Name: differentiated mouse adipocytes in primary culture: a model of insulin resistance
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance at JoVE.com

Vi tackar Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla och María Antonieta Carbajo för deras tekniska hjälp, och Jessica Gonzalez Norris för kritisk redigering av manuskriptet. Detta protokoll stöddes av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (till Y.M.).

Alla gnagarexperiment godkändes av bioetikkommittén vid UNAM: s institut för neurobiologi, protokollnummer 075.
1. Isolering av musens adipocytprekursorceller
<ol><li>Avliva 8-10 veckor gamla manliga C57BL / 6-möss (t.ex. genom CO 2-inandning och efterföljande cervikal dislokation) (fyra djur per isolering). Desinficera mössen genom att gnugga med 70% etanol och få fettvävnaden omedelbart efter avlivning. OBS: Efter avlivning av gnagare, isolera fettvä...

<ol>
	<li>Elmus, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signaling+and+insulin+resistance.">Insulin signaling and insulin resistance.</a> Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).</li><li>Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+stimulates+tyrosine+phosphorylation+of+the+insulin+receptor+in+a+cell-free+system.">Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system.</a> Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).</li><li>Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+stimulates+the+phosphorylation+of+the+95,000-dalton+subunit+of+its+own+receptor.">Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor.</a> Science. 215 (4529), 185-187 (1982).</li><li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+nodes+in+signalling+pathways:+insights+into+insulin+action.">Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).</li><li>Insulin Resistance. StatPearls Available from: <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/</a> (2021)</li><li>Petersen, M. C., Shulm, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+insulin+action+and+insulin+resistance.">Mechanisms of insulin action and insulin resistance.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).</li><li>Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+underlying+defect+in+insulin+action+in+type+2+diabetes.">Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).</li><li>Unamuno, X., Fr&#252;hbeck, G., Catal&#225;n, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+Tissue.">Adipose Tissue.</a> Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition. , 370-384 (2019).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pink+adipocytes.">Pink adipocytes.</a> Trends in Endocrinology &amp; Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).</li><li>Kahn, B. B., Flier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+and+insulin+resistance.">Obesity and insulin resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).</li><li>Klemm, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-induced+adipocyte+differentiation.">Insulin-induced adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).</li><li>Wilcox, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+and+insulin+resistance.">Insulin and insulin resistance.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).</li><li>Yohannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+insulin+resistance,+and+type+2+diabetes:+associations+and+therapeutic+implications.">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).</li><li>James, D. E., St&#246;ckli, J., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+etiology+and+molecular+landscape+of+insulin+resistance.">The etiology and molecular landscape of insulin resistance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).</li><li>Wondmkun, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity,+insulin+resistance,+and+type+2+diabetes:+associations+and+therapeutic+implications.">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).</li><li>Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+causes+the+insulin+resistance+underlying+obesity.">What causes the insulin resistance underlying obesity.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).</li><li>Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-J&#228;rvinen, H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+does+obesity+cause+diabetes.">Why does obesity cause diabetes.</a> Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).</li><li>Lo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+in+vitro+insulin-resistance+models+and+their+physiological+relevance+to+in+vivo+diet-induced+adipose+insulin+resistance.">Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance.</a> Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).</li><li>Asterholm, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+inflammation+is+essential+for+healthy+adipose+tissue+expansion+and+remodeling.">Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling.</a> Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).</li><li>Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+inhibits+signaling+from+the+insulin+receptor.">Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).</li><li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor-&#945;+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activates+expression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes.+Nuclear+factor-&#954;B+activation+by+TNF-&#945;+is+obligatory.">Tumor necrosis factor-&#945; suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-&#954;B activation by TNF-&#945; is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li><li>Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+receptor+signaling+in+normal+and+insulin-resistant+states.">Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191 (2014).</li><li>Hotamisligil, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRS-1-mediated+inhibition+of+insulin+receptor+tyrosine+kinase+activity+in+TNF-alpha-+and+obesity-induced+insulin+resistance.">IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance.</a> Science. 271 (5249), 665-668 (1996).</li><li>Copps, K. D., White, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+insulin+sensitivity+by+serine/threonine+phosphorylation+of+insulin+receptor+substrate+proteins+IRS1+and+IRS2.">Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2.</a> Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).</li><li>Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+western+blots:+pitfalls+of+densitometry.">Quantifying western blots: pitfalls of densitometry.</a> Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).</li><li>Skurk, T., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+culture+of+human+adipocyte+precursor+cells:+expansion+and+differentiation.">Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).</li><li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue.">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).</li><li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots.">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+white+adipocyte+proliferation.">The biology of white adipocyte proliferation.</a> Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).</li><li>Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipogenesis+and+aging:+does+aging+make+fat+go+MAD.">Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD.</a> Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).</li><li>Guo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+results+in+paradoxical+susceptibility+of+fat+cell+progenitors+to+lipotoxicity.">Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).</li><li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F.Tumor+necrosis+factor-a+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activatesexpression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes:+nuclear+factor-kappaB+activation+by+TNF-a+is+obligatory.">F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li><li>Jager, J., Gre &#769;meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1b-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+throughdown-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression.">Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li><li>Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-6+(IL-6)+induces+insulinresistance+in+3T3-L1+adipocytes+and+is,+like+IL-8+and+tumor+necrosis+factor-a,overexpressed+in+human+fat+cells+from+insulin-resistant+subjects.">Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).</li><li>Isidor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance+rewires+the+metabolic+gene+program+and+glucose+utilization+in+human+white+adipocytes.">Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes.</a> International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).</li><li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance.">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li></ol>

