Name: differentiated mouse adipocytes in primary culture: a model of insulin resistance
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance at JoVE.com

Vi takker Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla og María Antonieta Carbajo for deres tekniske assistanse, og Jessica Gonzalez Norris for kritisk redigering av manuskriptet. Denne protokollen ble støttet av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (til Y.M.).

Alle gnagereksperimenter ble godkjent av bioetikkomiteen ved Institutt for nevrobiologi ved UNAM, protokollnummer 075.
1. Isolering av forløperceller til mus
<ol><li>Avlive 8-10 uker gamle C57BL/6-hannmus (f.eks. ved CO 2-innånding og påfølgende cervikal dislokasjon) (fire dyr per isolasjon). Desinfiser musene ved å gni med 70% etanol og oppnå fettvevet umiddelbart etter ofring. MERK: Etter eutanasi av gnagere, isoler fettvevet umiddelbart og utfør alle ...

<ol>
	<li>Elmus, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signaling+and+insulin+resistance.">Insulin signaling and insulin resistance.</a> Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).</li><li>Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+stimulates+tyrosine+phosphorylation+of+the+insulin+receptor+in+a+cell-free+system.">Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system.</a> Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).</li><li>Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+stimulates+the+phosphorylation+of+the+95,000-dalton+subunit+of+its+own+receptor.">Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor.</a> Science. 215 (4529), 185-187 (1982).</li><li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Insulin Resistance. StatPearls Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/</a> (2021)</li><li>Petersen, M. C., Shulm, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+insulin+action+and+insulin+resistance.">Mechanisms of insulin action and insulin resistance.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).</li><li>Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+underlying+defect+in+insulin+action+in+type+2+diabetes.">Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).</li><li>Unamuno, X., Fr&#252;hbeck, G., Catal&#225;n, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue.">Adipose Tissue.</a> Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , 370-384 (2019).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pink+adipocytes.">Pink adipocytes.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).</li><li>Kahn, B. B., Flier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+insulin+resistance.">Obesity and insulin resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).</li><li>Klemm, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-induced+adipocyte+differentiation.">Insulin-induced adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).</li><li>Wilcox, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+and+insulin+resistance.">Insulin and insulin resistance.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).</li><li>Yohannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+insulin+resistance,+and+type+2+diabetes:+associations+and+therapeutic+implications.">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).</li><li>James, D. E., St&#246;ckli, J., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+and+molecular+landscape+of+insulin+resistance.">The etiology and molecular landscape of insulin resistance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).</li><li>Wondmkun, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+insulin+resistance,+and+type+2+diabetes:+associations+and+therapeutic+implications.">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).</li><li>Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+causes+the+insulin+resistance+underlying+obesity.">What causes the insulin resistance underlying obesity.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).</li><li>Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-J&#228;rvinen, H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+does+obesity+cause+diabetes.">Why does obesity cause diabetes.</a> Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).</li><li>Lo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+in+vitro+insulin-resistance+models+and+their+physiological+relevance+to+in+vivo+diet-induced+adipose+insulin+resistance.">Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance.</a> Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).</li><li>Asterholm, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+inflammation+is+essential+for+healthy+adipose+tissue+expansion+and+remodeling.">Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling.</a> Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).</li><li>Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+inhibits+signaling+from+the+insulin+receptor.">Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).</li><li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-&#945;+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activates+expression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes.+Nuclear+factor-&#954;B+activation+by+TNF-&#945;+is+obligatory.">Tumor necrosis factor-&#945; suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-&#954;B activation by TNF-&#945; is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li><li>Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+receptor+signaling+in+normal+and+insulin-resistant+states.">Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).</li><li>Hotamisligil, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRS-1-mediated+inhibition+of+insulin+receptor+tyrosine+kinase+activity+in+TNF-alpha-+and+obesity-induced+insulin+resistance.">IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance.</a> Science. 271 (5249), 665-668 (1996).</li><li>Copps, K. D., White, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+insulin+sensitivity+by+serine/threonine+phosphorylation+of+insulin+receptor+substrate+proteins+IRS1+and+IRS2.">Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2.</a> Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).</li><li>Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+western+blots:+pitfalls+of+densitometry.">Quantifying western blots: pitfalls of densitometry.</a> Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).</li><li>Skurk, T., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+human+adipocyte+precursor+cells:+expansion+and+differentiation.">Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).</li><li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots.">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+white+adipocyte+proliferation.">The biology of white adipocyte proliferation.</a> Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).</li><li>Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipogenesis+and+aging:+does+aging+make+fat+go+MAD.">Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD.</a> Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).</li><li>Guo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+results+in+paradoxical+susceptibility+of+fat+cell+progenitors+to+lipotoxicity.">Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).</li><li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F.Tumor+necrosis+factor-a+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activatesexpression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes:+nuclear+factor-kappaB+activation+by+TNF-a+is+obligatory.">F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li><li>Jager, J., Gre &#769;meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1b-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+throughdown-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-6+(IL-6)+induces+insulinresistance+in+3T3-L1+adipocytes+and+is,+like+IL-8+and+tumor+necrosis+factor-a,overexpressed+in+human+fat+cells+from+insulin-resistant+subjects.">Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).</li><li>Isidor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+rewires+the+metabolic+gene+program+and+glucose+utilization+in+human+white+adipocytes.">Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes.</a> International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).</li><li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance.">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li></ol>

