Name: differentiated mouse adipocytes in primary culture: a model of insulin resistance
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance at JoVE.com

Мы благодарим Даниэля Мондрагона, Антонио Прадо, Фернандо Лопеса-Барреру, Мартина Гарсию-Сервина, Алехандру Кастилью и Марию Антониету Карбахо за их техническую помощь, а также Джессику Гонсалес Норрис за критическое редактирование рукописи. Этот протокол был поддержан Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (Y.M.).

Все эксперименты на грызунах были одобрены Комитетом по биоэтике Института нейробиологии УНАМ, протокол No 075.
1. Выделение клеток-предшественников адипоцитов мыши
<ol><li>Усыпить 8-10-недельных самцов мышей C57BL/6 (например, путем вдыхания CO2 и последующего вывих...

<ol>
	<li>Elmus, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signaling+and+insulin+resistance.">Insulin signaling and insulin resistance.</a> Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).</li><li>Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+stimulates+tyrosine+phosphorylation+of+the+insulin+receptor+in+a+cell-free+system.">Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system.</a> Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).</li><li>Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+stimulates+the+phosphorylation+of+the+95,000-dalton+subunit+of+its+own+receptor.">Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor.</a> Science. 215 (4529), 185-187 (1982).</li><li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Insulin Resistance. StatPearls Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/</a> (2021)</li><li>Petersen, M. C., Shulm, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+insulin+action+and+insulin+resistance.">Mechanisms of insulin action and insulin resistance.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).</li><li>Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+underlying+defect+in+insulin+action+in+type+2+diabetes.">Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).</li><li>Unamuno, X., Fr&#252;hbeck, G., Catal&#225;n, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue.">Adipose Tissue.</a> Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , 370-384 (2019).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pink+adipocytes.">Pink adipocytes.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).</li><li>Kahn, B. B., Flier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+insulin+resistance.">Obesity and insulin resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).</li><li>Klemm, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-induced+adipocyte+differentiation.">Insulin-induced adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).</li><li>Wilcox, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+and+insulin+resistance.">Insulin and insulin resistance.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).</li><li>Yohannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+insulin+resistance,+and+type+2+diabetes:+associations+and+therapeutic+implications.">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).</li><li>James, D. E., St&#246;ckli, J., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+and+molecular+landscape+of+insulin+resistance.">The etiology and molecular landscape of insulin resistance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).</li><li>Wondmkun, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+insulin+resistance,+and+type+2+diabetes:+associations+and+therapeutic+implications.">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).</li><li>Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+causes+the+insulin+resistance+underlying+obesity.">What causes the insulin resistance underlying obesity.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).</li><li>Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-J&#228;rvinen, H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+does+obesity+cause+diabetes.">Why does obesity cause diabetes.</a> Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).</li><li>Lo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+in+vitro+insulin-resistance+models+and+their+physiological+relevance+to+in+vivo+diet-induced+adipose+insulin+resistance.">Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance.</a> Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).</li><li>Asterholm, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+inflammation+is+essential+for+healthy+adipose+tissue+expansion+and+remodeling.">Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling.</a> Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).</li><li>Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+inhibits+signaling+from+the+insulin+receptor.">Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).</li><li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-&#945;+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activates+expression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes.+Nuclear+factor-&#954;B+activation+by+TNF-&#945;+is+obligatory.">Tumor necrosis factor-&#945; suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-&#954;B activation by TNF-&#945; is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li><li>Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+receptor+signaling+in+normal+and+insulin-resistant+states.">Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).</li><li>Hotamisligil, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRS-1-mediated+inhibition+of+insulin+receptor+tyrosine+kinase+activity+in+TNF-alpha-+and+obesity-induced+insulin+resistance.">IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance.</a> Science. 271 (5249), 665-668 (1996).</li><li>Copps, K. D., White, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+insulin+sensitivity+by+serine/threonine+phosphorylation+of+insulin+receptor+substrate+proteins+IRS1+and+IRS2.">Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2.</a> Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).</li><li>Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+western+blots:+pitfalls+of+densitometry.">Quantifying western blots: pitfalls of densitometry.</a> Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).</li><li>Skurk, T., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+human+adipocyte+precursor+cells:+expansion+and+differentiation.">Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).</li><li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots.">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+white+adipocyte+proliferation.">The biology of white adipocyte proliferation.</a> Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).</li><li>Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipogenesis+and+aging:+does+aging+make+fat+go+MAD.">Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD.</a> Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).</li><li>Guo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+results+in+paradoxical+susceptibility+of+fat+cell+progenitors+to+lipotoxicity.">Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).</li><li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F.Tumor+necrosis+factor-a+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activatesexpression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes:+nuclear+factor-kappaB+activation+by+TNF-a+is+obligatory.">F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li><li>Jager, J., Gre &#769;meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1b-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+throughdown-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-6+(IL-6)+induces+insulinresistance+in+3T3-L1+adipocytes+and+is,+like+IL-8+and+tumor+necrosis+factor-a,overexpressed+in+human+fat+cells+from+insulin-resistant+subjects.">Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).</li><li>Isidor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+rewires+the+metabolic+gene+program+and+glucose+utilization+in+human+white+adipocytes.">Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes.</a> International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).</li><li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance.">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li></ol>