Detta dokument ger en metod för att studera insulinresistens som använder primära adipocyter i odling behandlad med TNF-α. Denna modell har fördelen att primära adipocyter kan odlas under definierade förhållanden under långa tidsperioder med en tät kontroll av cellulära miljöfaktorer26. Analystiden är 15-20 dagar, även om variationer i andelen differentierade adipocyter kan förekomma mellan experiment. Primära adipocyter har fördelar jämfört med cellinjer eftersom de inte kontin...

Insulin är ett anabolt hormon som produceras av pankreas ö-β-celler och den viktigaste regulatorn för glukos och lipidmetabolism. Bland dess många funktioner reglerar insulin glukosupptag, glykogensyntes, glukoneogenes, proteinsyntes, lipogenes och lipolys1. Den initiala molekylära signalen efter insulininteraktion med dess receptor (IR) är aktiveringen av den inneboende tyrosinkinskinasaktiviteten hos IR2, vilket resulterar i dess autofosforylering3 och efterföljande aktivering av en familj av proteiner som kallas insulinreceptorsubstrat (IRS), som binder till adaptorproteiner vilket leder till aktivering av en kaskad av proteinkinaser4 . Insulin aktiverar två huvudsakliga signalvägar: fosfatidylinositol-3-kinas (PI3K)-proteinkinas B (AKT) och Ras-mitogenaktiverat proteinkinas (MAPK). Den förstnämnda utgör en viktig grenpunkt eller nod 4,5 för aktivering av många nedströmseffektorer som är involverade i olika fysiologiska funktioner, inklusive reglering av bränslehomeostas, medan den senare reglerar celltillväxt och differentiering 4,6. Insulinåtgärder beror i slutändan på celltyp och fysiologiskt sammanhang7.
En av de viktigaste insulinresponsiva metaboliska vävnaderna är fettvävnaden. Vit fettvävnad är den vanligaste typen av fett hos människor och gnagare, fördelat inom subkutant fett (mellan hud och muskler) och visceralt fett (runt organen i bukhålan). Med tanke på deras stora volym är adipocyter eller fettceller den vanligaste celltypen i fettvävnad. Dessa fettceller kan vara bruna/beige (termogena), rosa (i bröstkörteln) och vita 8,9. Vita adipocyter håller de viktigaste energireserverna i kroppen i form av triglycerider, en insulinberoende process. Insulin främjar glukostransport och lipogenes, medan det hämmar lipolys eller lipidnedbrytning 7,10. Det underlättar också differentieringen av preadipocyter till adipocyter - de mogna fettlagrande cellerna11.
Insulinresistens uppstår när en normal insulinnivå ger ett försvagat biologiskt svar, vilket resulterar i kompensatorisk hyperinsulinemi12. Insulinresistens är ett tillstånd som är förknippat med övervikt och fetma5, som i kombination leder till typ 2-diabetes (T2D) och andra metabola sjukdomar13. Hyperinsulinemi kompenserar insulinresistens i perifera vävnader för att upprätthålla normala blodsockernivåer14. Emellertid leder eventuell β-cellförlust eller utmattning, tillsammans med förvärrad insulinresistens, till förhöjda blodsockernivåer som överensstämmer med T2D5. Därför kan insulinresistens och hyperinsulinemi bidra till utvecklingen av fetma-härledda metaboliska sjukdomar15. Dessutom kan fetma orsaka kronisk låggradig lokal inflammation som främjar insulinresistens i fettvävnad15,16,17. Dessutom leder fetma-härledda förändringar i fettvävnad, såsom fibros, inflammation och minskad angiogenes och adipogenesis, till lägre adiponektinserumnivåer (en insulinsensibiliserare) och ökad utsöndring av faktorer såsom plasminogenaktivatorhämmare 1 (PAI-1), fria fettsyror och exosomer i blodomloppet, vilket förvärrar insulinresistens17.
Många aspekter som ligger bakom insulinresistens är fortfarande okända. In vitro- och in vivo-modeller har utvecklats för att studera mekanismerna som medierar insulinresistens i större målvävnader, inklusive fettvävnad. Fördelen med in vitro-modeller är att forskare har mer kontroll över miljöförhållandena och kan utvärdera insulinresistens i specifika celltyper. Särskilt, adipocytprekursorceller (APC) har den individuella fenotypen av givarvävnaden, vilket kan återspegla fysiologi bättre än adipocytcellinjer. En huvudfaktor som inducerar insulinresistens in vitro är tumörnekrosfaktor-α (TNF-α). TNF-α är ett proinflammatoriskt cytokin som utsöndras av adipocyter och makrofager i fettvävnad18. Även om det krävs för korrekt ombyggnad och expansion av fettvävnad19, inducerar långvarig exponering för TNF-α insulinresistens i fettvävnad in vivo och i adipocyter in vitro20. Kronisk TNF-α behandling av flera celltyper leder till ökad serinfosforylering av både IR och IRS-1, vilket främjar minskad tyrosinfosforylering21. Ökad fosforylering av IRS-1 på serinrester hämmar IR-tyrosinkinasaktiviteten och kan vara en av de viktigaste mekanismerna genom vilka kronisk TNF-α behandling försämrar insulinverkan22,23. TNF-α aktiverar vägar som involverar serin/treoninkinashämmaren av kärnfaktorn ĸB-kinas β (IKKβ) och c-Jun N-terminalkinas (JNK)24. JNK inducerar ett komplext proinflammatoriskt transkriptionsprogram men fosforylerar också IRS-16 direkt.