Denne artikkelen gir en metode for å studere insulinresistens som bruker primære adipocytter i kultur behandlet med TNF-α. Denne modellen har fordelen at primære adipocytter kan dyrkes under definerte forhold i lange perioder med tett kontroll av cellulære miljøfaktorer26. Analysens varighet er 15-20 dager, selv om variasjoner i prosentandelen differensierte adipocytter kan forekomme mellom eksperimenter. Primære adipocytter har fordeler i forhold til cellelinjer siden de ikke har blitt kon...

Insulin er et anabole hormon produsert av bukspyttkjertelen holme β-celler og nøkkelen regulator av glukose og lipid metabolisme. Blant de mange funksjonene regulerer insulin glukoseopptak, glykogensyntese, glukoneogenese, proteinsyntese, lipogenese og lipolyse1. Det første molekylære signalet etter insulininteraksjon med reseptoren (IR) er aktiveringen av den inneboende tyrosinproteinkinaseaktiviteten til IR2, noe som resulterer i dens autofosforylering3 og den påfølgende aktiveringen av en familie av proteiner kjent som insulinreseptorsubstrater (IRS), som binder seg til adaptorproteiner som fører til aktivering av en kaskade av proteinkinaser4 . Insulin aktiverer to hovedsignalveier: fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K)-proteinkinase B (AKT) og Ras-mitogenaktivert proteinkinase (MAPK). Den førstnevnte utgjør et hovedgrenpunkt eller node 4,5 for aktivering av mange nedstrøms effektorer involvert i ulike fysiologiske funksjoner, inkludert regulering av drivstoffhomeostase, mens sistnevnte regulerer cellevekst og differensiering 4,6. Insulinvirkninger avhenger til slutt av celletype og fysiologisk kontekst7.
Et av de viktigste insulinresponsive metabolske vevene er fettvevet. Hvitt fettvev er den mest tallrike typen fett hos mennesker og gnagere, fordelt på subkutant fett (mellom hud og muskler) og visceralt fett (rundt organene i bukhulen). Gitt deres store volum er adipocytter eller fettceller den mest tallrike celletypen i fettvev. Disse fettcellene kan være brune/beige (termogene), rosa (i brystkjertelen) og hvite 8,9. Hvite adipocytter holder de viktigste energireserver i kroppen i form av triglyserider, en insulinavhengig prosess. Insulin fremmer glukosetransport og lipogenese, mens det hemmer lipolyse eller lipidnedbrytning 7,10. Det letter også differensieringen av preadipocytter i adipocytter - de modne fettlagrende cellene11.
Insulinresistens oppstår når et normalt insulinnivå gir en svekket biologisk respons, noe som resulterer i kompenserende hyperinsulinemi12. Insulinresistens er en tilstand assosiert med overvekt og fedme5, som når kombinert fører til type 2 diabetes (T2D) og andre metabolske sykdommer13. Hyperinsulinemi kompenserer insulinresistens i perifert vev for å opprettholde normale blodsukkernivåer14. Eventuelt tap eller utmattelse av β celler, sammen med forverret insulinresistens, fører imidlertid til forhøyede blodsukkernivåer forenlig med T2D5. Derfor kan insulinresistens og hyperinsulinemi bidra til utvikling av fedme-avledede metabolske sykdommer15. Videre kan fedme forårsake kronisk lavgradig lokal betennelse som fremmer insulinresistens i fettvev15,16,17. I tillegg fører fedme-avledede endringer i fettvev, som fibrose, betennelse og redusert angiogenese og adipogenese, til lavere adiponektin serumnivåer (en insulinsensibilisator) og økt sekresjon av faktorer som plasminogenaktivatorinhibitor 1 (PAI-1), frie fettsyrer og eksosomer i blodet, forverrer insulinresistens17.
Mange aspekter som ligger til grunn for insulinresistens forblir ukjente. In vitro og in vivo modeller er utviklet for å studere mekanismene som medierer insulinresistens i viktige målvev, inkludert fettvev. Fordelen med in vitro-modeller er at forskerne har mer kontroll over miljøforholdene og kan evaluere insulinresistens i bestemte celletyper. Spesielt har adipocyttforløperceller (APCer) den individuelle fenotypen til donorvevet, noe som kan reflektere fysiologi bedre enn adipocyttcellelinjer. En hovedfaktor som induserer insulinresistens in vitro er tumornekrosefaktor-α (TNF-α). TNF-α er et proinflammatorisk cytokin som skilles ut av adipocytter og makrofager i fettvev18. Selv om det er nødvendig for riktig remodellering og ekspansjon av fettvev19, induserer langvarig eksponering for TNF-α insulinresistens i fettvev in vivo og i adipocytter in vitro20. Kronisk TNF-α-behandling av flere celletyper fører til økt serinfosforylering av både IR og IRS-1, og fremmer dermed redusert tyrosinfosforylering21. Økt fosforylering av IRS-1 på serinrester hemmer IR-tyrosinkinaseaktiviteten og kan være en av nøkkelmekanismene som kronisk TNF-α-behandling svekker insulinvirkningen22,23. TNF-α aktiverer veier som involverer serin/treoninkinasehemmeren av nukleær faktor ĸB kinase β (IKKβ) og c-Jun N terminal kinase (JNK)24. JNK induserer et komplekst proinflammatorisk transkripsjonsprogram, men også direkte fosforylerer IRS-16.
Å forstå patogenesen av insulinresistens har blitt stadig viktigere for å veilede utviklingen av fremtidige terapier mot T2D. APCer har vist seg å være en utmerket modell for studier av fettcellebiologi, inkludert følsomhet og motstand mot insulin, og for å identifisere de inneboende egenskapene til adipocytter uavhengig av det systemiske miljøet. APCer kan enkelt fås fra forskjellige fettdepoter, og under passende forhold, differensiert til modne adipocytter. Med denne metoden kan direkte effekter på insulinresistens/sensitivitet evalueres i adipocytter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Isolation mouse adipocyte precursor cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer&#160;</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin Microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0311-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Equitech-Bio, Inc.</td>
			<td>BAC63-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12800017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS mix</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid-albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 201 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-nr-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-18</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peniciline-Streptomycine</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (70 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5020-BP-010</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1756</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>71742</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-005&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0404</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem E system</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td>Running and Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2- mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>907007</td>
			<td>Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3624-05</td>
			<td>TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77F-0379</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH&#160;</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3722-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P2O7</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>114F-0762</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein standard&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho- Insulin Receptor &#946;&#160;</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Akt (Ser473) Antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose&#160;</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>407205</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610302</td>
			<td>Running and laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td>Running, transfer and laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4103-02</td>
			<td>RIPA buffer - TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>TBS-T</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiated mouse adipocytes in primary culture: a model of insulin resistance