В данной работе представлен метод изучения инсулинорезистентности, использующий первичные адипоциты в культуре, обработанной ФНО-α. Преимущество этой модели заключается в том, что первичные адипоциты можно культивировать в определенных условиях в течение длительных периодов времен?...

Инсулин является анаболическим гормоном, вырабатываемым островковыми β клетками поджелудочной железы, и ключевым регулятором метаболизма глюкозы и липидов. Среди своих многочисленных функций инсулин регулирует поглощение глюкозы, синтез гликогена, глюконеогенез, синтез белка, липогенез и липолиз1. Начальным молекулярным сигналом после взаимодействия инсулина с его рецептором (IR) является активация внутренней активности тирозинпротеинкиназы IR2, что приводит к его аутофосфорилированию3 и последующей активации семейства белков, известных как субстраты рецепторов инсулина (IRS), которое связывается с адапторными белками, что приводит к активации каскада протеинкиназ4 . Инсулин активирует два основных сигнальных пути: фосфатидилинозитол-3-киназу (PI3K)-протеинкиназу B (AKT) и Ras-митоген-активируемую протеинкиназу (MAPK). Первый представляет собой основную точку ветвления или узел 4,5 для активации многочисленных нижестоящих эффекторов, участвующих в различных физиологических функциях, включая регуляцию топливного гомеостаза, тогда как второй регулирует рост и дифференцировку клеток 4,6. Действие инсулина в конечном итоге зависит от типа клеток и физиологического контекста7.
Одной из основных чувствительных к инсулину метаболических тканей является жировая ткань. Белая жировая ткань является наиболее распространенным типом жира у людей и грызунов, распределенным в подкожном жире (между кожей и мышцами) и висцеральном жире (вокруг органов в брюшной полости). Учитывая их большой объем, адипоциты или жировые клетки являются наиболее распространенным типом клеток в жировой ткани. Эти жировые клетки могут быть коричневыми/бежевыми (термогенными), розовыми (в молочной железе) и белыми 8,9. Белые адипоциты сохраняют основные запасы энергии в организме в виде триглицеридов, инсулинозависимого процесса. Инсулин способствует транспорту глюкозы и липогенезу, в то время как он ингибирует липолиз или расщепление липидов 7,10. Он также облегчает дифференцировку преадипоцитов в адипоциты — зрелые жирозапасающие клетки11.
Резистентность к инсулину возникает, когда нормальный уровень инсулина вызывает ослабленную биологическую реакцию, что приводит к компенсаторной гиперинсулинемии12. Инсулинорезистентность — это состояние, связанное с избыточным весом иожирением5, которое в сочетании приводит к диабету 2 типа (СД2) и другим метаболическим заболеваниям13. Гиперинсулинемия компенсирует резистентность к инсулину в периферических тканях для поддержания нормального уровня глюкозы в крови14. Однако возможная потеря или истощение β-клеток вместе с обострением резистентности к инсулину приводит к повышению уровня глюкозы в крови, соответствующегоСД2 5. Таким образом, инсулинорезистентность и гиперинсулинемия могут способствовать развитию метаболических заболеваний, связанных с ожирением15. Кроме того, ожирение может вызывать хроническое местное воспаление низкой степени, способствующее резистентности к инсулину в жировой ткани15,16,17. Кроме того, изменения в жировой ткани, вызванные ожирением, такие как фиброз, воспаление и снижение ангиогенеза и адипогенеза, приводят к снижению уровня адипонектина в сыворотке крови (сенсибилизатора инсулина) и повышенной секреции таких факторов, как ингибитор активатора плазминогена 1 (PAI-1), свободные жирные кислоты и экзосомы в кровоток, усугубляя резистентность к инсулину17.
Многие аспекты, лежащие в основе резистентности к инсулину, остаются неизвестными. Были разработаны модели in vitro и in vivo для изучения механизмов, опосредующих резистентность к инсулину в основных тканях-мишенях, включая жировую ткань. Преимущество моделей in vitro заключается в том, что исследователи лучше контролируют условия окружающей среды и могут оценить резистентность к инсулину в определенных типах клеток. В частности, клетки-предшественники адипоцитов (APC) имеют индивидуальный фенотип донорской ткани, который может отражать физиологию лучше, чем клеточные линии адипоцитов. Основным фактором, индуцирующим резистентность к инсулину in vitro, является фактор некроза опухоли-α (TNF-α). TNF-α представляет собой провоспалительный цитокин, секретируемый адипоцитами и макрофагами в жировой ткани18. Несмотря на то, что он необходим для правильного ремоделирования и расширения жировой ткани19, длительное воздействие ФНО-α вызывает резистентность к инсулину в жировой ткани in vivo и в адипоцитах in vitro20. Хроническое лечение TNF-α нескольких типов клеток приводит к увеличению фосфорилирования серина как IR, так и IRS-1, тем самым способствуя снижению фосфорилирования тирозина21. Повышенное фосфорилирование IRS-1 на остатках серина ингибирует активность IR-тирозинкиназы и может быть одним из ключевых механизмов, с помощью которых лечение хроническим TNF-α ухудшает действие инсулина22,23. TNF-α активирует пути с участием ингибитора серин/треонинкиназы ядерного фактора ĸB киназы β (IKKβ) и концевой киназы c-Jun N (JNK)24. JNK индуцирует сложную провоспалительную транскрипционную программу, но также непосредственно фосфорилирует IRS-16.
Понимание патогенеза резистентности к инсулину становится все более важным для разработки будущих методов лечения СД2. APC оказались отличной моделью для изучения биологии жировых клеток, включая чувствительность и резистентность к инсулину, а также для выявления внутренних свойств адипоцитов независимо от системной среды. APC могут быть легко получены из различных жировых депо и при соответствующих условиях дифференцированы в зрелые адипоциты. С помощью этого метода можно оценить прямое влияние на резистентность/чувствительность к инсулину в адипоцитах.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Isolation mouse adipocyte precursor cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer&#160;</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin Microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0311-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Equitech-Bio, Inc.</td>
			<td>BAC63-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12800017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS mix</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid-albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 201 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-nr-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-18</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peniciline-Streptomycine</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (70 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5020-BP-010</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1756</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>71742</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-005&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0404</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem E system</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td>Running and Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2- mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>907007</td>
			<td>Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3624-05</td>
			<td>TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77F-0379</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH&#160;</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3722-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P2O7</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>114F-0762</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein standard&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho- Insulin Receptor &#946;&#160;</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Akt (Ser473) Antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose&#160;</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>407205</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610302</td>
			<td>Running and laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td>Running, transfer and laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4103-02</td>
			<td>RIPA buffer - TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>TBS-T</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiated mouse adipocytes in primary culture: a model of insulin resistance