Att förstå patogenesen av insulinresistens har blivit allt viktigare för att styra utvecklingen av framtida terapier mot T2D. APC har visat sig vara en utmärkt modell för studier av fettcellsbiologi, inklusive känslighet och resistens mot insulin, och för att identifiera de inneboende egenskaperna hos adipocyter oberoende av den systemiska miljön. APC kan lätt erhållas från olika fettdepåer och under lämpliga förhållanden differentieras till mogna adipocyter. Med denna metod kan direkta effekter på insulinresistens/känslighet utvärderas i adipocyter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Isolation mouse adipocyte precursor cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysing buffer&#160;</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Biotin Microbeads&#160;</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD31</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0311-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane matrix (matrigel)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0291</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Equitech-Bio, Inc.</td>
			<td>BAC63-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) - Biotin&#160;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0451-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type 1</td>
			<td>Worthington Biochem</td>
			<td>LS004197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>12800017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>31600-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS mix</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-ascorbic acid 2-phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linoleic acid-albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCDB 201 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-nr-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDGF-BB&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-18</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peniciline-Streptomycine</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>L0022-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-Separation Filters (70 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-095-823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32&#160;</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA&#160;</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5020-BP-010</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1756</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosiglitazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>71742</td>
			<td>Differentiation cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF&#945;</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>210-TA-005&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0404</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5134</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluorChem E system</td>
			<td>ProteinSimple</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G6279</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7126</td>
			<td>Running and Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I3021</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2- mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td>Laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>907007</td>
			<td>Transfer buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3624-05</td>
			<td>TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>77F-0379</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH&#160;</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3722-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na4P2O7</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>114F-0762</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1620112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat dry milk</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1706404</td>
			<td>Blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained protein standard&#160;</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610395</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho- Insulin Receptor &#946;&#160;</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>3024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-Akt (Ser473) Antibody</td>
			<td>Cell signaling</td>
			<td>9271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>9432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose&#160;</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>407205</td>
			<td>RIPA buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610302</td>
			<td>Running and laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>34577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5135</td>
			<td>Running, transfer and laemmli buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>4103-02</td>
			<td>RIPA buffer - TBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1379</td>
			<td>TBS-T</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiated mouse adipocytes in primary culture: a model of insulin resistance

