Name: differentiated mouse adipocytes in primary culture: a model of insulin resistance
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00
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ダニエル・モンドラゴン、アントニオ・プラド、フェルナンド・ロペス・バレラ、マルティン・ガルシア・セルビン、アレハンドラ・カスティーリャ、マリア・アントニエタ・カルバホの技術支援、そして原稿を批判的に編集してくれたジェシカ・ゴンザレス・ノリスに感謝します。このプロトコルは、メキシコ国立技術協会(CONACYT)、教育助成金284771(Y.M.)によってサポートされました。

すべてのげっ歯類の実験は、UNAMの神経生物学研究所の生命倫理委員会、プロトコル番号075によって承認されました。
1. マウス脂肪細胞前駆細胞の単離
<ol><li>8〜10週齢の雄C57BL / 6マウスを安楽死させる(例えば、CO2吸入およびその後の頸部脱臼による)(単離あたり4匹)。.70%エタノールでこすってマウスを消毒し、屠殺直後に脂肪組織を得る。 注:げ?...

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	<li>Elmus, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signaling+and+insulin+resistance.">Insulin signaling and insulin resistance.</a> Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).</li><li>Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+stimulates+tyrosine+phosphorylation+of+the+insulin+receptor+in+a+cell-free+system.">Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system.</a> Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).</li><li>Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+inflammation+is+essential+for+healthy+adipose+tissue+expansion+and+remodeling.">Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling.</a> Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).</li><li>Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+inhibits+signaling+from+the+insulin+receptor.">Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).</li><li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+white+adipocyte+proliferation.">The biology of white adipocyte proliferation.</a> Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).</li><li>Kirkland, I. 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R., Van Parijs, L., Lodish, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F.Tumor+necrosis+factor-a+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activatesexpression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes:+nuclear+factor-kappaB+activation+by+TNF-a+is+obligatory.">F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li><li>Jager, J., Gre &#769;meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1b-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+throughdown-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-6+(IL-6)+induces+insulinresistance+in+3T3-L1+adipocytes+and+is,+like+IL-8+and+tumor+necrosis+factor-a,overexpressed+in+human+fat+cells+from+insulin-resistant+subjects.">Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).</li><li>Isidor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+rewires+the+metabolic+gene+program+and+glucose+utilization+in+human+white+adipocytes.">Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes.</a> International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).</li><li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance.">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li></ol>

この論文は、TNF-αで処理した培養で初代脂肪細胞を使用するインスリン抵抗性を研究するための方法を提供します。このモデルには、初代脂肪細胞を、細胞環境因子を厳密に制御しながら、定義された条件下で長期間培養できるという利点があります26。アッセイ期間は15〜20日であるが、分化した脂肪細胞の割合の変動は実験間で起こり得る。初代脂肪細胞は、培養中に継?...

