוכרת מסוג 2 (T2D) ומחלות מטבוליות אחרות13. היפראינסולינמיה מפצה תנגודת לאינסולין ברקמות היקפיות כדי לשמור על רמות גלוקוז תקינותבדם 14. עם זאת, אובדן או תשישות של תאי β בסופו של דבר, יחד עם עמידות מחמירה לאינסולין, מובילים לרמות גלוקוז גבוהות בדם התואמות לסוכרת סוג2 5. לכן, עמידות לאינסולין והיפראינסולינמיה יכולות לתרום להתפתחות מחלות מטבוליות הנגזרות מהשמנת יתר15. יתר על כן, השמנת יתר עלולה לגרום לדלקת מקומית כרונית בדרגה נמוכה המקדמת עמידות לאינסולין ברקמת השומן15,16,17. בנוסף, שינויים שמקורם בהשמנת יתר ברקמת השומן, כגון פיברוזיס, דלקת ואנגיוגנזה מופחתת ואדיפוגנזה, מובילים לרמות נמוכות יותר בסרום האדיפונקטין (רגיש לאינסולין) ולהפרשת גורמים כגון מעכב מפעיל פלסמינוגן 1 (PAI-1), חומצות שומן חופשיות ואקסוזומים לזרם הדם, המחריפים את התנגודת לאינסולין17.
היבטים רבים העומדים בבסיס התנגודת לאינסולין עדיין אינם ידועים. מודלים In vitro ו-in vivo פותחו כדי לחקור את המנגנונים המתווכים עמידות לאינסולין ברקמות מטרה עיקריות, כולל רקמת שומן. היתרון של מודלים במבחנה הוא שלחוקרים יש שליטה רבה יותר על תנאי הסביבה והם יכולים להעריך עמידות לאינסולין בסוגי תאים ספציפיים. בפרט, לתאים מבשרי אדיפוציט (APCs) יש את הפנוטיפ האינדיבידואלי של הרקמה התורמת, אשר עשוי לשקף פיזיולוגיה טוב יותר מאשר קווי תאי אדיפוציט. גורם עיקרי הגורם לתנגודת לאינסולין במבחנה הוא גורם נמק גידולי α (TNF-α). TNF-α הוא ציטוקין מעודד דלקת המופרש על ידי אדיפוציטים ומקרופאגים ברקמת השומן18. בעוד שהוא נדרש לשיפוץ והרחבה תקינים של רקמת השומן19, חשיפה ארוכת טווח ל-TNF-α גורמת לתנגודת לאינסולין ברקמת השומן in vivo ובאדיפוציטים במבחנה20. טיפול כרוני ב-TNF-α במספר סוגי תאים מוביל לזרחן סרין מוגבר הן של IR והן של IRS-1, ובכך מקדם ירידה בזרחון טירוזין21. זרחן מוגבר של IRS-1 על שאריות סרין מעכב את פעילות IR טירוזין קינאז ועשוי להיות אחד המנגנונים העיקריים שבאמצעותם טיפול כרוני ב- TNF-α פוגע בפעולת האינסולין22,23. TNF-α מפעיל מסלולים המערבים מעכב סרין/תראונין קינאז של גורם גרעיני ĸB קינאז β (IKKβ) ו-c-Jun N terminal kinase (JNK)24. JNK משרה תוכנית שעתוק פרו-דלקתית מורכבת אך גם זרחן ישיר IRS-16.
הבנת הפתוגנזה של תנגודת לאינסולין הפכה חשובה יותר ויותר כדי להנחות את הפיתוח של טיפולים עתידיים נגד סוכרת סוג 2. נגמ"שים הוכיחו את עצמם כמודל מצוין לחקר הביולוגיה של תאי השומן, כולל הרגישות והעמידות לאינסולין, ולזיהוי התכונות הפנימיות של אדיפוציטים ללא תלות בסביבה המערכתית. נגמ"שים ניתן להשיג בקלות ממחסני שומן שונים, ובתנאים המתאימים, להתמיין לאדיפוציטים בוגרים. בשיטה זו ניתן להעריך השפעות ישירות על התנגודות/רגישות לאינסולין באדיפוציטים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Isolation mouse adipocyte precursor cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer&#160;</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin Microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0311-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Equitech-Bio, Inc.</td>
			<td>BAC63-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12800017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS mix</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid-albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 201 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-nr-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-18</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peniciline-Streptomycine</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (70 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5020-BP-010</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1756</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>71742</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-005&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0404</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem E system</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td>Running and Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2- mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>907007</td>
			<td>Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3624-05</td>
			<td>TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77F-0379</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH&#160;</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3722-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P2O7</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>114F-0762</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein standard&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho- Insulin Receptor &#946;&#160;</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Akt (Ser473) Antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose&#160;</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>407205</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610302</td>
			<td>Running and laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td>Running, transfer and laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4103-02</td>
			<td>RIPA buffer - TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>TBS-T</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiated mouse adipocytes in primary culture: a model of insulin resistance