Insulinresistens är en minskad effekt av insulin på dess målceller, vanligtvis härledd från minskad insulinreceptorsignalering. Insulinresistens bidrar till utvecklingen av typ 2-diabetes (T2D) och andra fetma-härledda sjukdomar med hög prevalens över hela världen. Därför är det av stor betydelse att förstå mekanismerna bakom insulinresistens. Flera modeller har använts för att studera insulinresistens både in vivo och in vitro; Primära adipocyter representerar ett attraktivt alternativ för att studera mekanismerna för insulinresistens och identifiera molekyler som motverkar detta tillstånd och de molekylära målen för insulinsensibiliserande läkemedel. Här har vi etablerat en insulinresistensmodell med hjälp av primära adipocyter i odling behandlade med tumörnekrosfaktor-α (TNF-α).
Adipocytprekursorceller (APC), isolerade från kollagenas-smält mus subkutan fettvävnad genom magnetisk cellseparationsteknik, differentieras till primära adipocyter. Insulinresistens induceras sedan genom behandling med TNF-α, ett proinflammatoriskt cytokin som minskar tyrosinfosforyleringen/aktiveringen av medlemmar i insulinsignalkaskaden. Minskad fosforylering av insulinreceptor (IR), insulinreceptorsubstrat (IRS-1) och proteinkinas B (AKT) kvantifieras av western blot. Denna metod ger ett utmärkt verktyg för att studera mekanismerna som förmedlar insulinresistens i fettvävnad.

Under de senaste åren har den ökade förekomsten av fetma och T2D lett till ett intensivt sökande efter mekanismerna som förmedlar insulinresistens i fettvävnad. Med protokollet som beskrivs här kan APC differentieras till mogna adipocyter för att utvärdera insulinresistens och känslighet. När APC: erna når sammanflödet tar det 10 dagar att slutföra sin differentiering i mogna adipocyter och deras TNF-α-medierade induktion av insulinresistens (figur 1).
<p class="jove_conte...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance at JoVE.com

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

Detta protokoll beskriver isoleringen av muspreadipocyter från subkutant fett, deras differentiering till mogna adipocyter och induktion av insulinresistens. Insulinverkan utvärderas genom fosforylering/aktivering av medlemmar av insulinsignalvägen genom western blot. Denna metod möjliggör direkt bestämning av insulinresistens/känslighet i primära adipocyter.