Insulinresistens er en redusert effekt av insulin på målcellene, vanligvis avledet fra redusert insulinreseptorsignalering. Insulinresistens bidrar til utvikling av diabetes type 2 (T2D) og andre fedmeavledede sykdommer med høy prevalens over hele verden. Derfor er forståelse av mekanismene bak insulinresistens av stor relevans. Flere modeller har blitt brukt til å studere insulinresistens både in vivo og in vitro; Primære adipocytter representerer et attraktivt alternativ for å studere mekanismene for insulinresistens og identifisere molekyler som motvirker denne tilstanden og de molekylære målene for insulinsensibiliserende legemidler. Her har vi etablert en insulinresistensmodell ved bruk av primære adipocytter i kultur behandlet med tumornekrosefaktor-α (TNF-α).
Adipocytter forløper celler (APCs), isolert fra kollagenase-fordøyd mus subkutant fettvev ved magnetisk celle separasjon teknologi, er differensiert i primære adipocytter. Insulinresistens induseres deretter ved behandling med TNF-α, et proinflammatorisk cytokin som reduserer tyrosinfosforylering/aktivering av medlemmer av insulinsignalkaskaden. Redusert fosforylering av insulinreseptor (IR), insulinreseptorsubstrat (IRS-1) og proteinkinase B (AKT) kvantifiseres av western blot. Denne metoden gir et utmerket verktøy for å studere mekanismene som medierer insulinresistens i fettvev.