תנגודת לאינסולין היא השפעה מופחתת של אינסולין על תאי המטרה שלו, שמקורה בדרך כלל בירידה באיתות קולטני האינסולין. תנגודת לאינסולין תורמת להתפתחות סוכרת מסוג 2 (T2D) ומחלות אחרות הנובעות מהשמנת יתר בשכיחות גבוהה ברחבי העולם. לכן, הבנת המנגנונים העומדים בבסיס התנגודת לאינסולין היא רלוונטית מאוד. מספר מודלים שימשו לחקר עמידות לאינסולין הן in vivo והן in vitro; אדיפוציטים ראשוניים מייצגים אפשרות אטרקטיבית לחקור את מנגנוני התנגודת לאינסולין ולזהות מולקולות המנטרלות מצב זה ואת המטרות המולקולריות של תרופות רגישות לאינסולין. כאן, ביססנו מודל עמידות לאינסולין באמצעות אדיפוציטים ראשוניים בתרבית המטופלים בגורם נמק גידולי α (TNF-α).
תאים מבשרי אדיפוציט (APCs), שבודדו מרקמת שומן תת-עורית של עכבר המעוכל בקולגנאז על ידי טכנולוגיית הפרדת תאים מגנטית, מתמיינים לאדיפוציטים ראשוניים. לאחר מכן נגרמת תנגודת לאינסולין על ידי טיפול ב-TNF-α, ציטוקין מעודד דלקת המפחית את הזרחון/הפעלה של טירוזין של חברי מפל איתות האינסולין. ירידה בזרחון של קולטן אינסולין (IR), מצע קולטן אינסולין (IRS-1) וחלבון קינאז B (AKT) מכומתים על ידי כתם מערבי. שיטה זו מספקת כלי מצוין לחקר המנגנונים המתווכים תנגודת לאינסולין ברקמת השומן.

במהלך השנים האחרונות, השכיחות המוגברת של השמנת יתר וסוכרת סוג 2 הובילה לחיפוש אינטנסיבי אחר המנגנונים המתווכים עמידות לאינסולין ברקמת השומן. בעזרת הפרוטוקול המתואר כאן, ניתן להתמיין בין APCs לאדיפוציטים בוגרים כדי להעריך עמידות ורגישות לאינסולין. ברגע שה-APCs מגיעים למפגש, לוקח להם 10 ימים לה?...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance at JoVE.com

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של קדם-אדיפוציטים של עכברים משומן תת-עורי, התמיינותם לאדיפוציטים בוגרים והשראת תנגודת לאינסולין. פעולת האינסולין מוערכת על ידי זרחון / הפעלה של חברי מסלול איתות האינסולין דרך כתם מערבי. שיטה זו מאפשרת קביעה ישירה של תנגודת/רגישות לאינסולין באדיפוציטים ראשוניים.