Differentierade musadipocyter i primärkultur: En modell av insulinresistens

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

Insulinresistens kan utvärderas i primära adipocyter, vilket möjliggör studier av givare under olika fysiopatologiska sammanhang, såsom mager kontra fet, eller celler från olika fettdeposer. Primära adipocyter behåller många av sina inneboende egenskaper och kan odlas under definierade förhållanden under en lång tidsperiod, med en tät kontroll av cellulära miljöfaktorer. För att starta differentieringsprocessen måste cellerna vara vid 80% sammanflöde.Om differentiering börjar vid en lägre eller högre sammanflöde kommer cellerna att differentiera mindre eller förlora sin differentieringskapacitet. Efter att ha offrat djuret, desinficera mössen genom att gnugga med 70% etanol. Dissekera den inguinala subkutana fettvävnaden från varje mus och samla den i ett 15 ml koniskt rör, innehållande 15 ml kollagenaslösning av typ ett på is.Skär fettvävnaden i små bitar med steril kirurgisk sax och smält proverna genom inkubation med kollagenaslösning av typ ett vid 37 grader Celsius i en orbitalskakare vid 150 varv / min i 30 minuter. Kontrollera matsmältningen var 10: e minut för att säkerställa att den fungerar och för att förhindra övermatsmältning. Filtrera med en 200 mikrometer nätspruta för att eliminera vävnaden som inte smälts med kollagenas och passera filtret över rörets kant för att dränera så många celler som möjligt i lösningen.Tillsätt 15 ml kall DMEM 1% BSA för att stoppa matsmältningen och centrifugera vid 400 G i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Aspirera det översta lagret som innehåller mogna adipocyter och det mesta av vätskeskiktet. Tillsätt 20 ml kall PBS 2% FBS till den och återsuspendera pelleten.Efter centrifugering igen i fem minuter, avlägsna supernatanten genom att aspirera det övre lagret för att eliminera de återstående adipocyterna och fettet. Återsuspendera pelleten i en milliliter ACK-lyseringsbuffert. Inkubera på is i fem minuter.Tillsätt 10 ml PBS 2% FBS och blanda det. Efter centrifugering i fem minuter och aspirering av supernatanten, suspendera pelleten i 200 mikroliter anti-FC-lösning. Inkubera på is i fem minuter och överför cellsuspensionen till ett fem milliliter rör som passar in i de förkylda racken på en magnetisk cellseparator.Efter centrifugering i fem minuter och eliminering av supernatanten, tillsätt 200 mikroliter av blandningen av CD 31 monoklonalt antikroppsbiotin och CD 45 monoklonalt antikroppsbiotin till det. Blanda väl och inkubera på is i 15 minuter. Tillsätt sedan 400 mikroliter PBS 2% FBS och centrifugera igen vid 400 G i fem minuter vid fyra grader Celsius.Aspirera supernatanten och inkubera den i 100 mikroliter anti-biotinmikrokulor i 15 minuter på is. Tillsätt 400 mikroliter PBS 2% FBS och centrifugera igen vid 400 G i fem minuter vid fyra grader Celsius, som visats tidigare. Efter kassering av supernatanten, suspendera pelleten igen i 350 mikroliter PBS 2% FBS.För att avlägsna cellaggregaten, eller stora partiklar, från de enskilda cellsuspensionerna med ett 70-mikrometer förseparationsfilter, aktivera filtret med 100 mikroliter PBS 2% FBS. För cellsuspensionen genom filtret och samla den i ett rent rör. Tvätta sedan filtret med 100 mikroliter PBS 2%FBS.För att utföra magnetisk separation av celler med hjälp av den negativa separationsstrategin, placera provet i position A på kylstället och två tomma rör i positionerna B och C för att återställa de icke-märkta och märkta cellerna. Ladda sedan tvättbufferten och körbufferten i motsvarande flaskor. I separationsavsnittet väljer du antalet prover som ska separeras och väljer deplete-protokollet.Tryck på kör och starta separationen. I slutet av programmet, återställ de omärkta cellerna. Belägg sedan en 12-brunnsplatta med basalmembranmatris genom att tillsätta 400 mikroliter 2,5% basalmembranmatris för att täcka hela ytan av varje brunn.Ta bort överflödig lösning och låt plattan torka inuti den laminära flödeshuven i minst en timme. Efter centrifugering i fem minuter och kassering av supernatanten, suspendera pelleten igen i 500 mikroliter tillväxtmedium. Frö adipocytprekursorcellerna, eller APC, i en brunn av 12-brunnsplattan