I løpet av de siste årene har den økte forekomsten av fedme og T2D ført til en intens søken etter mekanismene som medierer insulinresistens i fettvev. Med protokollen beskrevet her, kan APCer differensieres til modne adipocytter for å evaluere insulinresistens og følsomhet. Når APCene når samløp, tar det 10 dager å fullføre differensieringen til modne adipocytter og deres TNF-α-medierte induksjon av insulinresistens (figur 1).
APCer viser en fibroblas...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance at JoVE.com

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

Denne protokollen beskriver isolering av preadipocytter fra mus fra subkutant fett, deres differensiering i modne adipocytter og induksjon av insulinresistens. Insulinvirkningen evalueres ved fosforylering/aktivering av medlemmer av insulinsignalveien gjennom western blot. Denne metoden tillater direkte bestemmelse av insulinresistens/følsomhet i primære adipocytter.

Differensierte museadipocytter i primærkultur: En modell av insulinresistens

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

Insulinresistens kan evalueres i primære adipocytter, slik at studiet av donorer under forskjellige fysiopatologiske sammenhenger, for eksempel magert versus overvektig, eller celler fra forskjellige fettdeponier. Primære adipocytter beholder mange av sine iboende egenskaper og kan dyrkes under definerte forhold i lang tid, med tett kontroll av cellulære miljøfaktorer. For å starte differensieringsprosessen må cellene være på 80% sammenløp.Hvis differensiering starter ved en lavere eller høyere konfluens, vil cellene differensiere mindre eller miste sin differensieringskapasitet. Etter å ha ofret dyret, desinfiser musene ved å gni med 70% etanol. Dissekere det inguinale subkutane fettvevet fra hver mus og samle det i et 15 milliliter konisk rør, som inneholder 15 ml av type en kollagenaseoppløsning på is.Klipp fettvevet i små biter med steril kirurgisk saks og fordøy prøvene ved inkubering med type en kollagenaseoppløsning ved 37 grader Celsius i en orbital shaker ved 150 RPM i 30 minutter. Sjekk fordøyelsen hvert 10. minutt for å sikre at den fungerer, og for å forhindre over fordøyelsen. Filter ved hjelp av en 200-mikrometer mesh sprøyte for å eliminere vevet ikke fordøyd med kollagenase, og før filteret over kanten av røret for å drenere så mange celler som mulig inn i løsningen.Tilsett 15 ml kald DMEM 1% BSA for å stoppe fordøyelsen, og sentrifuge ved 400 G i 10 minutter ved fire grader Celsius. Aspirer det øverste laget som inneholder modne adipocytter og det meste av væskelaget. Tilsett 20 ml kald PBS 2% FBS til den og resuspender pelleten.Etter sentrifugering igjen i fem minutter, fjern supernatanten ved å aspirere det øvre laget for å eliminere de resterende adipocytter og fett. Resuspender pelleten i en milliliter ACK-lyseringsbuffer. Inkuber på is i fem minutter.Tilsett 10 ml PBS 2% FBS og bland det. Etter sentrifugering i fem minutter og aspirasjon av supernatanten, resuspenderes pelleten i 200 mikroliter anti-FC-løsning. Inkuber på is i fem minutter og overfør cellesuspensjonen til et fem milliliter rør som passer inn i de forkjølte stativene til en magnetisk celleseparator.Etter sentrifugering i fem minutter og eliminering av supernatanten, tilsett 200 mikroliter av blandingen av CD 31 monoklonalt antistoffbiotin og CD 45 monoklonalt antistoffbiotin til det. Bland godt og inkuber på is i 15 minutter. Deretter tilsettes 400 mikroliter PBS 2% FBS og sentrifuge igjen ved 400 G i fem minutter ved fire grader Celsius.Aspirer supernatanten og inkuber den i 100 mikroliter anti-biotinmikroperler i 15 minutter på is. Tilsett 400 mikroliter PBS 2% FBS og sentrifuge igjen ved 400 G i fem minutter ved fire grader Celsius, som vist tidligere. Etter å ha kastet supernatanten, resuspender pelleten i 350 mikroliter PBS 2%FBS.For å fjerne celleaggregatene, eller store partikler, fra enkeltcelle-suspensjonene med et 70-mikrometer pre-separasjonsfilter, aktiver filteret med 100 mikroliter PBS 2% FBS. Før cellesuspensjonen gjennom filteret, og samle den i et rent rør. Vask deretter filteret med 100 mikroliter PBS 2% FBS.For å utføre magnetisk separasjon av celler ved hjelp av den negative separasjonsstrategien, plasser prøven i posisjon A på det kjølte stativet og to tomme rør i posisjon B og C for å gjenopprette de ikke-merkede og merkede