Name: differentiated mouse adipocytes in primary culture: a model of insulin resistance
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00
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Ringraziamo Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla e María Antonieta Carbajo per la loro assistenza tecnica, e Jessica Gonzalez Norris per aver curato criticamente il manoscritto. Questo protocollo è stato sostenuto dal Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (to Y.M.).

Tutti gli esperimenti sui roditori sono stati approvati dal Comitato di Bioetica dell'Istituto di Neurobiologia dell'UNAM, numero di protocollo 075.
1. Isolamento delle cellule precursori degli adipociti di topo
<ol><li>Eutanasia di topi maschi C57BL/6 di 8-10 settimane (ad esempio, per inalazione di CO2 e successiva lussazione cervicale) (quattro animali per isolamento). Disinfettare i topi strofinando con etanolo al 70% e ottenere il tessuto adiposo subito dopo ...

<ol>
	<li>Elmus, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signaling+and+insulin+resistance.">Insulin signaling and insulin resistance.</a> Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).</li><li>Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+stimulates+tyrosine+phosphorylation+of+the+insulin+receptor+in+a+cell-free+system.">Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system.</a> Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).</li><li>Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+rewires+the+metabolic+gene+program+and+glucose+utilization+in+human+white+adipocytes.">Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes.</a> International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).</li><li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance.">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li></ol>

Questo articolo fornisce un metodo per studiare la resistenza all'insulina che utilizza adipociti primari in coltura trattata con TNF-α. Questo modello ha il vantaggio che gli adipociti primari possono essere coltivati in condizioni definite per lunghi periodi di tempo con uno stretto controllo dei fattori ambientali cellulari26. La durata del test è di 15-20 giorni, anche se possono verificarsi variazioni nella percentuale di adipociti differenziati tra gli esperimenti. Gli adipociti primari ha...

