Ibridazione in situ con fluorescenza dell'RNA (FISH) per visualizzare la colonizzazione microbica e l'infezione nell'intestino di Caenorhabditis elegans

La colorazione di RNA FISH è utile per la visualizzazione, l'identificazione e la quantificazione dei microbi che colonizzano o infettano naturalmente C.elegans, compresi i batteri del microbioma e i patogeni intracellulari. Questa tecnica è semplice, rapida e robusta, consentendo di colorare e visualizzare efficacemente i microbi nel contesto di un intero animale intatto. Possiamo usare RNA FISH per rilevare e visualizzare i batteri del microbioma intestinale nei C.elegans selvatici.

Questo può aiutarci a capire interazioni comparabili nei sistemi dei mammiferi. Dopo aver trasferito i nematodi con il microbo desiderato di interesse, dalle piastre NGM alle provette per microcentrifuga, lavare i nematodi aggiungendo un millilitro di 1X PBST ai tubi di microfuge. Far girare i campioni in una microcentrifuga o Nanofuge alla velocità appropriata.

Utilizzando una pipetta, rimuovere tutti tranne 100 microlitri di surnatante. Ripetere il lavaggio con PBST due o tre volte. Per fissare i nematodi con paraformaldeide, iniziare aggiungendo 33 microlitri di paraformaldeide al 16% al tubo di microfuge contenente 100 microlitri di surnatante sopra il pellet di nematode per una concentrazione finale del 4% paraformaldeide.

Incubare i campioni contenenti i nematodi colonizzati o infettati dal microbo di interesse per 30-45 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di paraformaldeide e aggiungere 0,5 millilitri di PBST ai campioni. Far girare i campioni in una microcentrifuga alla velocità appropriata come indicato nel manoscritto testuale.

Con una pipetta, rimuovere il più possibile il surnatante senza disturbare il pellet. Aggiungere 0,5 millilitri di PBST ai campioni nei tubi di microfuge. Ripetere il lavaggio con PBST due o tre volte.

Dopo l'ultimo lavaggio, girare i campioni e rimuovere il surnatante, lasciando il pellet indisturbato. Quindi, preparare un millilitro di tampone di ibridazione per campione. Aggiungere 800 microlitri di tampone di ibridazione ai tubi di microfuge contenenti il pellet di nematode.

Pellet i campioni nella microcentrifuga. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Preparare 100 microlitri per campione di tampone di ibridazione con la sonda FISH desiderata a una concentrazione finale da 5 a 10 nanogrammi per sonda da microlitri e vortice da miscelare.

Aggiungere 100 microlitri di tampone di ibridazione contenente sonda FISH a ciascun campione. Mescolare muovendo delicatamente o capovolgendo i tubi. Incubare i campioni durante la notte in un bagno asciutto a 46-54 gradi Celsius o in un miscelatore termico a 46-54 gradi Celsius a 1.200 rotazioni al minuto.

Preparare tre millilitri di tampone di lavaggio per campione. Centrifugare i campioni alla velocità appropriata. Rimuovere il tampone di ibridazione utilizzando una pipetta facendo attenzione a lasciare indisturbato il pellet di nematode.

Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio preparato a ciascun campione. Centrifugare i campioni alla velocità appropriata. Rimuovere il tampone di lavaggio con una pipetta, facendo attenzione a lasciare il pellet indisturbato.

Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio preparato a ciascun campione. Incubare i campioni per un'ora a 48-56 gradi Celsius in un bagno asciutto o miscelatore termico a 48-56 gradi Celsius a 1.200 rotazioni al minuto. Se si incuba in un bagno asciutto, capovolgere delicatamente i tubi ogni 15-20 minuti.

Centrifugare i campioni alla velocità appropriata. Utilizzando una pipetta, rimuovere il tampone di lavaggio, facendo attenzione a lasciare il pellet indisturbato. Aggiungere da 100 a 500 microlitri di PBST a ciascuno dei campioni.

A questo punto, i campioni possono essere conservati in PBST a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana fino a quando il protocollo è pronto per essere continuato. Pellet i campioni alla velocità appropriata. Rimuovere quanto più PBST possibile senza disturbare il pellet di nematode.

Aggiungere 20 microlitri di mezzo di montaggio anti-sbiadimento con DAPI ai campioni. Caricare un pipetter da 20 microlitri con una punta per pipetta da 200 microlitri e utilizzare le forbici per tagliare la punta della pipetta per consentire la pipetta dei nematodi più grandi. Con la punta della pipetta tagliata, trasferire da 5 a 10 microlitri di pellet su un vetrino da microscopio.

Coprire con un coprislip 22 per 22. Per conservare i vetrini, sigillare i bordi della copertina con lo smalto per unghie e tenerli in una scatola scura a quattro gradi Celsius fino al momento di un ulteriore utilizzo. Sotto il microscopio a contrasto a interferenza differenziale, un ceppo selvatico di Caenorhabditis tropicalis è stato trovato colonizzato con un batterio che sembra aderire direzionalmente all'epitelio intestinale.

Il segnale fluorescente della sonda universale 16S verde rRNA e della sonda rossa delle specie Alphaproteobacteria si sovrappone completamente, suggerendo che la maggior parte dei batteri che colonizzano l'intestino sono il batterio Alphaproteobacteria aderente. Il genoma bipartito dell'RNA del virus Orsay è costituito da segmenti di RNA1 e RNA2 e sono state sviluppate sonde FISH mirate a entrambi i segmenti. La proteina ZIP1 marcata con la proteina fluorescente verde è vista localizzata nei nuclei intestinali delle cellule che mostrano una colorazione positiva del virus Orsay FISH nel citoplasma.

È stato dimostrato che più animali colorati con FISH specifici di Orsay o N.parisii indicano la forza di questo segnale per una facile quantificazione. Co-infezione di C.elegans con due parassiti microsporidi utilizzando sonde specie-specifiche che competono per il legame con il 18S, l'uso di DAPI per colorare i nuclei consente una migliore localizzazione dell'infezione nel contesto dell'intero animale, specialmente per l'intestino che ha nuclei grandi e facilmente identificabili. Le infezioni da N.parisii provocano lo sviluppo di meronti in spore.

La colorazione FISH risultante mostra piccole e grandi strutture a forma di bastoncino che probabilmente corrispondono alle spore di N.parisii, che sono colorate con sonde specifiche di N.parisii in rosso. Quando si seleziona l'agente fissativo, ricordare che la fissazione PFA consente una migliore conservazione della morfologia e della GFP transgenica, ma la fissazione dell'acetone è necessaria per la visualizzazione degli sporoplasmi. RNA FISH può essere utilizzato per identificare e visualizzare i batteri che colonizzano l'intestino di C.elegans.

I ricercatori possono quindi eseguire più screening genetici per identificare i fattori coinvolti in queste interazioni ospite-microbo.