som tidigare belagts med 2,5% basalmembranmatris.Inkubera vid 37 grader Celsius i en 5% koldioxidatmosfär och byt medium var 48: e timme tills cellerna når 80% sammanflöde. När du har tagit bort mediet helt, tvätta cellerna med 350 mikroliter PBS 2% FBS. Skörda cellerna med 350 mikroliter 0,05% tripsin EDTA i två minuter vid 37 grader Celsius och tillsätt två milliliter tillväxtmedium.Samla cellerna i ett nytt 50-ml koniskt rör och centrifugera vid 400 G i fem minuter. Passera APC: erna till 12-brunnsplattor, tidigare belagda med 2,5% basalmembranmatris och inkubera vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid. Byt medium var 48: e timme tills cellerna når 80% sammanflöde.Vid 80% sammanflöde, aspirera av vilket tillväxtmedium som helst och ersätt det med 500 mikroliter differentieringsmedium, innehållande 3,3 nanomolärt benmorfogenetiskt protein i varje brunn. Efter 48 timmar, byt ut mediet med 500 mikroliter per brunnsdifferentieringsmedium och differentieringscocktailen. Ta bort mediet 72 timmar senare och tillsätt 100 nanomolar insulin i 500 mikroliter färskt differentieringsmedium.48 timmar senare, inducera insulinresistens med fyra nanogram per milliliter tumörnekrosfaktor alfa, eller TNF alfa. Aspirera bort alla differentieringsmedier och ersätt det med 500 mikroliter enkelt medium 2% FBS med TNF alfa. Efter inkubation i 24 timmar, tillsätt fyra nanogram per milliliter TNF alfa i ett enkelt medium 0% FBS.Aktivera insulinsignalvägen 24 timmar senare genom att tillsätta 100 nanomolärt insulin och inkubera i 15 minuter vid 37 grader Celsius i en 5% koldioxidatmosfär, som visats tidigare. Efter inkubation, ta bort mediet och tvätta med 500 mikroliter PBS, inkludera en kontrollbrunn utan insulinbehandling. Extrahera protein och mät fosforyleringen av insulinsignalmarkörer med Western blot.Subkutana adipocytprekursorceller vid 80% sammanflöde före inducering av differentiering i odlingsplattorna med 12 brunnar och primära adipocyter efter sju dagars inducerande differentiering visas i denna figur. Den insulinresistens som inducerades av TNF alfa i subkutana primära adipocyter visades genom minskad insulininducerad fosforylering av insulinreceptor, insulinreceptorsubstrat ett och proteinkinas B eller AKT. Membranet undersöktes med antifosforylerad insulinreceptor, antifosforylerat insulinreceptorsubstrat ett, antifosforylerat AKT och anti-beta-tubulin användes som laddningskontroll.Signalen visualiserades med kemiluminiscensdetektering. De representativa blottorna och kvantifieringen från tre oberoende experiment visas här. När du försöker denna procedur är en sak som måste tas om hand att induktionen av insulinresistens med TNF alfa är med 2% FBS i 24 timmar och med 0% FBS under de senaste 24 timmarna.

Research

JoVE Journal

Biology

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

Primär Kultur och Plasmid elektroporation av Murine organ Corti.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging och terapeutiska behandlingar i en Orthotopic musmodell av äggstockscancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolering och odling av mus Primära bukspottkörtel Acinar

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

A Video Protocol of Retroviral Infection in Primary Intestinal Organoid Culture

En video-protokollet av retroviral infektion i Primär Intestinal organoid kultur

Lgr5-positive stem cells can be supplemented with the essential growth factors Egf, Noggin, and R-Spondin, which allows us to culture ever-expanding ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering och Primär kultur av mus aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validering av en musmodell för att Disrupt LINC Anläggningar i en cell-specifik Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Uppmätt mätning av glukos och reaktion på insulinstimulering i<em&gt; In Vitro</em&gt; Odlade humana primära myotubes

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

Isolering och kultur av primära muskeratinocyter från neonatal och vuxen mushud

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

En vävnadskultur modell av östrogen-producerande primära nötkreatur Granulosa celler

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...