インスリンは、膵島β細胞によって産生される同化ホルモンであり、グルコースおよび脂質代謝の重要な調節因子です。その多くの機能の中で、インスリンはグルコース取り込み、グリコーゲン合成、糖新生、タンパク質合成、脂質生成、および脂肪分解を調節します1。インスリンとその受容体(IR)との相互作用後の初期分子シグナルは、IR2の固有のチロシンタンパク質キナーゼ活性の活性化であり、その結果、その自己リン酸化3と、その後のインスリン受容体基質(IRS)として知られるタンパク質ファミリーの活性化が起こり、アダプタータンパク質に結合してプロテインキナーゼのカスケードの活性化につながります4.インスリンは、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ(PI3K)-プロテインキナーゼB(AKT)とRas-マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)の2つの主要なシグナル伝達経路を活性化します。前者は、燃料恒常性の調節を含む多様な生理学的機能に関与する多数の下流エフェクターの活性化のための主要な分岐点またはノード4,5を構成し、後者は細胞の成長と分化を調節します4,6。インスリン作用は、最終的に細胞型および生理学的状況に依存する7。
主なインスリン応答性代謝組織の1つは脂肪組織です。白色脂肪組織は、ヒトおよびげっ歯類において最も豊富なタイプの脂肪であり、皮下脂肪(皮膚と筋肉の間)および内臓脂肪(腹腔内の臓器の周囲)に分布する。それらの大量を考えると、脂肪細胞または脂肪細胞は脂肪組織において最も豊富な細胞型である。これらの脂肪細胞は、茶色/ベージュ(熱発生性)、ピンク(乳腺内)、および白8,9です。白色脂肪細胞は、インスリン依存性プロセスであるトリグリセリドの形で体内の主要なエネルギー貯蔵を維持します。インスリンはグルコース輸送と脂質生成を促進しますが、脂肪分解または脂質分解を阻害します7,10。また、脂肪前駆細胞の脂肪細胞(成熟脂肪貯蔵細胞)への分化を促進します11。
インスリン抵抗性は、正常なインスリンレベルが弱毒化された生物学的応答を引き起こし、代償性高インスリン血症をもたらすときに発生します12。インスリン抵抗性は、過体重および肥満5に関連する状態であり、組み合わせると2型糖尿病(T2D)および他の代謝性疾患13につながる。高インスリン血症は、末梢組織のインスリン抵抗性を補い、正常な血糖値を維持します14。しかし、最終的なβ細胞の喪失または枯渇は、インスリン抵抗性の悪化とともに、T2D5と一致する血糖値の上昇につながります。したがって、インスリン抵抗性および高インスリン血症は、肥満由来の代謝性疾患の発症に寄与し得る15。さらに、肥満は、脂肪組織におけるインスリン抵抗性を促進する慢性的な低悪性度の局所炎症を引き起こし得る15、16、17。さらに、線維症、炎症、血管新生および脂肪生成の減少などの脂肪組織の肥満由来の変化は、アディポネクチン血清レベルの低下(インスリン抵抗性改善剤)およびプラスミノーゲンアクチベーター阻害剤1(PAI-1)、遊離脂肪酸、および血流へのエキソソームなどの因子の分泌の増加をもたらし、インスリン抵抗性を悪化させる17。
インスリン抵抗性の根底にある多くの側面は不明のままです。脂肪組織を含む主要な標的組織におけるインスリン抵抗性を媒介するメカニズムを研究するために、インビトロおよびインビボモデルが開発されました。in vitroモデルの利点は、研究者が環境条件をより細かく制御でき、特定の細胞タイプのインスリン抵抗性を評価できることです。特に、脂肪細胞前駆細胞(APC)は、ドナー組織の個々の表現型を有し、脂肪細胞株よりも生理機能をよりよく反映している可能性がある。インビトロでインスリン抵抗性を誘導する主な因子は、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)である。TNF−αは、脂肪組織18において脂肪細胞およびマクロファージによって分泌される炎症誘発性サイトカインである。適切な脂肪組織のリモデリングと拡張に必要ですが19、TNF-αへの長期曝露は、in vivoの脂肪組織およびin vitroの脂肪細胞にインスリン抵抗性を誘導します20。いくつかの細胞型の慢性TNF-α治療は、IRおよびIRS-1の両方のセリンリン酸化の増加をもたらし、それによってチロシンリン酸化の減少を促進する21。セリン残基に対するIRS-1のリン酸化の増加は、IRチロシンキナーゼ活性を阻害し、慢性TNF-α治療がインスリン作用を損なう重要なメカニズムの1つである可能性があります22,23。TNF-αは、核内因子ĸBキナーゼβ(IKKβ)およびc-Jun N末端キナーゼ(JNK)のセリン/スレオニンキナーゼ阻害剤を含む経路を活性化します24。JNKは複雑な炎症誘発性転写プログラムを誘導しますが、IRS-16を直接リン酸化します。
インスリン抵抗性の病因を理解することは、T2Dに対する将来の治療法の開発を導くためにますます重要になっています。APCは、インスリンに対する感受性と耐性を含む脂肪細胞生物学の研究、および全身環境とは無関係に脂肪細胞の固有の特性を特定するための優れたモデルであることが証明されています。APCは、異なる脂肪デポから容易に得ることができ、適切な条件下で、成熟脂肪細胞に分化することができる。この方法では、脂肪細胞におけるインスリン抵抗性/感受性への直接的な影響を評価することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Isolation mouse adipocyte precursor cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer&#160;</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin Microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0311-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Equitech-Bio, Inc.</td>
			<td>BAC63-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12800017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS mix</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid-albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 201 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-nr-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-18</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peniciline-Streptomycine</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (70 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5020-BP-010</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1756</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>71742</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-005&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0404</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem E system</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td>Running and Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2- mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>907007</td>
			<td>Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3624-05</td>
			<td>TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77F-0379</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH&#160;</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3722-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P2O7</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>114F-0762</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein standard&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho- Insulin Receptor &#946;&#160;</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Akt (Ser473) Antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose&#160;</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>407205</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610302</td>
			<td>Running and laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td>Running, transfer and laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4103-02</td>
			<td>RIPA buffer - TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>TBS-T</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiated mouse adipocytes in primary culture: a model of insulin resistance