L'insulina è un ormone anabolizzante prodotto dalle cellule β delle isole pancreatiche e il regolatore chiave del metabolismo del glucosio e dei lipidi. Tra le sue numerose funzioni, l'insulina regola l'assorbimento del glucosio, la sintesi del glicogeno, la gluconeogenesi, la sintesi proteica, la lipogenesi e la lipolisi1. Il segnale molecolare iniziale dopo l'interazione dell'insulina con il suo recettore (IR) è l'attivazione dell'attività intrinseca della proteina chinasi tirosina di IR2, con conseguente autofosforilazione3 e successiva attivazione di una famiglia di proteine note come substrati del recettore dell'insulina (IRS), che si lega alle proteine adattatrici portando all'attivazione di una cascata di protein chinasi4 . L'insulina attiva due principali vie di segnalazione: fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K)-proteina chinasi B (AKT) e Ras-mitogen-activated protein chinasi (MAPK). Il primo costituisce un importante punto di diramazione o nodo 4,5 per l'attivazione di numerosi effettori a valle coinvolti in diverse funzioni fisiologiche, tra cui la regolazione dell'omeostasi del combustibile, mentre il secondo regola la crescita e la differenziazione cellulare 4,6. Le azioni dell'insulina dipendono in ultima analisi dal tipo di cellula e dal contesto fisiologico7.
Uno dei principali tessuti metabolici insulino-sensibili è il tessuto adiposo. Il tessuto adiposo bianco è il tipo di grasso più abbondante nell'uomo e nei roditori, distribuito all'interno del grasso sottocutaneo (tra la pelle e i muscoli) e del grasso viscerale (intorno agli organi nella cavità addominale). Dato il loro grande volume, gli adipociti o le cellule adipose sono il tipo di cellula più abbondante nel tessuto adiposo. Queste cellule adipose possono essere marroni / beige (termogeniche), rosa (nella ghiandola mammaria) e bianco 8,9. Gli adipociti bianchi mantengono le principali riserve energetiche nel corpo sotto forma di trigliceridi, un processo insulino-dipendente. L'insulina favorisce il trasporto del glucosio e la lipogenesi, mentre inibisce la lipolisi o la degradazione dei lipidi 7,10. Facilita anche la differenziazione dei preadipociti in adipociti - le cellule mature che immagazzinano il grasso11.
La resistenza all'insulina si verifica quando un livello normale di insulina produce una risposta biologica attenuata, con conseguente iperinsulinemia compensatoria12. La resistenza all'insulina è una condizione associata a sovrappeso e obesità5, che quando combinata porta al diabete di tipo 2 (T2D) e ad altre malattie metaboliche13. L'iperinsulinemia compensa la resistenza all'insulina nei tessuti periferici per mantenere normali livelli di glucosio nel sangue14. Tuttavia, l'eventuale perdita o esaurimento delle cellule β, insieme all'esacerbata resistenza all'insulina, porta a livelli elevati di glucosio nel sangue coerenti con T2D5. Pertanto, l'insulino-resistenza e l'iperinsulinemia possono contribuire allo sviluppo di malattie metaboliche derivate dall'obesità15. Inoltre, l'obesità può causare infiammazione locale cronica di basso grado promuovendo la resistenza all'insulina nel tessuto adiposo15,16,17. Inoltre, le alterazioni derivate dall'obesità nel tessuto adiposo, come la fibrosi, l'infiammazione e la riduzione dell'angiogenesi e dell'adipogenesi, portano a livelli sierici di adiponectina più bassi (un sensibilizzante dell'insulina) e ad un aumento della secrezione di fattori come l'inibitore dell'attivatore del plasminogeno 1 (PAI-1), acidi grassi liberi ed esosomi nel flusso sanguigno, esacerbando la resistenza all'insulina17.
Molti aspetti alla base della resistenza all'insulina rimangono sconosciuti. Sono stati sviluppati modelli in vitro e in vivo per studiare i meccanismi che mediano la resistenza all'insulina nei principali tessuti bersaglio, incluso il tessuto adiposo. Il vantaggio dei modelli in vitro è che i ricercatori hanno un maggiore controllo delle condizioni ambientali e possono valutare la resistenza all'insulina in specifici tipi di cellule. In particolare, le cellule precursori degli adipociti (APC) hanno il fenotipo individuale del tessuto donatore, che potrebbe riflettere meglio la fisiologia rispetto alle linee cellulari adipocitarie. Uno dei principali fattori che inducono insulino-resistenza in vitro è il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α). Il TNF-α è una citochina proinfiammatoria secreta dagli adipociti e dai macrofagi nel tessuto adiposo18. Mentre è necessario per il corretto rimodellamento ed espansione del tessuto adiposo19, l'esposizione a lungo termine al TNF-α induce insulino-resistenza nel tessuto adiposo in vivo e negli adipociti in vitro20. Il trattamento cronico con TNF-α di diversi tipi cellulari porta ad un aumento della fosforilazione della serina sia di IR che di IRS-1, promuovendo così una diminuzione della fosforilazione della tirosina21. L'aumento della fosforilazione di IRS-1 sui residui di serina inibisce l'attività della tirosin-chinasi IR e può essere uno dei meccanismi chiave attraverso i quali il trattamento cronico con TNF-α altera l'azione dell'insulina22,23. Il TNF-α attiva vie che coinvolgono l'inibitore della serina/treonina chinasi del fattore nucleare ĸB chinasi β (IKKβ) e della chinasi terminale c-Jun N (JNK)24. JNK induce un complesso programma trascrizionale proinfiammatorio ma fosforila direttamente IRS-16.
Comprendere la patogenesi dell'insulino-resistenza è diventato sempre più importante per guidare lo sviluppo di future terapie contro il T2D. Le APC hanno dimostrato di essere un modello eccellente per lo studio della biologia delle cellule adipose, compresa la sensibilità e la resistenza all'insulina, e per identificare le proprietà intrinseche degli adipociti indipendenti dall'ambiente sistemico. Le APC possono essere facilmente ottenute da diversi depositi adiposi e, nelle condizioni appropriate, differenziate in adipociti maturi. Con questo metodo, gli effetti diretti sulla resistenza/sensibilità all'insulina possono essere valutati negli adipociti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Isolation mouse adipocyte precursor cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer&#160;</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin Microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0311-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Equitech-Bio, Inc.</td>
			<td>BAC63-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12800017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS mix</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid-albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 201 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-nr-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-18</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peniciline-Streptomycine</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (70 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5020-BP-010</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1756</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>71742</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-005&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0404</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem E system</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td>Running and Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2- mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>907007</td>
			<td>Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3624-05</td>
			<td>TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77F-0379</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH&#160;</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3722-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P2O7</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>114F-0762</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein standard&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho- Insulin Receptor &#946;&#160;</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Akt (Ser473) Antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose&#160;</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>407205</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610302</td>
			<td>Running and laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td>Running, transfer and laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4103-02</td>
			<td>RIPA buffer - TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>TBS-T</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiated mouse adipocytes in primary culture: a model of insulin resistance