Резистентность к инсулину - это сниженное влияние инсулина на клетки-мишени, обычно возникающее из-за снижения передачи сигналов рецептора инсулина. Инсулинорезистентность способствует развитию диабета 2 типа (СД2) и других заболеваний, связанных с ожирением, которые широко распространены во всем мире. Поэтому понимание механизмов, лежащих в основе резистентности к инсулину, имеет большое значение. Несколько моделей были использованы для изучения резистентности к инсулину как in vivo, так и in vitro; Первичные адипоциты представляют собой привлекательный вариант для изучения механизмов инсулинорезистентности и идентификации молекул, которые противодействуют этому состоянию, и молекулярных мишеней инсулин-сенсибилизирующих препаратов. Здесь мы создали модель резистентности к инсулину с использованием первичных адипоцитов в культуре, обработанной фактором некроза опухоли-α (TNF-α).
Клетки-предшественники адипоцитов (APC), выделенные из подкожной жировой ткани мыши, переваренной коллагеназой, с помощью технологии магнитного разделения клеток, дифференцируются в первичные адипоциты. Резистентность к инсулину затем индуцируется лечением TNF-α, провоспалительным цитокином, который снижает фосфорилирование/активацию тирозина членов сигнального каскада инсулина. Снижение фосфорилирования рецептора инсулина (IR), субстрата рецептора инсулина (IRS-1) и протеинкиназы B (AKT) количественно определяется вестерн-блоттингом. Этот метод является отличным инструментом для изучения механизмов, опосредующих резистентность к инсулину в жировой ткани.