אדיפוציטים מובחנים של עכברים בתרבית ראשונית: מודל של תנגודת לאינסולין

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

ניתן להעריך עמידות לאינסולין באדיפוציטים ראשוניים, המאפשרים מחקר של תורמים בהקשרים פיזיולוגיים שונים, כגון רזים לעומת שמנים, או תאים ממאגרי שומן שונים. אדיפוציטים ראשוניים שומרים על רבות מהתכונות המהותיות שלהם וניתן לגדל אותם בתרבית בתנאים מוגדרים למשך תקופת זמן ארוכה, עם בקרה הדוקה של גורמים סביבתיים תאיים. כדי להתחיל את תהליך ההתמיינות, התאים חייבים להיות במפגש של 80%.אם ההתמיינות מתחילה במפגש נמוך או גבוה יותר, התאים יתמינו פחות או יאבדו את יכולת ההתמיינות שלהם. לאחר הקרבת החיה, לחטא את העכברים על ידי שפשוף עם 70% אתנול. נתחו את רקמת השומן התת עורית המפשעתית מכל עכבר ואספו אותה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר, המכיל 15 מיליליטר של תמיסת קולגנאז מסוג אחד על קרח.חותכים את רקמת השומן לחתיכות קטנות עם מספריים כירורגיים סטריליים ומעכלים את הדגימות על ידי דגירה עם תמיסת collagenase מסוג אחד ב 37 מעלות צלזיוס בשייקר מסלול ב 150 סל"ד במשך 30 דקות. בדוק את העיכול כל 10 דקות כדי להבטיח שזה עובד, וכדי למנוע עיכול יתר. מסננים באמצעות מזרק רשת 200 מיקרומטר כדי לחסל את הרקמה שלא מתעכלת עם collagenase, ולהעביר את המסנן על קצה הצינור כדי לנקז תאים רבים ככל האפשר לתוך התמיסה.הוסף 15 מיליליטר של DMEM קר 1% BSA כדי לעצור את העיכול, וצנטריפוגה ב 400 גרם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את השכבה העליונה המכילה אדיפוציטים בוגרים ואת רוב השכבה הנוזלית. הוסף 20 מיליליטר של PBS קר 2% FBS אליו להשעות מחדש את הכדור.לאחר צנטריפוגה שוב במשך חמש דקות, להסיר את supernatant על ידי שאיפה השכבה העליונה כדי לחסל את האדיפוציטים והשומן הנותרים. השהה מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של חיץ ACK שוכב. דוגרים על קרח במשך חמש דקות.הוסף 10 מיליליטר של PBS 2% FBS וערבב אותו. לאחר צנטריפוגה של חמש דקות ושאיפה של הסופרנטנט, השהה מחדש את הגלולה ב -200 מיקרוליטר של תמיסת אנטי FC. דוגרים על קרח במשך חמש דקות ומעבירים את תרחיף התא לצינור של חמישה מיליליטר שנכנס למתלים המצוננים מראש של מפריד תאים מגנטי.לאחר צנטריפוגה של חמש דקות וסילוק הסופרנטנט, הוסיפו לו 200 מיקרוליטר של תערובת ביוטין נוגדן חד שבטי CD 31 וביוטין נוגדן חד שבטי CD 45. מערבבים היטב ודגרים על קרח במשך 15 דקות. לאחר מכן להוסיף 400 מיקרוליטר של PBS 2% FBS וצנטריפוגה שוב ב 400 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.שאפו את הסופרנאטנט ודגרו עליו ב-100 מיקרוליטר של מיקרו-כדוריות אנטי-ביוטין במשך 15 דקות על קרח. הוסף 400 מיקרוליטר של PBS 2% FBS וצנטריפוגה שוב ב 400 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס, כפי שהוצג קודם לכן. לאחר השלכת supernatant, להשעות מחדש את הגלולה ב 350 מיקרוליטר של PBS 2% FBS.כדי להסיר את צברי התא, או חלקיקים גדולים, ממתלי התא הבודד עם מסנן קדם-הפרדה של 70 מיקרומטר, הפעל את המסנן עם 100 מיקרוליטר של PBS 2% FBS. מעבירים את מתלה התא דרך המסנן, ואוספים אותו בצינור נקי. לאחר מכן לשטוף את המסנן עם 100 מיקרוליטר של PBS 2% FBS.כדי לבצע הפרדה מגנטית של תאים באמצעות אסטרטגיית ההפרדה השלילית, מקם את הדגימה במיקום A של המדף המצונן ושתי שפופרות ריקות במיקומים B ו- C כדי לשחזר את התאים שאינם מסומנים ומסומנים. לאחר מכן טען את מאגר הכביסה ואת מאגר ההפעלה לתוך הבקבוקים המתאימים. במקטע ההפרדה, בחר את מספר הדגימות שיש להפריד ובחר בפרוטוקול התרוקנות.לחצו על Run והתחילו את ההפרדה. בסוף התוכנית, לשחזר את התאים ללא תווית. לאחר מכן, צפו צלחת בת 12 בארות במטריצת קרום מרתף על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של מטריצת קרום מרתף של 2.5% כדי לכסות את כל פני השטח של כל באר.