La resistenza all'insulina è un effetto ridotto dell'insulina sulle sue cellule bersaglio, di solito derivato dalla diminuzione della segnalazione del recettore dell'insulina. La resistenza all'insulina contribuisce allo sviluppo del diabete di tipo 2 (T2D) e di altre malattie derivate dall'obesità ad alta prevalenza in tutto il mondo. Pertanto, comprendere i meccanismi alla base della resistenza all'insulina è di grande rilevanza. Diversi modelli sono stati utilizzati per studiare la resistenza all'insulina sia in vivo che in vitro; Gli adipociti primari rappresentano un'opzione interessante per studiare i meccanismi di insulino-resistenza e identificare le molecole che contrastano questa condizione e i bersagli molecolari dei farmaci insulino-sensibilizzanti. Qui, abbiamo stabilito un modello di insulino-resistenza utilizzando adipociti primari in coltura trattata con fattore di necrosi tumorale α (TNF-α).
Le cellule precursori degli adipociti (APC), isolate dal tessuto adiposo sottocutaneo sottocutaneo di topo digerito con collagenasi mediante tecnologia di separazione cellulare magnetica, sono differenziate in adipociti primari. La resistenza all'insulina viene quindi indotta dal trattamento con TNF-α, una citochina proinfiammatoria che riduce la fosforilazione/attivazione della tirosina dei membri della cascata di segnalazione dell'insulina. La diminuzione della fosforilazione del recettore dell'insulina (IR), del substrato del recettore dell'insulina (IRS-1) e della proteina chinasi B (AKT) è quantificata dal western blot. Questo metodo fornisce un ottimo strumento per studiare i meccanismi che mediano l'insulino-resistenza nel tessuto adiposo.

Negli ultimi anni, l'aumento della prevalenza di obesità e T2D ha stimolato un'intensa ricerca dei meccanismi che mediano l'insulino-resistenza nel tessuto adiposo. Con il protocollo qui descritto, le APC possono essere differenziate in adipociti maturi per valutare la resistenza e la sensibilità all'insulina. Una volta che le APC raggiungono la confluenza, ci vogliono 10 giorni per completare la loro differenziazione in adipociti maturi e la loro induzione di insulino-resistenza mediata da TNF-α (<strong class="xfig"...

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Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

Questo protocollo descrive l'isolamento dei preadipociti di topo dal grasso sottocutaneo, la loro differenziazione in adipociti maturi e l'induzione della resistenza all'insulina. L'azione dell'insulina viene valutata mediante fosforilazione/attivazione dei membri della via di segnalazione dell'insulina attraverso il western blot. Questo metodo consente la determinazione diretta della resistenza/sensibilità all'insulina negli adipociti primari.