За последние несколько лет возросшая распространенность ожирения и СД2 вызвала интенсивный поиск механизмов, опосредующих резистентность к инсулину в жировой ткани. С помощью протокола, описанного здесь, APC могут быть дифференцированы на зрелые адипоциты для оценки резистентности и ч...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance at JoVE.com

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

Этот протокол описывает выделение преадипоцитов мыши из подкожно-жировой клетчатки, их дифференцировку в зрелые адипоциты и индукцию резистентности к инсулину. Действие инсулина оценивается по фосфорилированию/активации членов сигнального пути инсулина через вестерн-блоттинг. Этот метод позволяет напрямую определять резистентность/чувствительность к инсулину в первичных адипоцитах.

Дифференцированные адипоциты мышей в первичной культуре: модель инсулинорезистентности

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

Резистентность к инсулину может быть оценена в первичных адипоцитах, что позволяет изучать доноров в различных физиопатологических контекстах, таких как худой и тучный, или клетки из разных жировых отложений. Первичные адипоциты сохраняют многие из своих внутренних свойств и могут культивироваться в определенных условиях в течение длительного периода времени с жестким контролем клеточных факторов окружающей среды. Чтобы начать процесс дифференцировки, клетки должны быть на 80% слиянии.Если дифференцировка начинается при более низком или более высоком слиянии, клетки будут дифференцироваться меньше или потеряют свою способность к дифференцировке. После принесения в жертву животного продезинфицируйте мышей, протерев их 70%-ным этанолом. Препарируйте паховую подкожную жировую клетчатку каждой мыши и соберите ее в 15-миллилитровую коническую пробирку, содержащую 15 миллилитров раствора коллагеназы первого типа на льду.Разрежьте жировую ткань на мелкие кусочки стерильными хирургическими ножницами и переварите образцы путем инкубации с раствором коллагеназы первого типа при 37 градусах Цельсия в орбитальном шейкере при 150 об/мин в течение 30 минут. Проверяйте пищеварение каждые 10 минут, чтобы убедиться, что оно работает, и предотвратить чрезмерное пищеварение. Отфильтруйте с помощью шприца с сеткой 200 микрометров, чтобы удалить ткань, не переваренную коллагеназой, и пропустите фильтр через край трубки, чтобы слить как можно больше клеток в раствор.Добавьте 15 миллилитров холодного DMEM 1% BSA, чтобы остановить пищеварение, и центрифугу при 400 г в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Аспирируют верхний слой, содержащий зрелые адипоциты и большую часть жидкого слоя. Добавьте к нему 20 миллилитров холодного PBS 2% FBS и ресуспендируйте гранулы.После повторного центрифугирования в течение пяти минут удалите надосадочную жидкость путем аспирации верхнего слоя, чтобы удалить оставшиеся адипоциты и жир. Ресуспендируйте гранулы в одном миллилитре лизирующего буфера ACK. Инкубировать на льду в течение пяти минут.Добавьте 10 миллилитров PBS 2% FBS и перемешайте. После центрифугирования в течение пяти минут и аспирации надосадочной жидкости ресуспендируйте гранулу в 200 микролитрах раствора анти-FC. Инкубируйте на льду в течение пяти минут и перенесите суспензию ячейки в пятимиллилитровую пробирку, которая помещается в предварительно охлажденные стойки магнитного сепаратора ячеек.После центрифугирования в течение пяти минут и устранения надосадочной жидкости добавьте к ней 200 микролитров смеси биотина моноклонального антитела CD 31 и биотина моноклонального антитела CD 45. Хорошо перемешать и выдержать на льду 15 минут. Затем добавьте 400 микролитров PBS 2% FBS и снова центрифугу при 400 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.Аспирируйте надосадочную жидкость и инкубируйте ее в 100 микролитрах микрогранул антибиотина в течение 15 минут на льду. Добавьте 400 микролитров PBS 2% FBS и снова центрифугу при 400 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, как показано ранее. После удаления надосадочной жидкости ресуспендируйте гранулу в 350 микролитрах PBS 2% FBS.Чтобы удалить клеточные агрегаты или крупные частицы из одиночных клеточных суспензий с помощью 70-микрометрового фильтра предварительного разделения, активируйте фильтр 100 микролитрами PBS 2% FBS. Пропустите клеточную суспензию через фильтр и соберите ее в чистую пробирку. Затем промойте фильтр 100 микролитрами PBS 2% FBS.Чтобы выполнить магнитную сепарацию ячеек с использованием стратегии отрицательной сепарации, поместите образец в положение A охлажденной стойки и две пустые пробирки в положения B и C для извлечения немеченых и меченых клеток. Затем загрузите буфер для стирки и буфер для промывки в соответствующие бутылки. В разделе разделения выберите количество образцов, подлежащих разделению, и выберите обедненный протокол.