הסר את התמיסה העודפת ותן לצלחת להתייבש בתוך מכסה המנוע הזרימה הלמינרית למשך שעה לפחות. לאחר צנטריפוגה במשך חמש דקות והשלכת supernatant, להשעות מחדש את הגלולה ב 500 מיקרוליטר של מדיום צמיחה. זרעו את התאים המקדימים של האדיפוציט, או APCs, בבאר אחת מתוך צלחת 12 בארות שצופתה בעבר במטריצת קרום מרתף של 2.5%.דוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו-חמצני, ומשנים את התווך כל 48 שעות עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%. לאחר הסרת המדיום לחלוטין, לשטוף את התאים עם 350 מיקרוליטר של PBS 2% FBS. קצרו את התאים עם 350 מיקרוליטר של 0.05% EDTA במשך שתי דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום צמיחה.לאסוף את התאים בצינור חרוטי חדש 50 מיליליטר צנטריפוגה ב 400 גרם במשך חמש דקות. מעבירים את הנגמ"שים ללוחות של 12 בארות, שצופו בעבר במטריצת קרום מרתף של 2.5%, ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. שנה את המדיום כל 48 שעות עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%.במפגש של 80%, שאפו מכל מצע גידול והחליפו אותו ב-500 מיקרוליטר של מדיום התמיינות, המכיל 3.3 חלבון מורפוגנטי של עצם ננו-מולרית בכל באר. לאחר 48 שעות, להחליף את המדיום עם 500 מיקרוליטר לכל מדיום בידול באר, ואת קוקטייל בידול. הסר את המדיום 72 שעות מאוחר יותר והוסף 100 ננומולר של אינסולין ב 500 מיקרוליטר של מדיום התמיינות טרי.48 שעות לאחר מכן, גרמו לתנגודת לאינסולין עם ארבעה ננוגרם למיליליטר של גורם נמק הגידול אלפא, או TNF אלפא. שאפו מכל מדיום בידול והחליפו אותו ב-500 מיקרוליטר של 2% FBS בינוני פשוט באלפא TNF. לאחר הדגירה במשך 24 שעות, יש להוסיף ארבעה ננוגרם למיליליטר של TNF אלפא ב-FBS בינוני פשוט של 0%.הפעילו את מסלול איתות האינסולין 24 שעות מאוחר יותר על ידי הוספת 100 ננו-מולארי אינסולין ודגרו במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני, כפי שהוצג קודם לכן. לאחר הדגירה, להסיר את המדיום ולשטוף עם 500 מיקרוליטר של PBS, כוללים היטב שליטה ללא טיפול באינסולין. לחלץ חלבון ולמדוד את הזרחן של סמני איתות אינסולין על ידי כתם מערבי.תאים מקדימים של אדיפוציטים תת-עוריים במפגש של 80% לפני השראת התמיינות בלוחות תרבית 12 בארות, ואדיפוציטים ראשוניים לאחר שבעה ימים של השראת התמיינות מוצגים באיור זה. התנגודת לאינסולין המושרה על ידי TNF אלפא באדיפוציטים ראשוניים תת-עוריים הודגמה על ידי ירידה בזרחון המושרה על ידי אינסולין של קולטן אינסולין, מצע קולטן אינסולין אחד, וחלבון קינאז B או AKT. הממברנה נבדקה עם קולטן אינסולין אנטי זרחני, מצע קולטן אינסולין אנטי זרחני אחד, AKT אנטי זרחני, ואנטי בטא טובולין שימש כבקרת העמסה.האות הודגם באמצעות זיהוי כימילומינסנציה. הכתמים המייצגים והכימות משלושה ניסויים עצמאיים מוצגים כאן. כאשר מנסים הליך זה, דבר אחד שצריך לטפל בו הוא שהשראת עמידות לאינסולין עם TNF אלפא היא עם 2% FBS למשך 24 שעות ועם 0% FBS במשך 24 השעות האחרונות.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

תרבות ראשיים electroporation פלסמיד של האיבר Murine של קורטי.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

פרוטוקול וידאו של זיהום retroviral ביסודי מעיים Organoid תרבות

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

גלוקוז ספיגה מדידה ותגובה גירוי אינסולין ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מיוטובים ראשוניים אדם מתורבת

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

מודל תרביות רקמה של ייצור אסטרוגן Granulosa שור ראשי תאים

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...