Adipociti di topo differenziati in coltura primaria: un modello di insulino-resistenza

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

La resistenza all'insulina può essere valutata negli adipociti primari, consentendo lo studio di donatori in diversi contesti fisiopatologici, come magri contro obesi, o cellule provenienti da diversi depositi di grasso. Gli adipociti primari conservano molte delle loro proprietà intrinseche e possono essere coltivati in condizioni definite per un lungo periodo di tempo, con uno stretto controllo dei fattori ambientali cellulari. Per avviare il processo di differenziazione, le cellule devono essere all'80% di confluenza.Se la differenziazione inizia a una confluenza inferiore o superiore, le cellule si differenziano meno o perdono la loro capacità di differenziazione. Dopo aver sacrificato l'animale, disinfettare i topi strofinando con etanolo al 70%. Sezionare il tessuto adiposo sottocutaneo inguinale da ciascun topo e raccoglierlo in un tubo conico da 15 millilitri, contenente 15 millilitri di soluzione di collagenasi di tipo uno su ghiaccio.Tagliare il tessuto adiposo in piccoli pezzi con forbici chirurgiche sterili e digerire i campioni mediante incubazione con soluzione di collagenasi di tipo uno a 37 gradi Celsius in uno shaker orbitale a 150 RPM per 30 minuti. Controlla la digestione ogni 10 minuti per assicurarti che funzioni e per prevenire la digestione eccessiva. Filtrare utilizzando una siringa a maglia da 200 micrometri per eliminare il tessuto non digerito con collagenasi e passare il filtro oltre il bordo del tubo per drenare il maggior numero possibile di cellule nella soluzione.Aggiungere 15 millilitri di DMEM 1% BSA freddo per fermare la digestione e centrifugare a 400 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare lo strato superiore contenente adipociti maturi e la maggior parte dello strato liquido. Aggiungere 20 millilitri di PBS freddo 2% FBS e risospendere il pellet.Dopo aver centrifugato nuovamente per cinque minuti, rimuovere il surnatante aspirando lo strato superiore per eliminare gli adipociti e il grasso rimanenti. Risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lisa ACK. Incubare sul ghiaccio per cinque minuti.Aggiungere 10 millilitri di PBS 2% FBS e mescolare. Dopo aver centrifugato per cinque minuti e aspirato il surnatante, risospendere il pellet in 200 microlitri di soluzione anti-FC. Incubare su ghiaccio per cinque minuti e trasferire la sospensione cellulare su un tubo da cinque millilitri che si inserisce nei rack pre-refrigerati di un separatore di celle magnetico.Dopo aver centrifugato per cinque minuti ed eliminato il surnatante, aggiungere 200 microlitri della miscela di biotina anticorpo monoclonale CD 31 e biotina anticorpo monoclonale CD 45. Mescolare bene e incubare sul ghiaccio per 15 minuti. Quindi aggiungere 400 microlitri di PBS 2% FBS e centrifugare nuovamente a 400 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Aspirare il surnatante e incubarlo in 100 microlitri di microsfere anti-biotina per 15 minuti su ghiaccio. Aggiungere 400 microlitri di PBS 2% FBS e centrifugare nuovamente a 400 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius, come mostrato in precedenza. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in 350 microlitri di PBS 2% FBS.Per rimuovere gli aggregati cellulari, o particelle di grandi dimensioni, dalle sospensioni a cella singola con un filtro di pre-separazione a 70 micrometri, attivare il filtro con 100 microlitri di PBS 2% FBS. Passare la sospensione cellulare attraverso il filtro e raccoglierla in un tubo pulito. Quindi lavare il filtro con 100 microlitri di PBS 2% FBS.Per eseguire la separazione magnetica delle celle utilizzando la strategia di separazione negativa, posizionare il campione nella posizione A del rack refrigerato e due tubi vuoti nelle posizioni B e C per recuperare le celle non marcate ed etichettate. Quindi caricare il tampone di lavaggio e il buffer di esecuzione nelle bottiglie corrispondenti. Nella sezione di