RNA FISH-farvning er nyttig til visualisering, identifikation og kvantificering af mikrober, der naturligt koloniserer eller inficerer C.elegans, herunder mikrobiombakterier og intracellulære patogener. Denne teknik er enkel, hurtig og robust, så man effektivt kan plette og visualisere mikrober i sammenhæng med et helt intakt dyr. Vi kan bruge RNA FISH til at detektere og visualisere tarmmikrobiombakterier i vilde C.elegans.

Dette kan hjælpe os med at forstå sammenlignelige interaktioner i pattedyrsystemer. Efter overførsel af nematoder med den ønskede mikrobe af interesse, fra NGM-plader til mikrocentrifugerør, vaskes nematoderne ved at tilføje en milliliter 1X PBST til mikrofugerør. Drej prøverne ned i en mikrocentrifuge eller Nanofuge med den passende hastighed.

Brug en pipette til at fjerne alle undtagen 100 mikroliter af supernatanten. Gentag vask med PBST to til tre gange. For at fastgøre nematoderne med paraformaldehyd skal du starte med at tilføje 33 mikroliter 16% paraformaldehyd til mikrofugerøret indeholdende 100 mikroliter supernatant over nematodepellet for en endelig koncentration på 4% paraformaldehyd.

Inkubere prøverne indeholdende nematoderne koloniseret eller inficeret med mikroben af interesse i 30 til 45 minutter ved stuetemperatur. Paraformaldehydopløsningen udtages, og der tilsættes 0,5 ml PBST til prøverne. Drej prøverne ned i en mikrocentrifuge med den passende hastighed som nævnt i tekstmanuskriptet.

Fjern så meget af supernatanten som muligt med en pipette uden at forstyrre pelleten. Der tilsættes 0,5 milliliter PBST til prøverne i mikrofugerørene. Gentag vask med PBST to til tre gange.

Efter den sidste vask skal du dreje prøverne ned og fjerne supernatanten, så pelleten forbliver uforstyrret. Forbered derefter en milliliter hybridiseringsbuffer pr. Prøve. Tilsæt 800 mikroliter hybridiseringsbuffer til mikrofugerørene, der indeholder nematodepellet.

Pellet prøverne i mikrocentrifugen. Fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten. Forbered 100 mikroliter pr. prøve hybridiseringsbuffer med den ønskede FISH-sonde til en endelig koncentration på 5 til 10 nanogram pr. Mikroliter sonde og hvirvel til blanding.

Tilsæt 100 mikroliter hybridiseringsbuffer indeholdende FISH-sonde til hver prøve. Bland ved forsigtigt at svirpe eller vende rørene om. Inkuber prøverne natten over i et tørt bad ved 46 til 54 grader Celsius eller en termisk mixer ved 46 til 54 grader Celsius ved 1.200 rotationer pr. Minut.

Forbered tre milliliter vaskebuffer pr. Prøve. Prøverne centrifugeres med den passende hastighed. Fjern hybridiseringsbufferen ved hjælp af en pipette, mens du er forsigtig med at lade nematodepillen være uforstyrret.

Tilsæt en milliliter forberedt vaskebuffer til hver prøve. Prøverne centrifugeres med den passende hastighed. Fjern vaskebufferen ved hjælp af en pipette, mens du er forsigtig med at lade pelleten være uforstyrret.

Tilsæt en milliliter forberedt vaskebuffer til hver prøve. Inkuber prøverne i en time ved 48 til 56 grader Celsius i et tørt bad eller termisk mixer ved 48 til 56 grader Celsius ved 1.200 rotationer pr. Minut. Hvis du inkuberer i et tørt bad, skal du forsigtigt vende rørene hvert 15. til 20. minut.

Prøverne centrifugeres med den passende hastighed. Brug en pipette til at fjerne vaskebufferen, mens du er forsigtig med at lade pelleten være uforstyrret. Der tilsættes 100 til 500 mikroliter PBST til hver af prøverne.

På dette tidspunkt kan prøverne opbevares i PBST ved fire grader Celsius i op til en uge, indtil protokollen er klar til at blive videreført. Pellet prøverne med den passende hastighed. Fjern så meget PBST som muligt uden at forstyrre nematodepillen.

Tilsæt 20 mikroliter anti-fade monteringsmedium med DAPI til prøverne. Læg en 20 mikroliter pipetter med en 200 mikroliter pipettespids, og brug en saks til at skære spidsen af pipetten af, så større nematoder kan pipetteres. Med den afskårne pipettespids overføres 5 til 10 mikroliter af pelleten til et mikroskopglas.

Dæk med en 22 x 22 coverslip. For at opbevare lysbillederne skal du forsegle kanterne på dækslikket med neglelak og opbevare dem i en mørk kasse ved fire grader Celsius, indtil de er klar til videre brug. Under differentialinterferenskontrastmikroskopet viste det sig, at en vild Caenorhabditis tropicalis-stamme blev koloniseret med en bakterie, der ser ud til at klæbe retningsbestemt til tarmepitelet.

Fluorescerende signal fra den grønne universelle 16S rRNA-sonde og den røde Alphaproteobacteria-artssonde overlapper fuldstændigt, hvilket tyder på, at de fleste bakterier, der koloniserer tarmene, er den klæbende Alphaproteobacteria-bakterie. Orsay-virusets todelte RNA-genom består af RNA1- og RNA2-segmenter, og FISH-sonder rettet mod begge segmenter er blevet udviklet. ZIP1-protein mærket med grønt fluorescerende protein ses lokaliseret i tarmkernerne i celler, der viser positiv Orsay-virus FISH-farvning i cytoplasmaet.

Flere dyr farvet med Orsay-specifik eller N.parisii-specifik FISK er vist at indikere styrken af dette signal for nem kvantificering. Co-infektion af C.elegans med to microsporidia parasitter ved hjælp af artsspecifikke sonder, der konkurrerer om binding til 18S, brugen af DAPI til at plette kerner giver mulighed for bedre lokalisering af infektionen i sammenhæng med hele dyret, især for tarmen, der har store, let identificerbare kerner. Infektioner med N.parisii resulterer i udvikling af meronts til sporer.

Den resulterende FISH-farvning demonstrerer små og store stangformede strukturer, der sandsynligvis svarer til N.parisii-sporer, som er farvet med N.parisii-specifikke sonder i rødt. Når du vælger fikseringsmidlet, skal du huske, at PFA-fiksering giver mulighed for bedre bevarelse af morfologi og transgen GFP, men acetonefiksering er nødvendig for visualisering af sporoplasmer. RNA FISH kan bruges til at identificere og visualisere bakterier, der koloniserer C.elegans tarme.

Forskere kan derefter udføre flere genetiske skærme for at identificere faktorer involveret i disse værtsmikrobeinteraktioner.

Summary

Explore More Videos

Immunologi og infektion

udgave 185