Hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) para visualizar colonização microbiana e infecção em intestinos de Caenorhabditis elegans

A coloração de RNA FISH é útil para a visualização, identificação e quantificação de micróbios que colonizam ou infectam naturalmente C.elegans, incluindo bactérias do microbioma e patógenos intracelulares. Esta técnica é simples, rápida e robusta, permitindo que se manche e visualize micróbios de forma eficaz no contexto de um animal inteiro intacto. Podemos usar o RNA FISH para detectar e visualizar bactérias do microbioma intestinal em C.elegans selvagens.

Isso pode nos ajudar a entender interações comparáveis em sistemas de mamíferos. Após a transferência de nematoides com o micróbio de interesse desejado, de placas de NGM para tubos de microcentrífuga, lave os nematoides adicionando um mililitro de PBST 1X aos tubos de microfuga. Gire as amostras em uma microcentrífuga ou nanofuga na velocidade apropriada.

Usando uma pipeta, remova todos, exceto 100 microlitros do sobrenadante. Repita a lavagem com PBST duas a três vezes. Para fixar os nematoides com paraformaldeído, comece adicionando 33 microlitros de paraformaldeído a 16% ao tubo de microfuga contendo 100 microlitros de sobrenadante acima do pellet de nematoide para uma concentração final de 4% de paraformaldeído.

Incubar as amostras contendo os nematoides colonizados ou infectados com o micróbio de interesse por 30 a 45 minutos à temperatura ambiente. Retirar a solução de paraformaldeído e adicionar 0,5 mililitros de PBST às amostras. Gire as amostras em uma microcentrífuga na velocidade apropriada, conforme mencionado no manuscrito do texto.

Com uma pipeta, remova o máximo possível do sobrenadante sem perturbar o pellet. Adicionar 0,5 mililitro de PBST às amostras nos tubos de microfuga. Repita a lavagem com PBST duas a três vezes.

Após a última lavagem, gire as amostras para baixo e remova o sobrenadante, deixando o pellet intacto. Em seguida, prepare um mililitro de tampão de hibridização por amostra. Adicione 800 microlitros de tampão de hibridização aos tubos de microfuga contendo o pellet de nematoide.

Pellet as amostras na microcentrífuga. Remova o sobrenadante sem perturbar o pellet. Prepare 100 microlitros por amostra de tampão de hibridização com a sonda FISH desejada até uma concentração final de 5 a 10 nanogramas por sonda de microlitros e vórtice para misturar.

Adicione 100 microlitros de tampão de hibridização contendo sonda FISH a cada amostra. Misture agitando ou invertendo suavemente os tubos. Incubar as amostras durante a noite em banho seco a 46 a 54 graus Celsius ou um misturador térmico a 46 a 54 graus Celsius a 1.200 rotações por minuto.

Prepare três mililitros de tampão de lavagem por amostra. Centrifugar as amostras à velocidade adequada. Remova o tampão de hibridização usando uma pipeta, tendo o cuidado de deixar o pellet de nematoide intacto.

Adicionar um mililitro de tampão de lavagem preparado a cada amostra. Centrifugar as amostras à velocidade adequada. Remova o tampão de lavagem usando uma pipeta, tendo o cuidado de deixar o pellet intacto.

Adicionar um mililitro de tampão de lavagem preparado a cada amostra. Incubar as amostras durante uma hora a 48 a 56 graus Celsius em banho seco ou misturador térmico a 48 a 56 graus Celsius a 1 200 rotações por minuto. Se incubar em um banho seco, inverta suavemente os tubos a cada 15 a 20 minutos.

Centrifugar as amostras à velocidade adequada. Usando uma pipeta, remova o tampão de lavagem, tendo o cuidado de deixar o pellet intacto. Adicione 100 a 500 microlitros de PBST a cada uma das amostras.

Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas em PBST a quatro graus Celsius por até uma semana até que o protocolo esteja pronto para ser continuado. Pellet as amostras na velocidade adequada. Remova o máximo de PBST possível sem perturbar o pellet de nematoides.

Adicione 20 microlitros de meio de montagem antidesbotamento com DAPI às amostras. Carregue um pipetter de 20 microlitros com uma ponta de pipeta de 200 microlitros e use uma tesoura para cortar a ponta da pipeta para permitir que nematoides maiores sejam pipetados. Com a ponta da pipeta cortada, transfira de 5 a 10 microlitros do pellet para uma lâmina de microscópio.

Cubra com uma folha de cobertura de 22 por 22. Para armazenar as lâminas, sele as bordas da tampa com esmalte e mantenha-as em uma caixa escura a quatro graus Celsius até que estejam prontas para uso posterior. Sob o microscópio de contraste de interferência diferencial, descobriu-se que uma cepa selvagem de Caenorhabditis tropicalis foi colonizada com uma bactéria que parece aderir direcionalmente ao epitélio intestinal.

O sinal fluorescente da sonda verde universal 16S rRNA e da sonda vermelha de espécies de alfaproteobactérias se sobrepõem completamente, sugerindo que a maioria das bactérias que colonizam os intestinos é a bactéria Alphaproteobacteria aderente. O genoma de RNA bipartido do vírus Orsay consiste em segmentos de RNA1 e RNA2 e sondas FISH visando ambos os segmentos foram desenvolvidas. A proteína ZIP1 marcada com proteína verde fluorescente é vista localizada nos núcleos intestinais das células que mostram coloração positiva do FISH do vírus Orsay no citoplasma.

Múltiplos animais corados com FISH específico de Orsay ou N.parisii são mostrados para indicar a força deste sinal para facilitar a quantificação. Co-infecção de C.elegans com dois parasitas microsporidia usando sondas específicas de espécies que competem pela ligação ao 18S, o uso de DAPI para corar núcleos permite uma melhor localização da infecção no contexto de todo o animal, especialmente para o intestino que possui núcleos grandes e facilmente identificáveis. Infecções por N.parisii resultam no desenvolvimento de merontes em esporos.

A coloração FISH resultante demonstra estruturas pequenas e grandes em forma de haste que provavelmente correspondem aos esporos de N.parisii, que são corados com sondas específicas de N.parisii em vermelho. Ao selecionar o agente fixador, lembre-se de que a fixação de PFA permite uma melhor preservação da morfologia e da GFP transgênica, mas a fixação de acetona é necessária para a visualização de esporoplasmas. O RNA FISH pode ser usado para identificar e visualizar bactérias colonizando os intestinos de C.elegans.

Os pesquisadores podem então realizar mais telas genéticas para identificar fatores envolvidos nessas interações hospedeiro-micróbio.