separazione, selezionare il numero di campioni da separare e selezionare il protocollo di esaurimento.Premere Esegui e avviare la separazione. Alla fine del programma, recuperare le celle non etichettate. Successivamente, rivestire una piastra a 12 pozzetti con matrice di membrana basale aggiungendo 400 microlitri di matrice di membrana seminterrato al 2,5% per coprire l'intera superficie di ciascun pozzetto.Rimuovere la soluzione in eccesso e lasciare asciugare la piastra all'interno della cappa a flusso laminare per almeno un'ora. Dopo aver centrifugato per cinque minuti e scartato il surnatante, risospendere il pellet in 500 microlitri di terreno di coltura. Seminare le cellule precursori degli adipociti, o APC, in un pozzetto della piastra a 12 pozzetti precedentemente rivestita con una matrice di membrana basale del 2,5%.Incubare a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5% e cambiare il mezzo ogni 48 ore fino a quando le celle raggiungono l'80% di confluenza. Dopo aver rimosso completamente il mezzo, lavare le celle con 350 microlitri di PBS 2% FBS. Raccogliere le cellule con 350 microlitri di 0,05% tripsina EDTA per due minuti a 37 gradi Celsius e aggiungere due millilitri di terreno di crescita.Raccogliere le cellule in un nuovo tubo conico da 50 millilitri e centrifugare a 400 G per cinque minuti. Far passare gli APC su piastre a 12 pozzetti, precedentemente rivestiti con una matrice a membrana basale del 2,5%, e incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5%. Cambiare il mezzo ogni 48 ore fino a quando le celle raggiungono l'80% di confluenza.All'80% di confluenza, aspirare qualsiasi mezzo di crescita e sostituirlo con 500 microlitri di mezzo di differenziazione, contenente 3,3 proteine morfogenetiche ossee nanomolari in ciascun pozzetto. Dopo 48 ore, sostituire il mezzo con 500 microlitri per mezzo di differenziazione del pozzetto e il cocktail di differenziazione. Rimuovere il terreno 72 ore dopo e aggiungere 100 nanomolari di insulina in 500 microlitri di terreno di differenziazione fresco.48 ore dopo, indurre insulino-resistenza con quattro nanogrammi per millilitro di fattore di necrosi tumorale alfa, o TNF alfa. Aspirare qualsiasi mezzo di differenziazione e sostituirlo con 500 microlitri di mezzo semplice 2% FBS con TNF alfa. Dopo l'incubazione per 24 ore, aggiungere quattro nanogrammi per millilitro di TNF alfa in un mezzo semplice 0% FBS.Attivare la via di segnalazione dell'insulina 24 ore dopo aggiungendo 100 insulina nanomolare e incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius in un'atmosfera di anidride carbonica al 5%, come mostrato in precedenza. Dopo l'incubazione, rimuovere il mezzo e lavare con 500 microlitri di PBS, includere un pozzo di controllo senza il trattamento insulinico. Estrarre proteine e misurare la fosforilazione dei marcatori di segnalazione dell'insulina mediante Western blot.In questa figura sono mostrate le cellule precursori degli adipociti sottocutanei all'80% prima di indurre la differenziazione nelle piastre di coltura a 12 pozzetti e gli adipociti primari dopo sette giorni dall'induzione della differenziazione. La resistenza all'insulina indotta dal TNF alfa negli adipociti primari sottocutanei è stata dimostrata da una diminuzione della fosforilazione indotta dall'insulina del recettore dell'insulina, del substrato del recettore dell'insulina e della proteina chinasi B o AKT. La membrana è stata sondata con recettore dell'insulina anti-fosforilato, substrato del recettore dell'insulina anti-fosforilato uno, AKT anti-fosforilato e tubulina anti-beta è stata utilizzata come controllo del carico.Il segnale è stato visualizzato con rilevamento a chemiluminescenza. Le macchie rappresentative e la quantificazione di tre esperimenti indipendenti sono mostrate qui. Quando si tenta questa procedura, una cosa che deve essere curata è che l'induzione della resistenza all'insulina con TNF alfa è con 2% FBS per 24 ore e con 0% FBS per le ultime 24 ore.

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