Нажмите «Выполнить» и начните разделение. В конце программы восстановите немеченые клетки. Затем покройте 12-луночную пластину матрицей базальной мембраны, добавив 400 микролитров 2,5%-ной матрицы фундаментальной мембраны, чтобы покрыть всю поверхность каждой лунки.Удалите излишки раствора и дайте пластине высохнуть внутри вытяжного шкафа с ламинарным потоком не менее одного часа. После центрифугирования в течение пяти минут и отбрасывания надосадочной жидкости ресуспендируйте гранулу в 500 микролитрах питательной среды. Засейте клетки-предшественники адипоцитов, или APC, в одну лунку 12-луночной пластины, предварительно покрытой 2,5%-ной матрицей базальной мембраны.Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере с содержанием углекислого газа 5% и меняйте среду каждые 48 часов, пока клетки не достигнут 80% слияния. После полного удаления среды промойте ячейки 350 микролитрами PBS 2% FBS. Соберите клетки с 350 микролитрами 0,05% трипсина ЭДТА в течение двух минут при 37 градусах Цельсия и добавьте два миллилитра питательной среды.Соберите клетки в новую 50-миллилитровую коническую пробирку и центрифугу при 400 G в течение пяти минут. Проведите APC на 12-луночные пластины, предварительно покрытые 2,5%-ной матрицей базальной мембраны, и инкубируйте при 37 градусах Цельсия с 5%-ным углекислым газом. Меняйте среду каждые 48 часов, пока ячейки не достигнут 80% слияния.При 80%-ном слиянии аспирируйте любую питательную среду и замените ее 500 микролитрами дифференцировочной среды, содержащей 3,3 наномолярных костных морфогенетических белка в каждой лунке. Через 48 часов замените среду на 500 микролитров на лунку для дифференциации и коктейль дифференциации. Удалите среду через 72 часа и добавьте 100 наномоляров инсулина в 500 микролитров свежей среды для дифференцировки.Через 48 часов индуцируйте резистентность к инсулину с помощью четырех нанограммов на миллилитр фактора некроза опухоли альфа или TNF альфа. Аспирируйте любую дифференцирующую среду и замените ее 500 микролитрами простой среды 2% FBS с TNF альфа. После инкубации в течение 24 часов добавьте четыре нанограмма на миллилитр TNF альфа в простой среде 0% FBS.Активируйте сигнальный путь инсулина через 24 часа, добавив 100 наномоляров инсулина, и инкубируйте в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия в атмосфере 5% углекислого газа, как показано ранее. После инкубации удаляют среду и промывают 500 микролитрами PBS, включают контрольную лунку без обработки инсулином. Извлеките белок и измерьте фосфорилирование сигнальных маркеров инсулина вестерн-блоттингом.На этом рисунке показаны клетки-предшественники подкожных адипоцитов при 80%-ном слиянии до индуцирования дифференцировки в 12-луночных культуральных планшетах и первичные адипоциты после семи дней индуцирования дифференцировки. Инсулинорезистентность, индуцированная ФНО-альфа в подкожных первичных адипоцитах, была продемонстрирована снижением инсулин-индуцированного фосфорилирования инсулинового рецептора, инсулинового рецептора и протеинкиназы B или AKT. Мембрану зондировали антифосфорилированным инсулиновым рецептором, антифосфорилированным инсулиновым рецептором использовали субстрат один, антифосфорилированный AKT и анти-бета-тубулин использовали в качестве контроля нагрузки.Сигнал визуализировался с помощью хемилюминесцентного детектирования. Здесь показаны репрезентативные блоты и количественная оценка из трех независимых экспериментов. При попытке этой процедуры необходимо позаботиться о том, чтобы индукция резистентности к инсулину с помощью TNF альфа была с 2% FBS в течение 24 часов и с 0% FBS в течение последних 24 часов.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Первичные культуры и плазмиды электропорации мышей органа Корти.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

В естественных изображений и лечебных процедур в Ортотопическая мышиной модели рака яичников

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Выделение и культивирование Мышь первичные клетки поджелудочной Ацинарных

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

Видео Протокол ретровирусной инфекции в начальной кишечника Органоид культуры

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Валидация модели мышей, чтобы сорвать ЛИНК Комплексы в манере соты

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Измерение поглощения глюкозы и ответ на стимуляцию инсулина в<em&gt; In Vitro</em&gt; Культурные человеческие первичные миопуты

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Изоляция и культура кератиноцитов первичной мыши от кожи новорожденных и взрослых мышей

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Культура ткани модель эстроген производителей первичного говядину гранулезы ячейки

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...