インスリン抵抗性は、その標的細胞に対するインスリンの減少した効果であり、通常、インスリン受容体シグナル伝達の減少に由来する。インスリン抵抗性は、2型糖尿病(T2D)および世界中で有病率の高い他の肥満由来の疾患の発症に寄与しています。したがって、インスリン抵抗性の根底にあるメカニズムを理解することは非常に重要です。いくつかのモデルは、 インビボ と インビトロの両方でインスリン抵抗性を研究するために使用されています。初代脂肪細胞は、インスリン抵抗性のメカニズムを研究し、この状態とインスリン感作薬の分子標的に対抗する分子を特定するための魅力的な選択肢です。ここでは、腫瘍壊死因子α(TNF-α)で処理した培養中の初代脂肪細胞を用いたインスリン抵抗性モデルを確立しました。
磁気細胞分離技術によってコラゲナーゼ消化されたマウス皮下脂肪組織から分離された脂肪細胞前駆細胞(APC)は、初代脂肪細胞に分化します。インスリン抵抗性は、インスリンシグナル伝達カスケードのメンバーのチロシンリン酸化/活性化を低下させる炎症誘発性サイトカインであるTNF-αによる治療によって誘導されます。インスリン受容体(IR)、インスリン受容体基質(IRS-1)、およびプロテインキナーゼB(AKT)のリン酸化の減少は、ウェスタンブロットによって定量されます。この方法は、脂肪組織におけるインスリン抵抗性を媒介するメカニズムを研究するための優れたツールを提供します。

過去数年間で、肥満とT2Dの有病率の増加により、脂肪組織のインスリン抵抗性を媒介するメカニズムの集中的な検索が促されました。ここで説明するプロトコルを使用すると、APCを成熟脂肪細胞に分化させて、インスリン抵抗性と感受性を評価できます。APCがコンフルエントに達すると、成熟脂肪細胞への分化とTNF αを介したインスリン抵抗性の誘導が完了するまでに10日かかります(<strong cl...

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Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

このプロトコルは、皮下脂肪からのマウス前駆脂肪細胞の単離、成熟脂肪細胞への分化、およびインスリン抵抗性の誘導について説明しています。インスリン作用は、ウェスタンブロットを介したインスリンシグナル伝達経路のメンバーのリン酸化/活性化によって評価されます。この方法は、初代脂肪細胞におけるインスリン抵抗性/感受性の直接決定を可能にする。