cellene. Legg deretter vaskebufferen og løpebufferen i de tilsvarende flaskene. I separasjonsdelen velger du antall prøver som skal skilles, og velger deplete-protokollen.Trykk på kjør og start separasjonen. På slutten av programmet, gjenopprett de umerkede cellene. Deretter belegger du en 12-brønns plate med kjellermembranmatrise ved å legge til 400 mikroliter 2,5% membranmatrise for å dekke hele overflaten av hver brønn.Fjern overflødig oppløsning og la platen tørke inne i den laminære strømningshetten i minst en time. Etter sentrifugering i fem minutter og kassering av supernatanten, resuspenderes pelleten i 500 mikroliter vekstmedium. Frø adipocyttforløpercellene, eller APCene, i en brønn av 12-brønnsplaten som tidligere var belagt med 2,5% membranmatrise.Inkuber ved 37 grader Celsius i en 5% karbondioksidatmosfære, og bytt medium hver 48. time til cellene når 80% samløp. Etter å ha fjernet mediet helt, vask cellene med 350 mikroliter PBS 2% FBS. Høst cellene med 350 mikroliter 0,05% tripsin EDTA i to minutter ved 37 grader Celsius, og tilsett to milliliter vekstmedium.Samle cellene i et nytt 50 milliliter konisk rør og sentrifuge ved 400 G i fem minutter. Pass APCene til 12-brønnsplater, tidligere belagt med 2,5% membranmatrise, og inkuber ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid. Bytt medium hver 48. time til cellene når 80 % samløp.Ved 80% sammenløp, aspirer av et vekstmedium og erstatt det med 500 mikroliter differensieringsmedium, som inneholder 3,3 nanomolært benmorfogenetisk protein i hver brønn. Etter 48 timer, erstatt mediet med 500 mikroliter per brønndifferensieringsmedium, og differensieringscocktailen. Fjern mediet 72 timer senere og tilsett 100 nanomolar insulin i 500 mikroliter friskt differensieringsmedium.48 timer senere, indusere insulinresistens med fire nanogram per milliliter tumornekrosefaktor alfa, eller TNF alfa. Aspirer av et differensieringsmedium og erstatt det med 500 mikroliter enkelt medium 2% FBS med TNF alfa. Etter inkubering i 24 timer, tilsett fire nanogram per milliliter TNF alfa i et enkelt medium 0% FBS.Aktiver insulinsignalveien 24 timer senere ved å tilsette 100 nanomolar insulin og inkubere i 15 minutter ved 37 grader Celsius i en 5% karbondioksidatmosfære, som vist tidligere. Etter inkubering, fjern mediet og vask med 500 mikroliter PBS, inkluder en kontrollbrønn uten insulinbehandling. Ekstraher protein og mål fosforyleringen av insulinsignalmarkører med Western blot.Subkutane adipocyttforløperceller ved 80 % konfluens før indusering av differensiering i 12-brønnskulturplatene og primære adipocytter etter syv dager med induserende differensiering er vist i denne figuren. Insulinresistensen indusert av TNF alfa i subkutane primære adipocytter ble demonstrert ved redusert insulinindusert fosforylering av insulinreseptor, insulinreseptorsubstrat en og proteinkinase B eller AKT. Membranen ble undersøkt med antifosforylert insulinreseptor, antifosforylert insulinreseptorsubstrat en, antifosforylert AKT og anti-beta tubulin ble brukt som lastekontroll.Signalet ble visualisert med kjemiluminescensdeteksjon. De representative blottene og kvantifiseringen fra tre uavhengige eksperimenter er vist her. Når du prøver denne prosedyren, er en ting som må tas vare på at induksjonen av insulinresistens med TNF alfa er med 2% FBS i 24 timer og med 0% FBS de siste 24 timene.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rat Nedsatt Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolasjon og kultur av mus Primær acinøse Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

En video-protokollen av retroviral infeksjon i Primær Intestinal Organoid Kultur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolasjon og Primær Culture of Mouse endotelceller fra aorta

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validering av en musemodell for å forstyrre LINC Komplekser i en celle-spesifikk Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Glukoseopptaksmåling og respons på insulinstimulering i<em&gt; I Vitro</em&gt; Dyrket humant primært myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering og kultur av primære muskeratinocytter fra neonatal og voksen mus hud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

En vev kultur modell av Estrogen-produserende primære bovin Granulosa celler

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...