RNA-fluorescens in situ Hybridisering (FISH) för att visualisera mikrobiell kolonisering och infektion i Caenorhabditis elegans tarmar

RNA FISH-färgning är användbar för visualisering, identifiering och kvantifiering av mikrober som naturligt koloniserar eller infekterar C.elegans, inklusive mikrobiombakterier och intracellulära patogener. Denna teknik är enkel, snabb och robust, vilket gör att man effektivt kan fläcka och visualisera mikrober i samband med ett helt intakt djur. Vi kan använda RNA FISH för att upptäcka och visualisera tarmmikrobiombakterier i vilda C.elegans.

Detta kan hjälpa oss att förstå jämförbara interaktioner i däggdjurssystem. Efter överföring av nematoder med önskad mikrobe av intresse, från NGM-plattor till mikrocentrifugrör, tvätta nematoderna genom att tillsätta en milliliter 1X PBST till mikrofugerör. Snurra ner proverna i en mikrocentrifug eller nanofuge med lämplig hastighet.

Ta bort alla utom 100 mikroliter av supernatanten med en pipett. Upprepa tvätten med PBST två till tre gånger. För att fixera nematoderna med paraformaldehyd, börja med att tillsätta 33 mikroliter 16% paraformaldehyd till mikrofugeröret som innehåller 100 mikroliter supernatant ovanför nematodpelleten för en slutlig koncentration av 4% paraformaldehyd.

Inkubera proverna som innehåller de nematoder som koloniserats eller infekterats med mikroben av intresse i 30 till 45 minuter vid rumstemperatur. Ta bort paraformaldehydlösningen och tillsätt 0,5 ml PBST till proverna. Snurra ner proverna i en mikrocentrifug med lämplig hastighet som nämns i textmanuskriptet.

Ta bort så mycket av supernatanten som möjligt med en pipett utan att störa pelleten. Tillsätt 0,5 ml PBST till proverna i mikrofugerören. Upprepa tvätten med PBST två till tre gånger.

Efter den sista tvätten, snurra ner proverna och ta bort supernatanten och lämna pelleten ostörd. Förbered sedan en milliliter hybridiseringsbuffert per prov. Tillsätt 800 mikroliter hybridiseringsbuffert till mikrofugerören som innehåller nematodpelleten.

Pellet proverna i mikrocentrifugen. Ta bort supernatanten utan att störa pelleten. Förbered 100 mikroliter per prov av hybridiseringsbuffert med önskad FISH-sond till en slutlig koncentration av 5 till 10 nanogram per mikroliter sond och virvel att blanda.

Tillsätt 100 mikroliter hybridiseringsbuffert som innehåller FISH-sond till varje prov. Blanda genom att försiktigt snärta eller invertera rören. Inkubera proverna över natten i ett torrt bad vid 46 till 54 grader Celsius eller en termisk mixer vid 46 till 54 grader Celsius vid 1 200 rotationer per minut.

Förbered tre ml tvättbuffert per prov. Centrifugera proverna med lämplig hastighet. Ta bort hybridiseringsbufferten med en pipett medan du är noga med att lämna nematodpelleten ostörd.

Tillsätt en milliliter beredd tvättbuffert till varje prov. Centrifugera proverna med lämplig hastighet. Ta bort tvättbufferten med en pipett, samtidigt som du är noga med att lämna pelleten ostörd.

Tillsätt en milliliter beredd tvättbuffert till varje prov. Inkubera proverna i en timme vid 48 till 56 grader Celsius i ett torrt bad eller termisk mixer vid 48 till 56 grader Celsius vid 1 200 varv per minut. Om du inkuberar i ett torrt bad, vänd försiktigt rören var 15: e till 20: e minut.

Centrifugera proverna med lämplig hastighet. Ta bort tvättbufferten med en pipett samtidigt som du är noga med att lämna pelleten ostörd. Tillsätt 100 till 500 mikroliter PBST till vart och ett av proverna.

Vid denna tidpunkt kan proverna lagras i PBST vid fyra grader Celsius i upp till en vecka tills protokollet är redo att fortsätta. Pelletera proverna med lämplig hastighet. Ta bort så mycket PBST som möjligt utan att störa nematodpelleten.

Tillsätt 20 mikroliter anti-fade monteringsmedium med DAPI till proverna. Ladda en pipetter på 20 mikroliter med en pipettspets på 200 mikroliter och använd sax för att klippa av pipettens spets så att större nematoder kan pipetteras. Med den skurna pipettspetsen överför du 5 till 10 mikroliter av pelleten till ett mikroskopglas.

Täck med en 22 x 22 täckglas. För att förvara bilderna, försegla kanterna på täckglaset med nagellack och förvara dem i en mörk låda vid fyra grader Celsius tills de är redo för vidare användning. Under differentialinterferenskontrastmikroskopet visade sig en vild Caenorhabditis tropicalis-stam koloniseras med en bakterie som verkar rikta sig mot tarmepitelet.

Fluorescerande signal från den gröna universella 16S rRNA-sonden och den röda Alphaproteobacteria-artsonden överlappar helt, vilket tyder på att de flesta bakterier som koloniserar tarmarna är den vidhäftande Alphaproteobacteria-bakterien. Orsayvirusets bipartita RNA-genom består av RNA1- och RNA2-segment och FISH-sonder riktade mot båda segmenten har utvecklats. ZIP1-protein märkt med grönt fluorescerande protein ses lokaliserat i tarmkärnorna i celler som visar positivt Orsay-virus FISH-färgning i cytoplasman.

Flera djur färgade med Orsay-specifik eller N.parisii-specifik FISH har visat sig indikera styrkan hos denna signal för enkel kvantifiering. Saminfektion av C.elegans med två mikrosporidiparasiter med hjälp av artspecifika sonder som konkurrerar om bindning till 18S, användningen av DAPI för att fläcka kärnor möjliggör bättre lokalisering av infektionen i samband med hela djuret, särskilt för tarmen som har stora, lätt identifierbara kärnor. Infektioner med N.parisii resulterar i utveckling av meronter till sporer.

Den resulterande FISH-färgningen visar små och stora stavformade strukturer som sannolikt motsvarar N.parisii-sporer, som är färgade med N.parisii-specifika sonder i rött. När du väljer fixeringsmedlet, kom ihåg att PFA-fixering möjliggör bättre bevarande av morfologi och transgen GFP, men acetonfixering är nödvändig för visualisering av sporoplasmer. RNA FISH kan användas för att identifiera och visualisera bakterier som koloniserar C.elegans tarmar.

Forskare kan sedan utföra fler genetiska skärmar för att identifiera faktorer som är involverade i dessa värd-mikrobinteraktioner.