初代培養における分化マウス脂肪細胞:インスリン抵抗性のモデル

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

インスリン抵抗性は初代脂肪細胞で評価することができ、痩せた肥満と肥満、または異なる脂肪デポからの細胞など、さまざまな生理病理学的状況下でのドナーの研究を可能にします。初代脂肪細胞は、その固有の特性の多くを保持しており、細胞の環境要因を厳密に制御しながら、定義された条件下で長期間培養することができます。分化プロセスを開始するには、細胞が80%コンフルエントである必要があります。分化がより低いまたはより高いコンフルエントで始まる場合、細胞はより少なく分化するか、またはそれらの分化能力を失うであろう。動物を犠牲にした後、70%エタノールでこすることによってマウスを消毒する。各マウスから鼠径皮下脂肪組織を解剖し、氷上に15ミリリットルのタイプ1コラゲナーゼ溶液を含む15ミリリットルの円錐管に集める。脂肪組織を滅菌手術用ハサミで細かく切断し、150 RPMのオービタルシェーカーで摂氏37度でタイプ1コラゲナーゼ溶液と30分間インキュベートしてサンプルを消化します。10分ごとに消化をチェックして、それが機能することを確認し、過剰消化を防ぎます。200マイクロメートルのメッシュシリンジを使用して、コラゲナーゼで消化されていない組織を除去し、フィルターをチューブの端に通して、できるだけ多くの細胞を溶液に排出します。15ミリリットルの冷たいDMEM 1%BSAを加えて消化を停止し、摂氏4度で10分間400 gで遠心分離します。成熟脂肪細胞を含む最上層とほとんどの液層を吸引します。それに20ミリリットルの冷たいPBS 2%FBSを加え、ペレットを再懸濁します。再度5分間遠心分離した後、上層を吸引して上清を除去し、残存する脂肪細胞や脂肪を除去した。ペレットを1ミリリットルのACK溶解バッファーに再懸濁します。氷上で5分間インキュベートします。10ミリリットルのPBS 2%FBSを加えて混ぜます。5分間遠心分離して上清を吸引した後、ペレットを200マイクロリットルの抗FC溶液に再懸濁する。氷上で5分間インキュベートし、細胞懸濁液を磁気セルセパレーターのプレチルドラックに収まる5ミリリットルのチューブに移します。5分間遠心分離して上清を除去した後、CD31モノクローナル抗体ビオチンとCD45モノクローナル抗体ビオチンの混合物200マイクロリットルを加えます。よく混ぜて氷上で15分間インキュベートします。次に、400マイクロリットルのPBS 2%FBSを加え、摂氏4度で5分間400 Gで再び遠心分離します。上清を吸引し、100マイクロリットルの抗ビオチンマイクロビーズ中で氷上で15分間インキュベートします。400マイクロリットルのPBS 2%FBSを加え、前述のように、摂氏4度で5分間400Gで再び遠心分離します。上清を廃棄した後、ペレットを350マイクロリットルのPBS 2%FBSに再懸濁する。70マイクロメートルの予備分離フィルターを使用して単一細胞懸濁液から細胞凝集体または大きな粒子を除去するには、100マイクロリットルのPBS 2%FBSでフィルターを活性化します。細胞懸濁液をフィルターに通し、清潔なチューブに集めます。次に、100マイクロリットルのPBS 2%FBSでフィルターを洗浄します。ネガティブ分離戦略を使用して細胞の磁気分離を実行するには、サンプルをチルドラックの位置Aに置き、2つの空のチューブを位置BとCに配置して、非標識および標識細胞を回収します。次に、洗浄バッファーとランニングバッファーを対応するボトルに入れます。分離セクションで、分離するサンプル数を選択し、枯渇プロトコルを選択します。実行を押して、分離を開始します。プログラムの最後に、ラベル付けされていないセルを回復します。次に、12ウェルプレートに2.5%基底膜マトリックスを400マイクロリットル添加して基底膜マトリックスをコーティングし、各ウェルの表面全体を覆う。余分な溶液を取り除き、プレートを層流フード内で少なくとも1時間乾燥させます。5分間遠心分離して上清を捨てた後、ペレットを500マイクロリットルの増殖培地に再懸濁する。脂肪細胞前駆細胞(APC)を、2.5%基底膜マトリックスでコーティングした12ウェルプレートの1ウェルに播種します。5%二酸化炭素雰囲気中で摂氏37度でインキュベートし、細胞が80%コンフルエントに達するまで48時間ごとに培地を交換します。培地を完全に除去した後、350マイクロリットルのPBS 2%FBSで細胞を洗浄する。