La coloration ARN FISH est utile pour la visualisation, l’identification et la quantification des microbes qui colonisent ou infectent naturellement C. elegans, y compris les bactéries du microbiome et les agents pathogènes intracellulaires. Cette technique est simple, rapide et robuste, permettant de colorer et de visualiser efficacement les microbes dans le contexte d’un animal intact. Nous pouvons utiliser ARN FISH pour détecter et visualiser les bactéries du microbiome intestinal chez les C. elegans sauvages.

Cela peut nous aider à comprendre des interactions comparables dans les systèmes de mammifères. Après avoir transféré les nématodes avec le microbe d’intérêt désiré, des plaques NGM aux tubes de microcentrifugation, laver les nématodes en ajoutant un millilitre de PBST 1X dans les tubes de microfuge. Faites tourner les échantillons dans une microcentrifugeuse ou une nanofuge à la vitesse appropriée.

À l’aide d’une pipette, retirez tous les microlitres sauf 100 microlitres du surnageant. Répétez le lavage avec PBST deux à trois fois. Pour fixer les nématodes avec du paraformaldéhyde, commencez par ajouter 33 microlitres de paraformaldéhyde à 16% dans le tube de microfuge contenant 100 microlitres de surnageant au-dessus de la pastille de nématode pour une concentration finale de 4% de paraformaldéhyde.

Incuber les échantillons contenant les nématodes colonisés ou infectés par le microbe d’intérêt pendant 30 à 45 minutes à température ambiante. Retirer la solution de paraformaldéhyde et ajouter 0,5 millilitre de PBST aux échantillons. Faites tourner les échantillons dans une microcentrifugeuse à la vitesse appropriée mentionnée dans le manuscrit du texte.

À l’aide d’une pipette, retirer autant de surnageant que possible sans déranger la pastille. Ajouter 0,5 millilitre de PBST aux échantillons dans les tubes à microfuge. Répétez le lavage avec PBST deux à trois fois.

Après le dernier lavage, faites tourner les échantillons vers le bas et retirez le surnageant, en laissant la pastille intacte. Ensuite, préparez un millilitre de tampon d’hybridation par échantillon. Ajouter 800 microlitres de tampon d’hybridation aux tubes de microfuge contenant la pastille de nématode.

Ensemencer les échantillons dans la microcentrifugeuse. Retirer le surnageant sans déranger la pastille. Préparer 100 microlitres par échantillon de tampon d’hybridation avec la sonde FISH souhaitée jusqu’à une concentration finale de 5 à 10 nanogrammes par microlitres sonde et vortex à mélanger.

Ajouter 100 microlitres de tampon d’hybridation contenant la sonde FISH à chaque échantillon. Mélanger en effleurant ou en retournant doucement les tubes. Incuber les échantillons pendant la nuit dans un bain sec à 46 à 54 degrés Celsius ou un mélangeur thermique à 46 à 54 degrés Celsius à 1 200 rotations par minute.

Préparez trois millilitres de tampon de lavage par échantillon. Centrifuger les échantillons à la vitesse appropriée. Retirez le tampon d’hybridation à l’aide d’une pipette tout en prenant soin de ne pas déranger la pastille de nématode.

Ajouter un millilitre de tampon de lavage préparé à chaque échantillon. Centrifuger les échantillons à la vitesse appropriée. Retirez le tampon de lavage à l’aide d’une pipette, tout en prenant soin de ne pas déranger la pastille.

Ajouter un millilitre de tampon de lavage préparé à chaque échantillon. Incuber les échantillons pendant une heure à 48 à 56 degrés Celsius dans un bain sec ou un mélangeur thermique à 48 à 56 degrés Celsius à 1 200 rotations par minute. En cas d’incubation dans un bain sec, retourner doucement les tubes toutes les 15 à 20 minutes.

Centrifuger les échantillons à la vitesse appropriée. À l’aide d’une pipette, retirez le tampon de lavage tout en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Ajouter 100 à 500 microlitres de PBST à chacun des échantillons.

À ce stade, les échantillons peuvent être stockés dans PBST à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine jusqu’à ce que le protocole soit prêt à être poursuivi. Ensemencer les échantillons à la vitesse appropriée. Retirez autant de PBST que possible sans déranger la pastille de nématode.

Ajouter 20 microlitres de support de montage anti-décoloration avec DAPI aux échantillons. Chargez une pipette de 20 microlitres avec une pointe de pipette de 200 microlitres et utilisez des ciseaux pour couper l’extrémité de la pipette afin de permettre aux plus gros nématodes d’être pipetés. Avec l’embout de la pipette coupée, transférer 5 à 10 microlitres de la pastille sur une lame de microscope.

Couvrir avec un bordereau de couverture de 22 par 22. Pour ranger les lames, scellez les bords de la lamelle de couverture avec du vernis à ongles et conservez-les dans une boîte sombre à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être utilisées ultérieurement. Sous le microscope à contraste interférentiel différentiel, une souche sauvage de Caenorhabditis tropicalis a été colonisée par une bactérie qui semble adhérer directionnellement à l’épithélium intestinal.

Le signal fluorescent de la sonde verte universelle d’ARNr 16S et de la sonde rouge des espèces d’alphaprotéobactéries se chevauche complètement, ce qui suggère que la plupart des bactéries colonisant les intestins sont la bactérie Alphaproteobacteria adhérente. Le génome bipartite de l’ARN du virus d’Orsay est constitué de segments ARN1 et ARN2 et des sondes FISH ciblant les deux segments ont été développées. La protéine ZIP1 marquée avec une protéine fluorescente verte est localisée dans les noyaux intestinaux des cellules qui montrent une coloration FISH positive du virus d’Orsay dans le cytoplasme.

Plusieurs animaux colorés avec des FISH spécifiques à Orsay ou à N.parisii indiquent la force de ce signal pour faciliter la quantification. Co-infection de C. elegans par deux parasites microsporidies à l’aide de sondes spécifiques à l’espèce qui rivalisent pour se lier au 18S, l’utilisation de DAPI pour colorer les noyaux permet une meilleure localisation de l’infection dans le contexte de l’animal entier, en particulier pour l’intestin qui a de gros noyaux facilement identifiables. Les infections à N. parisii entraînent le développement de mérons en spores.

La coloration FISH qui en résulte montre de petites et de grandes structures en forme de bâtonnets qui correspondent probablement aux spores de N. parisii, qui sont colorées avec des sondes spécifiques à N. parisii en rouge. Lors de la sélection de l’agent fixateur, rappelez-vous que la fixation du PFA permet une meilleure préservation de la morphologie et de la GFP transgénique, mais la fixation de l’acétone est nécessaire pour la visualisation des sporoplasmes. ARN FISH peut être utilisé pour identifier et visualiser les bactéries colonisant les intestins de C. elegans.

Les chercheurs peuvent ensuite effectuer davantage de criblages génétiques pour identifier les facteurs impliqués dans ces interactions hôte-microbe.

Summary

Explore More Videos

Immunologie et infection

num ro 185