350マイクロリットルの0.05%トリプシンEDTAで摂氏37度で2分間細胞を回収し、2ミリリットルの増殖培地を加えます。細胞を新しい50ミリリットルの円錐形チューブに集め、400 Gで5分間遠心分離します。APCを、予め2.5%基底膜マトリックスでコーティングした12ウェルプレートに継代し、5%二酸化炭素を用いて摂氏37度でインキュベートします。細胞が80%コンフルエントに達するまで、48時間ごとに培地を交換してください。80%コンフルエントで、任意の増殖培地を吸引し、各ウェルに3.3ナノモルの骨形成タンパク質を含む500マイクロリットルの分化培地と交換します。48時間後、培地を1ウェルあたり500マイクロリットルの分化培地と交換し、分化カクテルとする。72時間後に培地を取り出し、500マイクロリットルの新しい分化培地に100ナノモルのインスリンを加えます。48時間後、腫瘍壊死因子アルファ、またはTNFアルファのミリリットルあたり4ナノグラムでインスリン抵抗性を誘導します。分化培地を吸引し、TNFアルファを含む500マイクロリットルの単純培地2%FBSと交換します。24時間インキュベートした後、単純な培地0%FBSにTNFアルファ1ミリリットルあたり4ナノグラムを加えます。24時間後に100ナノモルのインスリンを加えてインスリンシグナル伝達経路を活性化し、前に示したように、5%二酸化炭素雰囲気で摂氏37度で15分間インキュベートします。インキュベーション後、培地を取り出し、500マイクロリットルのPBSで洗浄し、インスリン処理を行わずにコントロールウェルを含む。タンパク質を抽出し、ウェスタンブロットでインスリンシグナル伝達マーカーのリン酸化を測定します。12ウェル培養プレートにおける分化誘導前の80%コンフルエントでの皮下脂肪細胞前駆細胞、および分化誘導の7日後の初代脂肪細胞をこの図に示す。皮下初代脂肪細胞におけるTNFアルファによって誘導されるインスリン抵抗性は、インスリン受容体、インスリン受容体基質1、およびプロテインキナーゼBまたはAKTのインスリン誘導性リン酸化の減少によって実証された。メンブレンを抗リン酸化インスリン受容体、抗リン酸化インスリン受容体基質1、抗リン酸化AKT、および抗ベータチューブリンでプローブし、負荷コントロールとして使用した。シグナルは化学発光検出で可視化した。代表的なブロットと3つの独立した実験からの定量をここに示します。この手順を試みるとき、注意する必要があることの1つは、TNFアルファによるインスリン抵抗性の誘導が24時間2%FBSであり、過去24時間0%FBSであるということです。

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

初代培養およびコルチのマウス臓器のプラスミドエレクトロ。

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

生物学

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

生体イメージングおよび卵巣癌の同所性マウスモデルにおける治療的処置の

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

ラット肝細胞の単離及び初代培養

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

マウスプライマリ膵臓腺房細胞の単離と培養

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

初代腸オルガノイド培養におけるレトロウイルス感染のビデオプロトコル

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

細胞特異的にLINC複合体を破壊するマウスモデルの検証

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

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インスリン刺激に対するグルコース取り込み測定と応答<em&gt;インビトロ</em&gt;培養ヒト初代筋管

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

細胞のエストロゲン産生主ウシ顆粒の組織培養モデル

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...